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组织蛋白酶K(CTSK) 属于半胱氨酸蛋白酶，是细胞内重要的溶酶体酶，在很多组织中有表达，如肺、脑、皮肤、骨骼和甲状腺等。CTSK在体内主要发挥降解骨胶原蛋白、弹性纤维蛋白、甲状腺球蛋白及细胞外基质的作用，与人类多种疾病密切相关，如肿瘤[1]、骨疾病、心血管疾病和肺纤维化等[2]。CTSK最早发现在破骨细胞特异性高表达，主要发挥降解骨基质中含量达95%的Ⅰ型胶原[2]。基于生物化学和结构分析研究发现CTSK与黏多糖（GAGs)可形成一种复合物，如硫酸软骨素(chondroitin-4-sulfate, C4S或CSA)，且只有这种复合物形成下才能更好发挥降解胶原作用[3]。
二至丸是治疗肾阴虚症的经典名方，由女贞子和墨旱莲组成，经考证出自明代吴曼辑所著的《扶寿精方》，收载于2020版《中国药典》，具补益肝肾，滋阴止血功效[4]。药理研究发现二至丸具有保肝降酶、增强免疫调节、改善血液系统功能、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗衰老、抗氧化、抗变态反应性炎症和植物雌激素样等作用[5]。临床报道，二至丸常用于治疗骨质疏松[6-8]，药理发现二至丸显著降低去卵巢骨质疏松大鼠血清中CTSK水平[5]。我们前期研究发现墨旱莲的正丁醇提取部位和活性成分墨旱莲皂苷IX能显著抑制CTSK的胶原降解活性[9]。因此，二至丸很有可能存在抑制组织蛋白酶K的活性成分，故有可能从中筛选组织蛋白酶K抑制剂。本研究采用荧光偏振法考察CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性，荧光光度法考察CTSK与合成荧光底物benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)结合活性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳法考察CTSK降解生理底物胶原蛋白和明胶的活性，以期从二至丸不同提取部位和活性成分中筛查具有抑制CTSK活性的抑制剂，最终阐明二至丸抑制CTSK酶活性的物质基础。
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墨旱莲、酒女贞子药材购自上海华宇药业有限公司, 经海军军医大学生药学教研室韩婷教授鉴定墨旱莲为菊科植物鳢肠 Ecliptaprostrata L. 的干燥地上部分，女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。其活性成分异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、蟛蜞菊内酯、熊果酸、齐暾果酸、蒙花苷、槲皮苷、木樨草苷、异去甲基蟛蜞菊内酯、松果菊苷、特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13等24种标准品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。
Z-FR-MCA购自日本WAKO公司；E-64 (L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane)和硫酸软骨素A (CSA)购自美国Sigma公司；荧光标记硫酸软骨素A(CSA*)购自日本株式会社Cosmo Bio公司；人I型胶原蛋白(Human collagen I)购自美国Affymetrix公司，牛不溶性I型胶原蛋白(Bovine type I insoluble collagen) 购自生工生物工程(上海)公司。
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墨旱莲500 g，加入10倍量水(W/V)，煎煮2次，每次1 h，合并提取液，煎煮浓缩，冷冻干燥，粉碎得墨旱莲水提取物。酒女贞子按照2020版药典二至丸制备方法，粉碎过80目筛。将酒女贞子粉末500 g与墨旱莲水提取物粉末混匀，用10倍量正丁醇(W/V)回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩后，冷冻干燥得正丁醇部位提取物。滤渣挥干，按照正丁醇方法依次分别用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液对滤渣进行萃取，冷冻干燥得到二至丸的正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物。
研究报道二至丸的活性成分，主要包括墨旱莲三萜皂苷类和女贞子环烯醚萜苷类成分，及一些黄酮类、苯乙醇苷类等成分[10-12]。本研究30个成分中墨旱莲皂苷 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ) 和刺囊酸是由墨旱莲正丁醇部位经凝胶柱层析分离得到[9]，墨旱莲中蟛蜞菊内酯、异去甲基蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷和女贞子中异毛蕊花糖苷、橄榄苦苷、熊果酸、齐暾果酸、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷、松果菊苷、特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、大黄素甲醚、β-谷甾醇、3, 4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇等成分为购买标准品。
