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随着腹腔镜技术在普外科、妇科、泌尿外科等领域的广泛应用，在一些外科疾病如胆囊结石，阑尾炎，子宫肌瘤的治疗上，腹腔镜手术正在逐渐取代传统开腹手术。较传统手术而言，腹腔镜手术具有较高诊断准确率和治疗能力[1]，且具有手术出血量少、肠蠕动恢复早、术后疼痛轻、术后恢复快、下床活动时间早、住院时间短、手术口美观、术后并发症降低等优势[1-2]。然而，无论是传统手术和腹腔镜手术，术后感染依然是影响患者预后的重要并发症。对于腹腔镜手术如何直接改变腹腔微生物群落种类及数量，目前还没有相关报道。
通过DNA测序对微生物种群进行鉴定（菌种鉴定）是比传统生化鉴定更为先进、更为准确的鉴定方法。16S rDNA是编码原核生物（主要为细菌）核糖体小亚基rRNA（16S rDNA）的DNA序列，长度约为1540~bp，存在于所有细菌染色体基因组中。16S rDNA分子大小适中，突变率小，目前是细菌系统分类学研究中最常用的基准序列。16S rDNA测序不依赖菌种本身的性质，使得它对所有菌种均可使用。通过对16S rDNA的测序，可以快速、直观地明确细菌群落多样性的变化。
本研究通过制作新西兰兔腹腔镜探查术模型，对术后动物腹腔积液进行细菌16S rDNA测序，对比分析腹腔积液中的微生物多态性，探索腹腔镜术后的微生物变化情况，可为腹腔镜手术的术后感染提供有效防治依据。
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雄性2月龄新西兰兔6只（上海甲干生物科技有限公司），体重约为2 kg，分别设置模型组（n = 3）和对照组（n = 3）。
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ABI GeneAmp® 9700 型PCR仪；NanoDrop2000型分光光度计；CQZ2000720型便携一体式电子腹腔镜，腹腔镜镜头型号为J1000B型、J1030B型（上海卓外医疗电子科技有限公司）；手提式高压蒸汽灭菌器DSX-24L-I（上海申安医疗器械厂）。
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2%戊巴比妥钠溶液（0.4 g戊巴比妥钠粉末溶于20 ml 0.9%氯化钠注射液）；碘伏溶液；液氮；0.9%氯化钠注射液；手术器械（打孔器、手术刀、组织剪、血管钳、镊子、布巾钳、圆针三角针、手术单）。
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随机将6只新西兰兔分成两组，分别设置模型组（n = 3）和对照组（n = 3），模型组麻醉后给予腹腔镜探查术，术后关闭腹腔；对照组麻醉后开腹，然后关闭腹腔。
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对模型组新西兰兔称重，耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠（剂量1 ml/kg），麻醉成功后（呼吸平稳，角膜反射消失，身体肌肉松软），脱毛备皮，固定，生理盐水清洗皮肤，碘伏溶液消毒皮肤3次（范围为伤口周围15 cm）。铺手术巾，铺巾钳固定。沿腹正中线上切开皮肤，向下分离肌肉筋膜，切开腹膜，腹腔镜打孔器深入腹腔，插入腹腔镜套筒。将腹腔镜沿腹膜伸进去，到达肝脏表面，探查肝脏及胆囊约2 min。取出腹腔镜及套筒，消毒手术区域，关闭腹腔，缝合手术切口，敷料固定。对对照组进行相同操作，但不进行腹腔镜探查术。待新西兰兔麻醉苏醒后，送回动物饲养中心饲养。
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腹腔镜术后模型制备一周后，动物取材。新西兰兔称重，备皮，分别对模型组动物和对照组动物固定、消毒、铺巾，沿腹正中线行5 cm切口，打开腹膜腔，用无菌注射器深入到腹腔后部最低处，吸取约1.5 ml腹腔液体，放入相应编号的EP管中（并备份），液氮冷藏，随后进行16S rDNA测序。
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根据 E.Z.N.A.® soil DNA kit （美国Omega Bio-tek公司）进行腹腔液体微生物群落的DNA抽提，使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对 16S rDNA基因V3-V4 可变区进行 PCR 扩增。在Miseq PE300/NovaSeq PE250平台（美国Illumina公司）进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。使用Fastp软件对原始测序序列进行质控，使用Flash软件进行拼接后，在美吉生物的I-Sanger平台上进行生物信息学分析。
