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随着腹腔镜技术在普外科、妇科、泌尿外科等领域的广泛应用,在一些外科疾病如胆囊结石,阑尾炎,子宫肌瘤的治疗上,腹腔镜手术正在逐渐取代传统开腹手术。较传统手术而言,腹腔镜手术具有较高诊断准确率和治疗能力[1],且具有手术出血量少、肠蠕动恢复早、术后疼痛轻、术后恢复快、下床活动时间早、住院时间短、手术口美观、术后并发症降低等优势[1-2]。然而,无论是传统手术和腹腔镜手术,术后感染依然是影响患者预后的重要并发症。对于腹腔镜手术如何直接改变腹腔微生物群落种类及数量,目前还没有相关报道。
通过DNA测序对微生物种群进行鉴定(菌种鉴定)是比传统生化鉴定更为先进、更为准确的鉴定方法。16S rDNA是编码原核生物(主要为细菌)核糖体小亚基rRNA(16S rDNA)的DNA序列,长度约为1540~bp,存在于所有细菌染色体基因组中。16S rDNA分子大小适中,突变率小,目前是细菌系统分类学研究中最常用的基准序列。16S rDNA测序不依赖菌种本身的性质,使得它对所有菌种均可使用。通过对16S rDNA的测序,可以快速、直观地明确细菌群落多样性的变化。
本研究通过制作新西兰兔腹腔镜探查术模型,对术后动物腹腔积液进行细菌16S rDNA测序,对比分析腹腔积液中的微生物多态性,探索腹腔镜术后的微生物变化情况,可为腹腔镜手术的术后感染提供有效防治依据。
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以最小二乘法对样本做判别分析(PLS-DA),寻找物种丰度矩阵和样品分布/分组信息的最大协方差,在门水平和种水平上,模型组样本与对照组样本组内聚合良好、组间区分明显(图1A、图1B)。结果显示为两组样本细菌的种类均一度良好。对两组样本数据做Venn图分析,显示两者共有的OTU数目为957,模型组OTU数目为2206,对照组OTU数目为592。模型组腹水OTU含量高于对照组,表明模型组细菌种类较对照组明显升高(图1C)。
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对样本数据进行α多样性分析,菌落丰富度Sobs及Ace值越高提示微生物群落丰度越高,结果显示模型组比对照组微生物群落丰度更高(图2A、图2B)。在微生物群落多样性分析中,Shannon指数提示,数值越高多样性越大;Simpson指数提示,数据越小多样性越大。得出模型组在微生物群落丰度和多样性方面均高于对照组(图2C、图2D)。从Alpha多样性指数表中可得出同样的结论(表1)。
表 1 Alpha多样性指数表
组别 Sobs指数 Ace指数 Shannon指数 Simpson指数 对照组C1 701 712.782842 5.213487 0.016805 对照组C2 535 555.895755 2.418362 0.263764 对照组C3 894 912.018376 4.549837 0.054558 模型组M1 1885 1899.991681 6.43408 0.005768 模型组M2 882 892.237411 5.444351 0.018387 模型组M3 1284 1301.268936 6.109346 0.005465 通过对样本的OTU分类学分析,对样本测序结果中的菌种、菌属等进行聚类,通过对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,在丰度-均匀度曲线中,水平方向是物种丰度,曲线在横轴上的宽度越大,提示丰度越高。曲线的形状反映了物种的均匀度,曲线越平缓,物种越丰富。模型组相对于对照组曲线宽度更宽,更平缓。提示模型组细菌种类数量以及含量高于对照组(图2E)。
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对样本数据进行微生物组成成分分析,在对照组中其他菌群数量占整体菌群数量的35.08%(图3A),而模型组其他菌群数量占整体菌群数量的65.04%(图3B),说明经过腹腔镜手术后,不明原因的其他菌群数量升高。模型组较对照组菌群占比升高的菌群有出血败血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌等。由此得出结论:腹腔镜手术后杂菌的数量显著增加,且以出血败血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、 正皮氏罗尔斯顿菌等升高为主。
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微生物组在目、科、属、种水平上进行物种差异性分析。在目水平上,得出以下微生物群落升高:巴斯德菌目、马赛菌目、沙壤土杆菌目、莫拉菌目、奈瑟菌目、山羊海藻百伯史坦菌目、冢村氏菌目; 在科水平上,发现以下微生物群落升高:巴斯德菌科、奈瑟菌科、紫杉霉菌科、热苜蓿菌科、冢村氏菌科、膜杆菌科、虎蛆科、Akk菌科 、韦荣氏球菌科;在属水平上,发现以下微生物群落升高:巴斯德菌属、马赛菌属、莫拉菌属、奈瑟菌属、山羊海藻百伯史坦菌属、冢村氏菌属;在种水平上,发现以下微生物群落升高: 巴斯德菌、类芽孢杆菌、奈瑟菌、拉姆利杆菌、马赛菌、赤藓科菌、冢村氏菌、马赛菌、链球菌属。通过分析,发现在目、科、属、种上模型组均有增长且增长较为明显的菌种为巴斯德菌(图4A~图4D)。
Study on polymorphism of peritoneal microbial community after laparoscopic exploration in New Zealand rabbits based on 16S rDNA sequencing
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摘要:
目的 利用细菌16S核糖体DNA(16S rDNA)测序技术,研究使用便携式腹腔镜进行腹腔探查术后腹腔中微生物群落多态性的变化情况。 方法 将新西兰兔分为模型组及对照组。模型组兔使用便携式腹腔镜进行探查手术,对照组兔不做任何处理。一周后,取模型组和对照组的腹腔积液,进行16S rDNA测序,分析微生物群落多态性,探究腹腔积液的微生物群落变化情况。 结果 针对测序结果,采用生物信息学和组间差异分析,发现两组的微生物群落相似度良好。OTU分类学分析及物种组成成分分析(丰度-均匀度曲线和Venn图)发现,模型组相对于对照组,在微生物群落水平上有显著升高。α多样性分析(Sobs、Ace、Shannon、Simpson)显示,模型组在微生物群落丰富度和多样性方面均高于对照组。微生物组成成份分析显示,模型组较对照组杂菌数量占比增加约30%。对两组样本物种差异进行显著性检验,发现巴斯德菌、奈瑟菌、冢村菌的比例有显著升高。 结论 新西兰兔在腹腔镜行腹腔探查术后,腹腔积液中微生物群落数量上升,且以 巴斯德菌、奈瑟菌、冢村菌升高最为明显。 -
关键词:
- 16S rDNA测序 /
- 腹腔镜探查术 /
- 微生物群落多态性
Abstract:Objective To explore the polymorphism of microbial community after laparoscopic abdominal exploration by using bacterial 16s ribosomal DNA (16S rDNA) sequencing technology. Methods New Zealand rabbits were divided into model group and control group. The rabbits in the model group were operated by portable laparoscopy, and the rabbits in the control group were not treated. One week later, the peritoneal effusions of the model group and the control group were taken for 16S rDNA sequencing to analyze the microbial community polymorphism. To explore the changes of microbial community in peritoneal effusion in the model group compared with the control group. Results After 16S rDNA sequencing, bioinformatics was used to determine the microbial communities. Inter group difference analysis showed a good similarity of microbial communities between the two groups. OTU taxonomic analysis and species composition analysis (Rank-Abundance curve and Venn diagram) found that the microbial community level of the model group was significantly higher than that of the control group. Alpha diversity analysis (Sobs, Ace, Shannon, Simpson) showed that the richness and diversity of microbial community in the model group were higher than those in the control group. Microbial composition analysis showed that the number of miscellaneous bacteria in the model group increased by about 30% compared with the control group. The species differences between the two groups were tested for significance. It was found that Pasteurellales, Neisseria and Tsukamurella increased significantly. Conclusion The diversity of microbial communities in peritoneal effusion increases after laparoscopic abdominal exploration in New Zealand rabbits, and the most significant increases are Pasteurella, Neisseria and Tsukamura. -
Key words:
- 16S rDNA sequencing /
- laparoscope /
- microbial community polymorphism
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表 1 Alpha多样性指数表
组别 Sobs指数 Ace指数 Shannon指数 Simpson指数 对照组C1 701 712.782842 5.213487 0.016805 对照组C2 535 555.895755 2.418362 0.263764 对照组C3 894 912.018376 4.549837 0.054558 模型组M1 1885 1899.991681 6.43408 0.005768 模型组M2 882 892.237411 5.444351 0.018387 模型组M3 1284 1301.268936 6.109346 0.005465 -
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