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二至丸不同提取部位和化合物用DMSO溶解分别配置40 mg/ml和10 mmol/L的储备溶液，并在分析之前用100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA) 分别稀释至浓度为25 µg/ml和 25 µmol/ml (DMSO低于１%)，加入黑色荧光96孔板，最终反应容量为0.2 ml。加入终浓度为5 nmol/L的CTSK孵育5 min，加入Z-FR-MCA底物(终浓度1 mmol/L)，孵育30 s，实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长460 nm，吸收光波长355 nm)。所有测量均使用荧光仪Tecan spark（美国）在96孔板中进行，单孔体积为200 µl。实验设阴性对照组(无抑制剂)，阳性对照组(E-64，活性位点抑制剂)。计算公式：抑制率(%)= 100−(1−Vi /V0)。Vi和V0分别表示存在和不存在抑制剂情况下的荧光信号。
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将100 µg/ml不同部位或25 µmol/ml有效成分与200 nmol/L的CTSK在含有2.5 mmol/L DTT和EDTA的100 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.5）中，混匀放置5 min，然后添加20 nmol/L CSA*，混匀放置15 min，室温下实时检测5 min荧光生成斜率(slope)值(发散光波长485 nm，吸收光波长520 nm)，所有测量均使用荧光仪Tecan spark（美国）在黑色荧光96孔板中进行，总体积为100 µl。设置不使用抑制剂（阴性对照）和300 mmol/L NaCl（阳性对照）。CTSK和FP之间的关系使用抑制百分比进行分析，计算公式：抑制率(%)=100− [（100×（FPCTSK/抑制剂/CSA*−FP CSA*）/（FPCTSK/CSA*−FP CSA*）]其中，FPCTSK/抑制剂/CSA*和FPCTSK/CSA*分别是在存在和不存在抑制剂的情况下测定荧光信号。
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人I型胶原0.6 mg/ml溶解于100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)中，依次加入CTSK (最终浓度400 nmol/L)、CSA (最终浓度200 nmol/L) 和400 μg/ml二至丸不同提取部位或不同浓度潜在抑制剂(100、80、60、40、20、10 μmol/L)，加入到含有I型胶原蛋白的缓冲液，单孔体积50 μl，混匀，28 ℃孵育4 h。取出后加入1μl的 100 μmol/L E64终止反应。采用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脱色。I型胶原的α1条带的灰度用ImageJ 2软件进行定量分析。
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称取1 mg不溶性牛I型胶原蛋白置于1.5 ml EP管中，加入1 μmol/L CTSK酶和25 μmol/L潜在抑制剂于40 μl缓冲液中(100 mmol/L醋酸盐缓冲液，pH值5.5，含有2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)。采用Z-FR-MCA底物结合活性方法在T0 min测定CTSK活性，在37 ℃下孵育30 min后，检测T30 min时的CTSK活性。从中取出40 μl上清液，添加2.0 μl NaCl（最终300 mmol/L），然后再次检查CTSK活性，记录为T30salt min。计算公式：结合率(%)=[1−(T0 min−T30salt min)/(T0 min−T30 min)]×100%。
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用Discovery studio 2016软件中的libdock分子对接方法考察活性成分和组织蛋白酶K(1ATK) 蛋白进行刚性对接。利用LibDock得分作为表征化合物与活性位点结合的核心指标。LibDock得分分数越高，小分子与受体结合的活性越高。
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每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验，若有显著性差异(α=0.05)，再采用Student's t检验进行两组比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
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本研究考察了DMSO浓度(10%、5%、2%和1%)对CTSK的Z-FR-MCA活性和CTSK/CSA*复合物形成活性高通量筛查方法，及SDS-PAGE胶原降解活性筛选方法的影响。结果发现，10%、5%、2%的DMSO显著抑制CTSK的Z-FR-MCA底物结合(图1A)和CTSK/CSA*复合物形成活性(图1B)。10%的DMSO显著抑制CTSK的胶原降解，1%和2%的DMSO对胶原降解无明显抑制作用。因此，本研究筛查二至丸的抑制CTSK活性方法将DMSO浓度控制在1%以下。
图 1 DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响