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以最小二乘法对样本做判别分析（PLS-DA），寻找物种丰度矩阵和样品分布/分组信息的最大协方差，在门水平和种水平上，模型组样本与对照组样本组内聚合良好、组间区分明显（图1A、图1B）。结果显示为两组样本细菌的种类均一度良好。对两组样本数据做Venn图分析，显示两者共有的OTU数目为957，模型组OTU数目为2206，对照组OTU数目为592。模型组腹水OTU含量高于对照组，表明模型组细菌种类较对照组明显升高（图1C）。
图 1 模型组与对照组样本聚合度与OTU含量
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对样本数据进行α多样性分析，菌落丰富度Sobs及Ace值越高提示微生物群落丰度越高，结果显示模型组比对照组微生物群落丰度更高（图2A、图2B）。在微生物群落多样性分析中，Shannon指数提示，数值越高多样性越大；Simpson指数提示，数据越小多样性越大。得出模型组在微生物群落丰度和多样性方面均高于对照组（图2C、图2D）。从Alpha多样性指数表中可得出同样的结论（表1）。
图 2 两组样本微生物种类及数量变化情况
表 1 Alpha多样性指数表
组别 Sobs指数 Ace指数 Shannon指数 Simpson指数 对照组C1 701 712.782842 5.213487 0.016805 对照组C2 535 555.895755 2.418362 0.263764 对照组C3 894 912.018376 4.549837 0.054558 模型组M1 1885 1899.991681 6.43408 0.005768 模型组M2 882 892.237411 5.444351 0.018387 模型组M3 1284 1301.268936 6.109346 0.005465 通过对样本的OTU分类学分析，对样本测序结果中的菌种、菌属等进行聚类，通过对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，在丰度-均匀度曲线中，水平方向是物种丰度，曲线在横轴上的宽度越大，提示丰度越高。曲线的形状反映了物种的均匀度，曲线越平缓，物种越丰富。模型组相对于对照组曲线宽度更宽，更平缓。提示模型组细菌种类数量以及含量高于对照组（图2E）。
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对样本数据进行微生物组成成分分析，在对照组中其他菌群数量占整体菌群数量的35.08%（图3A），而模型组其他菌群数量占整体菌群数量的65.04%（图3B），说明经过腹腔镜手术后，不明原因的其他菌群数量升高。模型组较对照组菌群占比升高的菌群有出血败血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌等。由此得出结论：腹腔镜手术后杂菌的数量显著增加，且以出血败血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、 正皮氏罗尔斯顿菌等升高为主。
图 3 微生物菌群组成成分比较
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微生物组在目、科、属、种水平上进行物种差异性分析。在目水平上，得出以下微生物群落升高：巴斯德菌目、马赛菌目、沙壤土杆菌目、莫拉菌目、奈瑟菌目、山羊海藻百伯史坦菌目、冢村氏菌目； 在科水平上，发现以下微生物群落升高：巴斯德菌科、奈瑟菌科、紫杉霉菌科、热苜蓿菌科、冢村氏菌科、膜杆菌科、虎蛆科、Akk菌科 、韦荣氏球菌科；在属水平上，发现以下微生物群落升高：巴斯德菌属、马赛菌属、莫拉菌属、奈瑟菌属、山羊海藻百伯史坦菌属、冢村氏菌属；在种水平上，发现以下微生物群落升高： 巴斯德菌、类芽孢杆菌、奈瑟菌、拉姆利杆菌、马赛菌、赤藓科菌、冢村氏菌、马赛菌、链球菌属。通过分析，发现在目、科、属、种上模型组均有增长且增长较为明显的菌种为巴斯德菌（图4A～图4D)。
图 4 模型组高于对照组微生物群落的情况
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随着腹腔镜手术大量应用于临床，相比于传统手术而言，术后感染虽有所下降[3]，但由于植入材料的应用，腹腔术后感染发生率依然很高。有研究表明，在腹腔镜术后患者的术后感染中革兰阴性菌占半数以上，以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、嗜血菌属为主；革兰阳性菌以溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌为主；真菌以念球菌属、光滑假丝酵母菌、白假丝酵母菌为主[3-5]。在这些术后感染的病人中，感染的部位主要集中在肺部、腹部和尿道[5]，从而引起相应术后并发症。
本研究通过对新西兰兔进行腹腔镜探查手术，发现模型组与对照组在样本菌群的聚合度良好，并且在模型组中，菌群的多样性和丰度比对照组高。在进行两组样本微生物群落对比分析中发现，在属水平上模型组的其他菌群占比由35%上升至65%。表明菌群群落数量在腹腔镜手术术后显著升高，且以草酸杆菌科、有益杆菌、巴斯德菌、瘤胃球菌、黄杆菌升高为主，其中巴斯德菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌、黄杆菌导致人感染疾病。研究发现，巴斯德菌是一种来源于动物的革兰阴性球菌，可引起蜂窝织炎、腹膜炎、菌血症、心内膜炎、脑膜炎和化脓性关节炎等疾病[6]，严重者病死率可达到31%[7]。瘤胃球菌是一种革兰阳性厌氧菌，是人类正常肠道菌群的一员[8]，可以导致炎症性肠病[9]。正皮氏罗尔斯顿菌是革兰阴性杆菌，容易侵袭免疫功能低下的患者，可导致严重的菌血症和肾盂肾炎[10]。有研究表明，在195名呼吸功能衰竭患者中有黄杆菌定植，但均未出现相应的并发症。微生物菌群物种差异性分析发现，在科、目、种、属水平上，模型组较对照组在巴斯德菌、奈瑟菌、冢村氏菌、热苜蓿菌、叶绿体、噬纤维菌等均有不同程度上升，而其中巴斯德菌、奈瑟菌、冢村氏菌可导致人类发病。据相关研究显示。冢村氏菌是一种革兰阳性、专性需氧、弱抗酸细菌，可导致人体肺部感染[11]。奈瑟菌可导致人体感染尿道炎、脑膜炎[12]。
本研究发现巴斯德菌、瘤胃球菌、正皮氏罗尔斯顿菌、黄杆菌、奈瑟菌、冢村氏菌在模型组呈现显著上升趋势，这些菌种可引起腹腔、尿道、肺部感染，出现严重的腹膜炎、肠梗阻，尿道炎以及脑膜炎，甚至导致病人死亡，对腹腔镜腹腔感染控制有一定的指导意义。由于本次为动物实验，可能存在手术室条件有限，手术者操作不规范等将细菌带入腹腔情况，能否在临床病人身上得出同样的结论，还需要做进一步的研究。
Study on polymorphism of peritoneal microbial community after laparoscopic exploration in New Zealand rabbits based on 16S rDNA sequencing
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摘要:
目的 利用细菌16S核糖体DNA（16S rDNA）测序技术，研究使用便携式腹腔镜进行腹腔探查术后腹腔中微生物群落多态性的变化情况。 方法 将新西兰兔分为模型组及对照组。模型组兔使用便携式腹腔镜进行探查手术，对照组兔不做任何处理。一周后，取模型组和对照组的腹腔积液，进行16S rDNA测序，分析微生物群落多态性，探究腹腔积液的微生物群落变化情况。 结果 针对测序结果，采用生物信息学和组间差异分析，发现两组的微生物群落相似度良好。OTU分类学分析及物种组成成分分析（丰度-均匀度曲线和Venn图）发现，模型组相对于对照组，在微生物群落水平上有显著升高。α多样性分析（Sobs、Ace、Shannon、Simpson）显示，模型组在微生物群落丰富度和多样性方面均高于对照组。微生物组成成份分析显示，模型组较对照组杂菌数量占比增加约30%。对两组样本物种差异进行显著性检验，发现巴斯德菌、奈瑟菌、冢村菌的比例有显著升高。 结论 新西兰兔在腹腔镜行腹腔探查术后，腹腔积液中微生物群落数量上升，且以 巴斯德菌、奈瑟菌、冢村菌升高最为明显。 -
关键词:
- 16S rDNA测序 /
- 腹腔镜探查术 /
- 微生物群落多态性