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对二至丸的不同提取部位(正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷) 进行了抑制CTSK活性筛选，其中Z-FR-MCA底物结合实验结果显示，二至丸的石油醚部位抑制作用明显，为96.3%，正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷提取部位抑制率分别为26.1%、50.8%和43.5%（见图2A）。二至丸正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取部位提取物对CTSK/CSA*复合物形成的抑制率分别为99.6%、52.0%、94.8%和59.8%（见图2B），胶原降解活性结果显示二至丸的正丁醇部位抑制作用最明显，达到100%，石油醚提取部位抑制作用为58%，二氯甲烷和乙酸乙酯提取部位作用也不明显，分别为33.1%和6.7%（见图2C和2D）。
图 2 二至丸的不同部位提取物抑制CTSK活性作用
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本研究对30种二至丸中的活性成分进行了体外筛选，结果发现25 μmol/L的墨旱莲皂苷Ⅸ、异毛蕊花糖苷、蟛蜞菊内酯、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、女贞苷、特女贞苷、3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇抑制CTSK/CSA*复合物形成的抑制率超过50%，表儿茶素没食子酸酯为51.2%。而在25 μmol/L时，仅有齐墩果酸、3-0-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇对CTSK与Z-FR-MCA结合活性有超过50%的抑制率，熊果酸为47.1%抑制率。采用libdock技术发现仅有3,4-二羟基苯乙醇和对羟基苯乙醇与CTSK活性位点对接有得分。因此，这些超过50%抑制率的二至丸活性成分被认为具有潜在抑制胶原降解活性。 针对以上12种活性成分，进行胶原降解抑制实验，结果显示在100 μmol/L时，墨旱莲皂苷Ⅸ，对胶原降解抑制率达70.3%，女贞苷53.2%，蟛蜞菊内酯达50.1%和表儿茶素没食子酸酯为60.2%。异毛蕊花糖苷、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、特女贞苷、熊果酸、齐墩果酸、3-O-乙酰基齐墩果酸、19α-羟基熊果酸、3,4-二羟基苯乙醇、对羟基苯乙醇均显示无抑制胶原降解活性(表1)。
表 1 二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选
化合物成分 英文名称 CTSK/CSA*
抑制率(%)ZFR-MCA
抑制率(%)Libdock
得分胶原降解
抑制率(%)来源 墨旱莲皂苷Ⅴ eclalbasaponin Ⅴ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅰ eclalbasaponin Ⅰ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅱ eclalbasaponin Ⅱ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅶ eclalbasaponin Ⅶ 11.3±1.3 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅸ eclalbasaponinⅨ 88.6±9.2 0 / 70.3 M 红景天苷 Salidroside 27.8±3.1 0 / N 异毛蕊花糖苷 Isoacteoside 65.3±4.7 0 / / N 橄榄苦苷 Oleuroprin 35.9±2.4 0 / N 蟛蜞菊内酯 Wedelolactone 58.7±5.8 2.81 / 50.1 M 熊果酸 Ursolic Acid 0 59.7 / N 齐暾果酸 Oleanic acid 0 47.1 / N 刺囊酸 Echinocystic acid 0 0 / M 木樨草素 Luteolin 62.1±8.6 0 / M、N 蒙花苷 linarin 37.2±3.1 0 / M 槲皮素 quercitrin 68.5±5.9 0 / M、N 木樨草苷 galuteolin 33.2±3.7 0 / M、N 异去甲基蟛蜞菊内酯 Isowedelolactone 0 7.0 / M 松果菊苷 Echinacoside 55.9±6.5 9.7 / N 女贞苷 Nuezhenoside 51.2±4.7 0.10 / 53.2 N 特女贞苷 Specneuzhenide 58.6±6.4 17.9 / 49.7 N 女贞苷G13 Nuezhenoside G13 23.7±2.4 0.16 / N 3-O-乙酰基齐墩果酸 3-O-acetyl oleanolic acid 0 66.7 / N 19α-羟基熊果酸 19α-OH Ursolic Acid 0 53.2 / N 儿茶素 catechin 11.3 15.3 / M 表儿茶素 L-Epicatechin 12.7 18.7 / M 表儿茶素没食子酸酯 (-)-Epicatechin gallate 51.2±5.4 10.5 / 60.2 M 大黄素甲醚 Emodin monomethyl ether 19.8±1.7 0 / N β-谷甾醇 β- Sitosterol 0 0 / N 3’ 4-二羟基苯乙醇 3,4-dihydroxyphenethyl 70.3±8.4 83.2 76.4848 N 对羟基苯乙醇 p-hydroxyphenethyl 62.4±6.7 79.5 73.9225 N 注：M：墨旱莲；N：女贞子。 -
不溶性胶原、抑制剂和CTSK共培养15 min，通过检测培养液中剩余CTSK的Z-FR-MCA活性，来验证潜在CTSK抑制剂在体外抑制与CTSK的结合实验，结果显示100 μmol/L的墨旱莲皂苷IX（ES-IX）、表儿茶素没食子酸酯（EGCG）、女贞苷(NZG)和蟛蜞菊内酯(WED)抑制率分别为54.8%、64.1%、36.4%和51.4% (图3)。
图 3 4种潜在活性化合物抑制CTSK和胶原结合作用
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CTSK抑制剂的高通量筛选方法，多采用合成底物Z-FR-MCA结合活性来筛选，其原理是CTSK可裂解底物端FR-MCA基团, 释放游离的MCA 发色荧光基团, 通过抑制剂引起荧光信号变化差异来检测评价抑制剂活性。基于骨胶原降解需要CTSK与CSA结合发挥作用，采用荧光标记CSA*，形成CTSK/CSA*复合物，其原理为抑制剂与CTSK酶结合形成CTSK/抑制剂/CSA*复合物，导致荧光偏振信号差异，评价抑制剂与CTSK结合活性，可快速、灵敏和准确的判断化合物是否与CTSK存在相互作用。SDS-PAGE凝胶电泳法是常用蛋白质分类技术，将胶原蛋白及其降解产物按照分子量大小迁移，考马斯染色溶液染色，对α1胶原蛋白条带定量，计算胶原蛋白降解率。
二至丸的正丁醇提取部位抑制CTSK/CSA*复合物形成和胶原降解活性最强，超过95%，但对CTSK的Z-FR-MCA抑制率只有26%。Z-FR-MCA作为CTSK活性位点的合成底物，活性成分对Z-FR-MCA抑制率越高，证明对CTSK的活性位点抑制效率越高。基于Bromme教授提出的非活性位点抑制剂的概念[13]，活性成分具有显著的抑制胶原降解活性，但对活性位点Z-FR-MCA底物无抑制活性，可称为非活性位点 (exosite) 抑制剂。结果发现，二至丸的正丁醇提取部位可显著抑制胶原降解，而对Z-FR-MCA无显著影响，证明正丁醇提取部位可能存在抑制 CTSK胶原降解活性的活性成分, 而不影响CTSK 活性位点的生理活性。二至丸的正丁醇提取部位的化学成分主要为墨旱莲皂苷类成分和女贞子三萜酸类成分，其中墨旱莲皂苷Ⅸ（ES-Ⅸ）、表儿茶素没食子酸酯（EGCG）、女贞苷(NZS)和蟛蜞菊内酯(WED)可能是潜在的CTSK非活性位点抑制剂。熊果酸和齐墩果酸具有较强的Z-FR-MCA活性，表明可作用CTSK活性位点，而女贞子乙醇提取物、熊果酸、齐墩果酸和墨旱莲的蟛蜞菊内脂均报道显著抑制破骨细胞的骨吸收活性和CTSK的mRNA表达[14-15]，可能通过在细胞内直接作用CTSK酶，使其失去活性。
CTSK是抗骨质疏松药物研发的关键靶标，有报道，中草药尤其是补肾中药含有丰富的治疗骨质疏松的活性物质，但不清楚这些化合物是否能够抑制CTSK活性，或者特异性抑制胶原酶的活性。除了胶原降解活性，CTSK在甲状腺细胞中发挥降解甲状腺球蛋白，释放甲状腺激素[16]，在成纤维细胞中发挥降解纤维蛋白的功能[17]。二至丸中有抑制CTSK活性的化合物，可进一步考察其对甲状腺球蛋白降解和纤维蛋白降解的作用活性，为中医药开发CTSK抑制剂提供新的思路。
Study on material basis of cathepsin K targeted inhibitor in Erzhi Wan
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摘要:
目的 考察传统补肾经典名方二至丸中抑制组织蛋白酶K的活性部位和活性成分。 方法 采用高通量荧光方法筛选二至丸中正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚提取部位，以及二至丸主要活性成分对组织蛋白酶K(CTSK)与荧光合成底物Z-FR-MCA结合活性的抑制率，和对CTSK与硫酸软骨素A(CSA)复合物形成活性抑制率。进而考察二至丸不同提取部位和活性成分抑制CTSK生理底物I型胶原蛋白降解活性，并采用分子对接和底物结合实验验证潜在CTSK抑制剂。 结果 二至丸的正丁醇和石油醚提取部位对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过90%，石油醚提取部位对CTSK与底物Z-FR-MCA结合抑制率超过90%，正丁醇提取部位对CTSK的胶原降解抑制率超过95%、石油醚提取部位为58.6%。30个有效成分中11个显示对CTSK与CSA复合物形成抑制率超过50%，有5个成分对CTSK与荧光底物Z-FR-MCA结合活性抑制率超过50%。最终筛选确定4个成分墨旱莲皂苷Ⅸ、表儿茶素没食子酸酯、女贞苷和蟛蜞菊内酯，对胶原降解抑制率超过50%，其中墨旱莲皂苷Ⅸ抑制胶原纤维与CTSK的结合率最高达60%，但均与CTSK活性位点分子对接不成功。 结论 二至丸中存在抑制组织蛋白酶K的活性物质，主要存在于正丁醇部位，但活性成分不是活性位点抑制剂，可能通过与其他位点结合，间接抑制CTSK与寡多糖结合，进而降低了CTSK的胶原降解活性。 