Abstract:Objective To explore the polymorphism of microbial community after laparoscopic abdominal exploration by using bacterial 16s ribosomal DNA (16S rDNA) sequencing technology. Methods New Zealand rabbits were divided into model group and control group. The rabbits in the model group were operated by portable laparoscopy, and the rabbits in the control group were not treated. One week later, the peritoneal effusions of the model group and the control group were taken for 16S rDNA sequencing to analyze the microbial community polymorphism. To explore the changes of microbial community in peritoneal effusion in the model group compared with the control group. Results After 16S rDNA sequencing, bioinformatics was used to determine the microbial communities. Inter group difference analysis showed a good similarity of microbial communities between the two groups. OTU taxonomic analysis and species composition analysis (Rank-Abundance curve and Venn diagram) found that the microbial community level of the model group was significantly higher than that of the control group. Alpha diversity analysis (Sobs, Ace, Shannon, Simpson) showed that the richness and diversity of microbial community in the model group were higher than those in the control group. Microbial composition analysis showed that the number of miscellaneous bacteria in the model group increased by about 30% compared with the control group. The species differences between the two groups were tested for significance. It was found that Pasteurellales, Neisseria and Tsukamurella increased significantly. Conclusion The diversity of microbial communities in peritoneal effusion increases after laparoscopic abdominal exploration in New Zealand rabbits, and the most significant increases are Pasteurella, Neisseria and Tsukamura. -
Key words:
- 16S rDNA sequencing /
- laparoscope /
- microbial community polymorphism
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膜联蛋白A3 （ANXA3），又名脂皮质素Ⅲ，胎盘抗凝蛋白Ⅲ，属于膜联蛋白家族的成员。研究发现，ANXA3可以将肌醇1，2-环磷酸盐水解为肌醇1-磷酸，也可以抑制磷脂酶A2（PLA2）的活性。截至目前，关于ANXA3基因和蛋白的结构、功能及相关疾病已有许多文献报道，本文主要就这些研究进展进行综述，为ANXA3进一步深入研究提供参考。
1. ANXA3基因及蛋白
人ANXA3基因（ENSG00000138772）位于第4号染色体上，基因全长