Abstract:Objective To investigate the active ingredients and components that inhibiting cathepsin K activity in Erzhi Wan, a classic kidney-tonifying formula. Methods Then-butanol, dichloromethane, ethyl acetate and petroleum ether parts and 30 active components in Erzhi Wan were screened by established high throughput fluorescence methods of inhibit the binding activity of CTSK with Z-FR-MCA substrate, the formation of CTSK and chondroitin sulfate A (CSA) complex activity, and the activity of substrate type I collagen degradation by CTSK. Molecular docking and insoluble collagen substrate binding assays were applied to verify the potential CTSK inhibitors. Results The n-butanol and petroleum ether parts of Erzhi Wan inhibited the formation of CTSK and CSA* complex by more than 90%, the petroleum ether part inhibited the binding of CTSK to substrate Z-FR-MCA by more than 90%, the collagen degradation inhibition rate of CTSK in n-butanol part was more than 95% and that in petroleum ether part was 58.6%. Among the 30 active components, 11 showed that the inhibition rate of CTSK and CSA* complex formation was more than 50%, and 5 components with the inhibition rate of Z-FR-MCA binding activity more than 50%. Finally, there were four components including eclalbasaponin Ⅸ, (-)-epicatechin gallate, nuezhenoside and wedelolactone. The inhibition rate of collagen degradation was more than 50%. Eclipta saponin IX inhibited the binding rate between collagen fibers and CTSK, up to 60%, but all of them failed to dock with CTSK active site. Conclusion There are active components that inhibiting cathepsin K in Erzhi Wan, which mainly exists in the n-butanol ingredients, but the active components is not an active-site inhibitor. It might inhibit the binding of CTSK with oligosaccharides by binding to other sites of CTSK, and then reduce the collagen degradation activity of CTSK. -
Key words:
- Erzhi Wan /
- osteoporosis /
- cathepsin K /
- active fraction /
- potential inhibitor
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心力衰竭，简称心衰，是由于心脏器质性或功能性异常导致的心室充盈或射血能力受损所引起的复杂临床综合征[1]。随着人口老龄化程度不断加深以及许多患者从急性心脏疾病中存活，慢性心衰的患者数呈现增长态势，尽管过去30年其生存率有了显著提高，但5年病死率仍约为50%[2, 3]。慢性心衰因其高发病率和高病死率，长期以来一直是社会的主要医疗负担[4]。慢性心衰主要表现为射血分数降低的心衰，其药物治疗主要包括血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂、钠-葡萄糖协同转运体2抑制剂组成的四联疗法[5]。患者尤其是长期用药者，由于低血压、电解质紊乱等不良反应的影响，通常用药依从性欠佳。
传统中药在治疗心衰方面有着悠久的历史和独特的理论[6]，具有多靶点且成本较低等优势，如黄芪[7]。黄芪注射液是临床上治疗心衰的常用中药注射剂之一，疗效肯定[8]。大量研究已经证实了黄芪治疗心衰的有效性和安全性[9, 10]。黄芪甲苷是黄芪治疗心衰的主要活性成分[11]。但是，由于黄芪甲苷水溶性差，生物利用度极低，限制了黄芪甲苷药物制剂在临床上的转化[12, 13]。因此，黄芪甲苷可作为先导化合物，进行结构优化，既保持其原有的活性，又能增强其水溶性，以便增加生物利用度，充分发挥黄芪甲苷治疗心衰的作用。本研究主要从合成的系列水溶性黄芪甲苷衍生物中，筛选具有抗心衰效用的化合物，并初步探讨其对心肌重塑和心肌纤维化的改善作用，以期为临床提供抗心衰的候选新药。
1. 材料
1.1 动物
雄性C57BL/6小鼠150只，7~8周龄，体重为18~22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：20170012004976。动物实验严格遵守动物护理伦理指南进行操作，已通过海军军医大学动物实验伦理委员会批准。饲养环境为无特定病原体（SPF）环境，温度为（25±2 ）℃，每日光照12 h，昼夜循环，自由摄取标准饲料和饮用水。
1.2 试剂与材料
水溶性黄芪甲苷结构改造衍生物包括HHQ、HHQ12CS和HHQ18TC，HHQ进一步结构改造得到HHQ16和HHQ19，均由上海医药工业研究院孙青䶮教授提供。卡托普利、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、异氟烷均购自国药集团。内源性过氧化物酶封闭液、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、苏木素染色液购自碧云天公司。Masson复合染色试剂盒购自博谷德生物工程公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒购自日本Takara公司。Target Retrieval Solution购自丹麦Dako公司。COL1、COL3抗体、TGF-β1抗体购自英国Abcam公司。αSMA抗体购自中国博奥森生物技术公司。
1.3 仪器
呼吸机（意大利UgoBasile公司）；麻醉剂（中国惠德万邦公司）；二维及M型超声（意大利EsaoteMyLab公司）；诊断仪及探头（意大利One/Touch公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；病理切片机（中国辅光精密仪器公司）；包埋机（中国BIOBASE博科公司）；组织摊片机（中国湖北孝感安立信公司）；高通量组织研磨仪（中国上海必横生物公司）；PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；Stepone Plus实时荧光定量PCR仪（美国AB applied biosystems公司）。
2. 方法
2.1 左冠状动脉前降支（LAD）结扎心衰模型的建立
通过2.5%异氟烷麻醉小鼠，气管插管接入呼吸机保持麻醉状态。开胸暴露心脏，在左心耳下缘约1 mm处用线缝扎冠状动脉，缝合后，待小鼠恢复自主呼吸，饲养3~4周，通过心超检测慢性心衰模型，从中筛选慢性心衰造模成功的小鼠（EF<50%）。
2.2 分组及给药
首先对黄芪甲苷衍生物进行药效筛选。将LAD结扎造模成功后的小鼠随机分为模型组、卡托普利组、系列黄芪甲苷衍生物（HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC）组、假手术组，共6组。造模后4周使用0.5%CMC-Na溶液配制黄芪甲苷衍生物，并按照小鼠每10 g体重0.1 ml进行灌胃给药，黄芪甲苷衍生物组分别给予10 mg/kg的HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC，假手术组和模型组分别给予同等剂量的0.5%CMC-Na溶液，卡托普利组给予8.6 mg/kg卡托普利混悬液，每日给药1次，连续28 d。HHQ衍生物药效筛选分组同上，即造模成功的小鼠随机分为模型组、HHQ组、HHQ16组和HHQ19组、假手术组，一共5组。假手术组和模型组处理同上，HHQ衍生物组分别用10 mg/kg的HHQ、HHQ16、HHQ19灌胃，每日给药1次，连续28 d。
2.3 心脏超声检测心功能
通过吸入2.5%异氟烷气体麻醉小鼠，在检测过程中提供1.0%~1.5%浓度的异氟烷以维持麻醉状态。通过二维及M型超声诊断仪检测小鼠的心功能，筛选造模后的成功模型（EF<50%）以及评价给药后小鼠的心功能。主要检测指标有左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）等参数。分别于给药18、28 d对各组小鼠进行心脏超声检测。
2.4 心脏形态学分析
对小鼠进行心脏超声检测之后称重，然后取心脏称重。计算心脏重量和体重的比值，即心体比（mg/g）。心脏标本用10%福尔马林固定24 h后，将心脏取出，排列整齐，拍照，观察心脏的大小和形态。取小鼠心脏组织于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规石蜡包埋切片处理。用HE染色和Masson染色观察心脏大体形态及胶原形成。
2.5 实时荧光定量PCR
提取心肌组织总RNA，逆转录成cDNA，实时定量PCR体系包括：SYBR 10 μl，引物（上游引物和下游引物）1 μl，cDNA 3 μl，以及DEPC水7 μl，引物合成序列见表1。
表 1 引物合成序列名称 上游引物 下游引物 COL1A1 TAAGGGTCCCCAATGGTGAGA GGGTCCCTCGACTCCTACAT COL3A1 ACGTAGATGAATTGGGATGCAG GGGTTGGGGCAGTCTAGTG αSMA GGACGTACAACTGGTATTGTGC TCGGCAGTAGTCACGAAGGA TGF-β1 GAGCCCGAAGCGGACTACTA TGGTTTTCTCATAGATGGCGTTG Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 2.6 免疫组织化学染色
心脏组织于4%多聚甲醛组织固定液中固定。梯度乙醇脱水后将组织浸入热石蜡中，将浸好的石蜡放入包埋机中包埋。将组织进行横切后去石蜡，使用Target Retrieval Solution进行抗原修复操作。用内源性过氧化物酶封闭液消除内源性过氧化物酶的干扰。用1%牛血清白蛋白封闭，使用相应的特异性抗体进行染色，根据种属关系选择对应二抗染色。为了可视化染色，使用DAB显色，并用苏木素进行复染。