58678 bp；小鼠ANXA3基因（ENSMUSG00000029484）位于第5号染色体上，基因全长52584 bp；大鼠ANXA3基因（ENSRNOG00000002045）位于第14号染色体上，基因全长54010 bp。其中人和小鼠的ANXA3基因都具有14个外显子，而大鼠的ANXA3基因具有16个外显子。ANXA3蛋白具有36 kDa 和33 kDa 两种亚型，分别由323个氨基酸和284个氨基酸构成。ANXA3与膜联蛋白家族的其他成员，尤其是 ANXA5，具有很高程度的结构同源性，但其N端序列较ANXA5长。ANXA3的C末端核心由4个保守的膜联蛋白重复结构域（Ⅰ-Ⅳ）构成，每个结构域包含了由70个氨基酸残基组成的5个α-螺旋（A-E）。ANXA3的N末端高度可变，由20个氨基酸残基组成，该结构域对于ANXA3蛋白质稳定性以及ANXA3与细胞内钙离子和磷脂的相互作用至关重要，其中5位色氨酸参与了ANXA3对膜通透性的调节。
通过查阅NCBI-Gene数据库（包含了95位个体的27种不同组织的RNA测序数据），结果发现ANXA3在人体骨髓和肺中的表达水平最高，其次是胎盘、前列腺和甲状腺等。而小鼠ENCODE转录组数据库显示，ANXA3在膀胱、肺和胎盘中表达较多。也有文献报道，ANXA3几乎在所有髓系细胞中均表达。此外，大量研究报道ANXA3与癌症的发生发展联系密切，其在多种肿瘤细胞或组织中表达，包括乳腺癌[1]、肝癌[2]、结肠癌[3]、胰腺癌[4]和骨癌[5]等。
2. ANXA3蛋白的功能
膜联蛋白家族成员的功能主要包括离子通道活性调节、膜-细胞骨架锚定、膜运输以及抗炎和抗凝血活性等。作为膜联蛋白家族的一员，ANXA3蛋白的功能主要有：①ANXA3与胞吐过程有关。②ANXA3具有血管生成活性。在人脐静脉内皮细胞中过表达ANXA3，可以激活缺氧诱导因子-1（HIF-1），增加血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进人脐静脉内皮细胞迁移和管状形成。③ 多项研究发现，ANXA3能够介导白细胞迁移和炎症反应，在氧化应激、免疫炎症反应中扮演重要的角色[6]。④ ANXA3可能具有抑制PLA2活性的作用，但该研究结果目前仍存在争议[7]。⑤ANXA3在脂肪细胞的成熟中发挥重要作用。ANXA3在脂肪前体细胞中表达较高，ANXA3下调可以通过过氧化物酶体增殖物激活受体 γ2 （PPARγ2）促使脂肪前体细胞分化为含脂滴的脂肪细胞。体内实验也证实，ANXA3与仓鼠肝脏组织中的脂肪含量正相关[8]。
3. ANXA3与肿瘤
目前，关于ANXA3的研究多数集中在肿瘤领域。研究报道，ANXA3与乳腺癌、肝癌、肺癌和结肠癌的关系密切，其作用机制涉及肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移以及肿瘤血管生成等。
3.1 ANXA3可以促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡
Zhou等[9-10]对来自158名乳腺癌患者的样本分析发现，ANXA3 mRNA和蛋白的表达水平与乳腺癌细胞的增殖速度正相关。Kim等[11]对来自30名原发性乳腺癌患者的癌症组织以及MDA-MB 231细胞系进行研究，结果发现ANXA3低表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和集落形成。机制研究发现，ANXA3沉默可以下调多种细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），诱导细胞周期停滞，抑制癌细胞增殖[11]。在肝癌中，ANXA3能够激活JNK信号通路，促进肝癌细胞增殖。Pan等[12]研究证实，ANXA3过表达会增强肝癌细胞增殖和集落形成能力，而沉默ANXA3则明显抑制这些功能。Tong等[2]研究了6种细胞系和肝细胞癌（HCC）肿瘤组织，结果发现在耐药的肝癌细胞中过表达ANXA3可以抑制依赖PKCδ/p38途径的细胞凋亡。在肺癌中，Wang等[13]研究证实，肿瘤微环境中癌症相关成纤维细胞（CAF）分泌的高水平ANXA3能够激活JNK/Survivin信号通路，促进肺癌细胞逃逸顺铂诱导的细胞凋亡。而沉默ANXA3会通过抑制p38及JNK信号传导，促进癌细胞凋亡[14]。在结肠癌中，Du等[15]研究发现，ANXA3在低氧诱导条件下呈HIF-1α依赖性表达，促进结肠癌细胞的生长。研究发现ANXA3下调会明显抑制结肠癌细胞的增殖并促进结肠癌细胞凋亡，该作用可能与p53和Bcl-2的表达有关[3]。此外，有研究发现ANXA3能够促进食管癌细胞增殖，其作用机制与NF-κB途径相关[16]。
3.2 ANXA3可以促进肿瘤的侵袭和转移