2.7 统计方法
实验处理及统计图表的绘制利用GraphPad Prism软件完成。实验结果均采用均数±标准误（mean ± SEM）的方式呈现。两组样本之间的比较采用两独立样本t检验（t-test）；两组以上两两之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素重复方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响
LVEF和LVFS是评价心衰的重要指标，心衰时LVEF和LVFS下降。如图1所示，阳性对照药卡托普利给药后增加18 d和28 d的LVEF和LVFS，以18 d最为显著，LVEF增长百分比为56%；黄芪甲苷衍生物HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC均增加LVEF和LVFS，且呈时间依赖性，增强效果在3种药物之间无显著差异。以HHQ为例，LVEF增长百分比在18 d为61%，28 d为71%，优于同期的卡托普利。结合3种药物的合成难易性、稳定性、水溶性和药动学参数（数据在此不展示），HHQ可以作为进一步优化的候选化合物。
图 1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=5~9）A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001, 与0 d比较。3.2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响
对上述筛选出来的HHQ药物进一步衍生化，使其具有更好的合成路线、稳定性、水溶性和药动学参数（数据不展示）。进一步以HHQ为对照，对其衍生物HHQ16和HHQ19进行药效评估。如图2所示，给药28 d，HHQ衍生物均能使得心衰小鼠的LVEF%和LVFS%升高，其中，HHQ16升高LVEF%的百分比为104%，HHQ19升高LVEF%的百分比为171%（图2A、图2B）；而HHQ升高LVEF%的百分比为99%。但HHQ19显著增加心率（HR）（图2C），而HR增加会导致心肌耗氧量增加，增加死亡率[14]。因此，3种HHQ衍生物均能提升心衰小鼠的心功能，综合上述因素，选择HHQ16为最优候选化合物。
图 2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=7~10）A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）；C.心率（HR）**P<0.01，***P<0.001，与0 d比较。3.3 HHQ16改善心衰小鼠心脏大小、形态和结构
进一步观察候选化合物HHQ16对心肌重塑的影响，初步探索其作用机制。如图3所示，与假手术组比较，模型组心脏显著变大，形态不规则，心体比显著升高（图3B）；HHQ16给药28 d后，心脏显著变小，心体比显著下降（图3A、图3B）。HE染色（图3C）表明，假手术组小鼠心肌细胞结构正常，模型组可见部分心肌细胞呈现区域性不规则，心肌细胞变大。HHQ16给药28 d后，形态变规则，心肌细胞肥大显著改善。
3.4 HHQ16抑制心衰小鼠心肌组织纤维化
进一步观察HHQ16对心肌纤维化的影响。首先通过Masson染色，观察胶原沉积。如图4所示，假手术组的心肌组织无胶原沉积。模型组的心肌组织胶原沉积增多；而HHQ16组给药28 d，心肌胶原沉积显著减少。COL1、COL3、αSMA和TGF-β1是评估心肌纤维化的重要指标[15]。免疫组织化学染色结果显示（图5），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA蛋白表达水平显著升高，经HHQ治疗后，这些蛋白表达水平显著降低。基因水平也展示了相似的改变（图6），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA表达水平显著升高，而HHQ16能显著降低这些纤维化指标的mRNA表达水平。以上结果表明，HHQ16可以改善心衰造成的心肌纤维化。
图 6 HHQ16对心衰小鼠心肌纤维化相关指标mRNA水平的影响A.COL1；B.COL3；C.αSMA；D.TGF-β1*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与模型组比较。4. 讨论
心衰已经成为严重威胁人类健康的全球性公共卫生问题。越来越多的研究表明，由于“多靶点效应”，中药治疗心衰具有独特的优势，中药活性成分为新药开发提供了有价值的候选化合物。黄芪甲苷是治疗慢性心衰的中成药黄芪注射液的主要有效成分。然而，黄芪甲苷结构复杂，水溶性差，生物利用度低，化学合成困难，限制了该药物的临床转化。本研究涉及的水溶性黄芪甲苷衍生物均可显著改善心功能，最终根据化合物合成难易、药物稳定性、水溶性以及初步药动学比较，确定HHHQ16为最优候选药物。HHQ16具有抗心衰作用，对左冠状动脉前降支结扎模型诱导的慢性心衰小鼠有明确的治疗效果。
心肌重塑是由一系列复杂的分子和细胞机制导致的心肌结构、功能和表型的变化，包括心肌细胞肥大及心肌纤维化（心肌基质重构）等改变，以及在此基础上形成的心脏扩大、心脏质量增加。目前的研究认为，心肌重塑是心衰发生、发展的分子细胞学基础，是心衰恶化的主要机制之一。相关研究表明黄芪甲苷具有抗氧化、增强免疫力、增强心肌收缩力、减轻心肌纤维化和心肌重塑等作用[16-20]。通过对心衰小鼠表型观察，发现经过LAD手术后，模型组的心脏显著变大，心肌细胞变大，结构不规则，通过HHQ16治疗28 d后，心脏显著变小，心肌细胞接近正常，形态变规则。表明HHQ16能够改善心衰小鼠心肌重塑。