ANXA3过表达会明显诱导乳腺癌、胃癌、胰腺癌和结直肠癌细胞的侵袭和迁移，其分子机制与增强上皮向间充质的转化（EMT）有关。研究发现靶向降解ANXA3或shRNA沉默ANXA3可以抑制Wnt/β-catenin信号通路，降低三阴性乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力[17-18]。Wang等[19]研究发现，胃癌细胞ANXA3过表达后，间充质标志物Vimentin和β-catenin的表达增加，上皮标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）的表达降低，EMT相关的转录因子上调；而ANXA3沉默则与之相反，进而明显抑制胃癌细胞的侵袭和迁移。在胰腺癌中，ANXA3沉默会降低N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平，增加E-cadherin表达，其作用机制是通过PI3K/Akt信号通路抑制EMT和胰腺癌细胞的侵袭及迁移[4]。此外，在结直肠癌中，下调ANXA3会降低HCT116和SW480细胞的侵袭及迁移，该作用可能与ERK和JNK信号通路的抑制有关[20]。此外，ANXA3还可以促进黑色素瘤细胞的生长和迁移，该作用与HIF-1α/VEGF信号通路有关[21]。这些研究表明，Wnt、MAPK、PI3K/Akt及HIF-1α/VEGF等信号传导途径与ANXA3诱导的细胞侵袭和迁移联系密切。
3.3 ANXA3可以诱导肿瘤血管生成
血管生成是肿瘤获取营养物质和应对肿瘤微环境缺氧状态的重要手段。研究发现，ANXA3沉默后，接受三阴性乳腺癌细胞异种移植的小鼠肿瘤中血管数量明显减少。在胰腺癌中，Wan等[4]研究证实，ANXA3沉默会抑制PI3K/Akt信号通路，降低血管内皮生长因子C（VEGF-C）、血管内皮生长因子D（VEGF-D）和血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）的表达水平，而VEGFR-3的表达可能与胰腺癌中的淋巴管生成有关。Guo等[22]研究发现33 kDa ANXA3低表达能够抑制PI3K/Akt-HIF信号通路进而降低HepG2细胞的血管生成能力。在结肠癌中，Du等[15]研究发现ANXA3能够通过血管生成促进肿瘤的生长，该作用可能与ANXA3呈HIF-1α依赖性表达有关。罗文等[23]发现，在结直肠癌患者的外周血中ANXA3和HIF-1α表达异常，二者与结直肠癌铂类耐药联系密切。总之，ANXA3促进肿瘤血管生成的机制可能涉及以下3个方面：①ANXA3可以诱导VEGFR-3的表达[4]；②ANXA3可以激活PI3K/Akt通路，从而促进血管的生成[4，24]；③ANXA3表达与HIF-1α相关[15]。
3.4 其他
ANXA3在癌症治疗中具有潜在临床应用价值。例如，Li等[25]通过对379例卵巢癌患者的临床数据和基因表达谱分析发现， ANXA3过表达可以促进滤泡辅助性T细胞（TFH）和Th 17淋巴细胞的浸润，诱导更强的T细胞抗肿瘤细胞免疫。Pan等[26]的研究发现，ANXA3过表达能够升高HIF-1α水平，显著增加CD133、Notch1、Notch2的表达，上升CD133+细胞的比例并且增加其致瘤性，提示ANXA3可能通过HIF-1α/Notch信号通路调节肝癌肿瘤干细胞/肿瘤初始细胞（CSCs/CIC）的活性。Zhu等[27]研究证实ANXA3能够通过诱导肝癌细胞趋化因子的释放增加浸润性中性粒细胞/淋巴细胞的比率，从而介导肝细胞癌免疫微环境的重塑。此外，研究还发现内源性ANXA3可以通过JNK通路参与骨肉瘤干细胞的形成[5]，下调ANXA3会抑制HIF-1α/VEGF通路，并且通过调节神经元兴奋性减轻骨癌疼痛[28]。
总之，ANXA3的异常表达在癌症的发生发展中发挥重要作用，能够刺激肿瘤细胞增殖，促进细胞侵袭和转移，诱导血管生成，同时与癌细胞的耐药性紧密联系，因此，ANXA3可能成为癌症治疗潜在的治疗靶点，具有重要价值。
4. ANXA3与其他疾病
有研究报道，膜联蛋白家族成员在心血管领域发挥着较为重要的作用，能够调节血管内皮细胞的自噬水平，保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤，抑制血管炎症反应，减少动脉粥样硬化的发生等[7]。ANXA3作为膜联蛋白家族的一员，与心血管系统细胞凋亡、氧化应激和心血管炎症同样存在密切的关系。首先，ANXA3可能通过促进心血管系统细胞凋亡介导心血管损伤。研究发现，大鼠在急性心肌梗死后，心肌组织中ANXA3的基因和蛋白表达均显著上调。PI3K/Akt信号通路的激活可以发挥抗凋亡作用，有利于心肌细胞的存活。研究表明ANXA3沉默可以激活PI3K/Akt信号通路促进急性心肌梗死的大鼠心肌损伤修复及愈合[29]。其次，ANXA3与心血管事件中的氧化应激存在关系。研究发现，在过氧化氢诱导的血管内皮细胞氧化应激反应中，ANXA3蛋白具有抗氧化作用，这可能与其抑制PLA2的活性有关[30]。此外，如前文所述，ANXA3具有促进血管生成的功能，这可能与血管系统疾病存在关联。有文献报道，虽然ANXA3与小鼠胚胎血管的形成没有必然联系，但其可以影响小鼠视网膜中的静脉-动脉对接，当ANXA3敲除后，小鼠视网膜会出现明显的动脉-静脉错位的情况，其类似于在视网膜分支静脉阻塞（BRVO）患者中观察到的动静脉交叉[31]。
除心血管系统外，ANXA3还与炎症密切相关。在吗啡镇痛耐受的研究中发现，ANXA3沉默后，小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达明显降低，可能与ERK和JNK的活性改变有关[32]。在体外实验中，虽然ANXA3的表达水平不会随着LPS或某些致病性病原体来源的炎症因子的加入而增加，但在加入干扰素家族蛋白，尤其是IFN-β后，ANXA3的表达水平会显著上调[33]。ANXA3能够以钙离子依赖的方式促进中性粒细胞的颗粒聚集，参与颗粒-颗粒和颗粒-吞噬体的融合，这些机制可能在炎症反应中发挥作用。研究发现，川崎病患者的中性粒细胞数量和血清中ANXA3的表达水平存在异常，治疗后均显著下降，表明二者可能存在潜在联系，提示ANXA3可能与该病的过度炎症和免疫异常有关[34]。
除此之外，研究发现ANXA3可能与丙肝、骨代谢、脑缺血损伤等存在联系。ANXA3能够被募集到丙肝感染细胞的脂滴组分中，是丙肝病毒在细胞间传染与传播所必需的。细胞中ANXA3蛋白水平虽然不会影响丙肝病毒RNA的复制，但会显著影响病毒颗粒的产生，是丙肝病毒成熟和释放的重要调节因子[35]。不仅如此，ANXA3还参与骨骼相关疾病的发展进程。有研究报道，ANXA3能够激活NF-κB信号通路，加速小鼠破骨细胞的形成和分化，从而影响小鼠骨代谢过程[36]。除此之外，研究发现原发性抗磷脂综合征（PAPS）患者白细胞中ANXA3的mRNA水平明显升高，表明ANXA3异常表达与动静脉血栓形成有关，尤其与该病进程中的止血途径联系密切[37]。Min等[38]研究证实，ANXA3下调能够激活PI3K/Akt信号通路对小鼠脑缺血损伤产生保护作用。
5. 总结
膜联蛋白家族与多种疾病的发生发展密切相关，而ANXA3作为该家族的一员，在胞吐、血管生成、脂肪细胞成熟和白细胞迁移等过程中发挥重要作用。目前，多项研究证实ANXA3与肿瘤的发生发展存在紧密联系，能够促进肿瘤细胞增殖和侵袭，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤血管形成等。除此之外，ANXA3还与心血管系统疾病、炎症、新冠肺炎和丙肝等其他疾病密切相关，过程涉及多种信号转导通路。目前关于ANXA3的研究较多集中在肿瘤领域，ANXA3在心血管疾病、炎症、骨骼疾病及新冠肺炎等领域的文献报道较少，其具体作用机制更是鲜有文献报道。因此，进一步深入研究ANXA3在上述疾病以及其他未知领域中的作用及机制具有重要意义。同时，围绕ANXA3的功能进行深入研究，探索其作为生物标记物进行疾病早期诊断或作为疾病的治疗靶点进行疾病干预等的可能性，将为相关疾病的治疗提供更多线索。
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图 1 模型组与对照组样本聚合度与OTU含量
A. 门水平的PLS-DA图；B.种水平的PLS-DA图；C.样本OTU数目Venn图模型组n = 3，编号M1、M2、M3；对照组n=3，编号C1、C2、C3
表 1 Alpha多样性指数表
组别 Sobs指数 Ace指数 Shannon指数 Simpson指数 对照组C1 701 712.782842 5.213487 0.016805 对照组C2 535 555.895755 2.418362 0.263764 对照组C3 894 912.018376 4.549837 0.054558 模型组M1 1885 1899.991681 6.43408 0.005768 模型组M2 882 892.237411 5.444351 0.018387 模型组M3 1284 1301.268936 6.109346 0.005465 
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