心肌纤维化被认为是心衰的基本病理变化，也是心肌重塑的分子基础[21]。心肌纤维化是当心肌因缺血、炎性反应、衰老等原因受损时，局部的心肌细胞凋亡，心肌成纤维细胞增殖，胶原纤维为主的细胞外基质增多，从而产生的一种病理变化。其主要特征是胶原蛋白合成和降解之间的平衡紊乱，导致心脏的深层结构和功能异常，造成收缩和舒张功能的严重损害，最终体现为心衰[22, 23]。心肌纤维化与心衰患者的疾病严重程度密切相关，但纤维化过程尚未成为心衰的直接治疗靶标。实验和临床证据均表明，心肌纤维化的改变可能是可逆的[22]，开发预防和逆转心肌纤维化的药物对于减轻心肌重塑和延缓心衰的发展至关重要。
胶原蛋白是细胞外基质的重要组分，其中COL1约占心脏胶原总量的85％，参与组成具有抗张强度的粗纤维，COL3约占11％，可组装成细纤维，以保持基质网的弹性[24]。在以心肌纤维化为特征的心脏疾病中，不管其病因如何，TGF-β1通常是导致纤维化的最后的、共同的中介物之一。TGF-β1是最重要的促纤维化生长因子之一，通过调节前胶原蛋白基因的表达，促进合成细胞外基质，促使心肌纤维化[25]。在肌成纤维细胞中，αSMA被组装成应力纤维，进一步导致细胞外基质蛋白过度沉积，减弱组织顺应性并加速心衰，肌成纤维细胞的分化是心肌纤维化反应的标志，其中，α-SMA的表达是此种分化的重要特征[26]。在本研究中，用Masson染色检测了小鼠的胶原，LAD手术可使小鼠胶原明显增多，而HHQ16给药治疗后能有效减少胶原沉积。通过免疫组化染色和qPCR检测了小鼠心肌纤维化相关指标，发现HHQ16可下调COL1、COL3以及αSMA蛋白水平的表达，并且下调COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA水平的表达，从而改善LAD手术引起的心肌纤维化，改善心衰程度。
综上所述，本研究从黄芪甲苷衍生物对心衰小鼠的保护作用入手，筛选出改造后黄芪甲苷衍生物最优的候选化合物HHQ16，通过对心肌重塑和心肌纤维化相关指标的检测，初步研究了其在心衰治疗中的作用机制，为HHQ16治疗心衰的药物研发提供科学依据。
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图 1 DMSO浓度对CTSK抑制剂筛查方法的影响
A. Z-FR-MCA活性；B.CTSK/CSA*复合物；C.胶原降解活性；*P<0.05, ***P<0.001，与不加DMSO组比较
表 1 二至丸中化学成分抑制组织蛋白酶K活性筛选
化合物成分 英文名称 CTSK/CSA*
抑制率(%)ZFR-MCA
抑制率(%)Libdock
得分胶原降解
抑制率(%)来源 墨旱莲皂苷Ⅴ eclalbasaponin Ⅴ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅰ eclalbasaponin Ⅰ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅱ eclalbasaponin Ⅱ 0 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅶ eclalbasaponin Ⅶ 11.3±1.3 0 / M 墨旱莲皂苷Ⅸ eclalbasaponinⅨ 88.6±9.2 0 / 70.3 M 红景天苷 Salidroside 27.8±3.1 0 / N 异毛蕊花糖苷 Isoacteoside 65.3±4.7 0 / / N 橄榄苦苷 Oleuroprin 35.9±2.4 0 / N 蟛蜞菊内酯 Wedelolactone 58.7±5.8 2.81 / 50.1 M 熊果酸 Ursolic Acid 0 59.7 / N 齐暾果酸 Oleanic acid 0 47.1 / N 刺囊酸 Echinocystic acid 0 0 / M 木樨草素 Luteolin 62.1±8.6 0 / M、N 蒙花苷 linarin 37.2±3.1 0 / M 槲皮素 quercitrin 68.5±5.9 0 / M、N 木樨草苷 galuteolin 33.2±3.7 0 / M、N 异去甲基蟛蜞菊内酯 Isowedelolactone 0 7.0 / M 松果菊苷 Echinacoside 55.9±6.5 9.7 / N 女贞苷 Nuezhenoside 51.2±4.7 0.10 / 53.2 N 特女贞苷 Specneuzhenide 58.6±6.4 17.9 / 49.7 N 女贞苷G13 Nuezhenoside G13 23.7±2.4 0.16 / N 3-O-乙酰基齐墩果酸 3-O-acetyl oleanolic acid 0 66.7 / N 19α-羟基熊果酸 19α-OH Ursolic Acid 0 53.2 / N 儿茶素 catechin 11.3 15.3 / M 表儿茶素 L-Epicatechin 12.7 18.7 / M 表儿茶素没食子酸酯 (-)-Epicatechin gallate 51.2±5.4 10.5 / 60.2 M 大黄素甲醚 Emodin monomethyl ether 19.8±1.7 0 / N β-谷甾醇 β- Sitosterol 0 0 / N 3’ 4-二羟基苯乙醇 3,4-dihydroxyphenethyl 70.3±8.4 83.2 76.4848 N 对羟基苯乙醇 p-hydroxyphenethyl 62.4±6.7 79.5 73.9225 N 注：M：墨旱莲；N：女贞子。 
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