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水飞蓟素(SM)是从菊科植物水飞蓟Silybum marianum (L.)Gaertn.的果实中提取得到的一类天然的黄酮木脂素类成分,主要包含水溶性成分和脂溶性成分两大部分。其中,水溶性成分为二氢槲皮素,也称花旗松素(TF);脂溶性成分有水飞蓟宁(SD)、水飞蓟亭(SC)、水飞蓟宾(SB)和异水飞蓟宾(ISB)四种,水飞蓟宾和异水飞蓟宾为同分异构体且水飞蓟宾的含量较高,通常以水飞蓟宾对水飞蓟素进行质量控制[1-3]。现代药理学研究表明,水飞蓟素具有多种药理活性,除保护肝脏的功能之外[4],其对肿瘤、糖尿病、阿尔茨海默病等也有较好的疗效[5-7],是一种至关重要的药用原料。然而,水飞蓟素水溶性差导致其口服生物利用度很低,很大程度影响了其临床应用价值[8]。
微孔渗透泵(MPOP)近年来受到越来越多学者的关注。与传统渗透泵片相比,其省去了激光(或者机械)打孔的步骤,通过添加水溶性致孔辅料使得药物可以通过膜上的若干微孔释放出来,从而有效弥补了传统渗透泵工艺复杂的缺陷[9-10]。本研究前期以难溶性药物水飞蓟素为模型药物,通过磷脂复合物(PC)技术提高了水飞蓟素的溶出度,并进一步制备成水飞蓟素微孔渗透泵片(SM-PC MPOP),最终达到缓慢释药且提高生物利用度的目的。同时,以市售水飞蓟素胶囊为参比,对自制SM-PC MPOP体内的过程进行初步的探索,进而评价该制剂体外释放与体内吸收的相关性,为利用体外释放试验控制SM-PC MPOP的质量提供依据。
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DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥机(上海一恒科技有限公司);Agilent 1200型高效液相色谱仪(配备二极管阵列检测器,美国Agilent公司);RCZ-6BZ型药物溶出仪(上海黄海药检仪器有限公司);AL204型分析天平(Mettler Toledo仪器有限公司);Vortex-5型涡旋混合机(海门市Kylin-Bell有限公司);QB-212型摇摆式混匀器(海门市Kylin-Bell有限公司);LD5-2A型离心机(北京医用离心机厂)。
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SM-PC MPOP片(自制,含SM 30mg,批号:131205);聚氧乙烯(阿拉丁试剂有限公司);氯化钠、醋酸纤维素、十二烷基硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司);水飞蓟素胶囊(Legalon®,Madaus AG,规格:以SB计相当于SM140 mg);水飞蓟宾对照品(纯度:98.0%,上海同田生物技术股份有限公司,批号:120115);甲萘酚(国药集团化学试剂有限公司);β-葡萄糖醛酸酶(美国sigma公司);甲基叔丁基醚(色谱纯,上海阿拉丁试剂公司);其余试剂均为分析纯,水为蒸馏水。
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健康成年比格犬,体质量(12±3) kg,购于四川省简阳市简城比尔动物养殖场,合格证号:SCXK(川)2009-15。
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称取处方量的SM-PC(其制备工艺另文发表)、氯化钠、聚氧乙烯,等量递加法混合均匀,采用12 mm冲模直接压片(每片含SM 30 mg,硬度为40 N),即得微孔渗透泵的片芯。将醋酸纤维素、聚氧乙烯溶于丙酮-异丙醇(90∶10)中,即得包衣溶液。将片芯置于包衣锅内,温度为45 ℃,恒流泵流速3.0 r/min,压力0.5 MPa条件下进行包衣操作,直至衣膜达到预定要求为止。所得制剂在在40 ℃条件下干燥12 h,即得SM-PC MPOP片。
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采用《中华人民共和国药典》溶出度测定法规定的桨法进行测定[11],以pH7.5的磷酸盐缓冲液900 ml为释放介质(添加0.5%十二烷基硫酸钠),温度(37±0.5) ℃,转速为100 r/min。于1、2、4、6、8、10和12 h各取出样品10 ml,用0.45 μm微孔滤膜滤过,及时补充等温度等体积的溶出介质10 ml。取续滤液进HPLC分析。另取SB对照品适量,精密称定,置于量瓶中,适量甲醇溶解并稀释至刻度,同法测定,计算不同时间内SM的主要成分SB的累积释放度,绘制释放曲线。
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色谱柱为 Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),检测波长为288 nm,流速为1 ml/min,柱温40 ℃,进样量为20 μl,流动相为甲醇-0.05%磷酸的梯度洗脱(0~4 min,35% A;4~16 min,35% A→40% A; 16~23 min,40% A→45% A; 23~40 min,45% A→50% A)。
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SB系列对照品溶液的制备:取SB对照品约10 mg,精密称定,置于25 ml量瓶中,加入适量的甲醇溶剂,轻微振摇使溶解,再添加一定量的甲醇稀释至刻度,配制得到浓度为464.0 μg/ml的SB对照品母液。用移液管精密移取该对照品母液0.25、0.5 ml于100 ml量瓶中;0.25、0.5、1、2和5 ml分别置于10 ml量瓶中,加65%甲醇溶液稀释至刻度,配成浓度依次为1.160、2.320、11.60、23.20、46.40、92.80和232.0 μg/ml的系列标准液,贮存备用。
甲萘酚内标溶液的制备:取甲萘酚约100 mg,精密称定,置于100 ml量瓶中,加一定量甲醇溶液,轻微振摇使溶解,再加适量的甲醇稀释至刻度,摇匀,精密吸取摇匀后的溶液5 ml于100 ml量瓶中,加65%甲醇稀释至刻度,制备得到浓度为54.80 μg/ml的内标液,贮存备用。
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使用一次性采血针采集比格犬前肢的血液3.0 ml,置于真空采血管(添加肝素钠)中,用离心机在4 000 r/min的条件下离心10 min,取上层淡黄色液体,得到血浆样品。用移液枪精密吸取血浆(空白血浆或含药血浆)1.0 ml于10 ml具塞塑料离心管中,加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 5.0)0.5 ml,用涡旋混合机混合均匀,再添加β-葡萄糖醛酸酶(酶活性相当于50 U)50 μl,涡旋混合30 s,37 ℃水浴中孵育约16 h,孵育结束后,添加内标液50 μl,混匀后加入pH 8.5的硼酸盐缓冲液2.0 ml,继续涡旋混合30 s,再添加甲基叔丁基醚4.0 ml,涡旋混合2 min使溶液均匀,最后置于3 000 r/min的离心机中离心10 min,分离得到上清液。将上清液置于40 ℃水浴下用氮气挥干,残渣用65%甲醇溶液100 μl复溶,涡旋混合1 min,精密吸取上清液20 μl进样。
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按照“2.3.1”项下色谱条件和“2.3.3”项下血浆样品处理方法处理和检测空白血浆、加药血浆和服药后血浆样品,记录色谱图,考察血浆内源性物质对内标、SB及其异构体的检测是否有干扰,结果见图1。
由图1可见,SB、甲萘酚与血浆中的内源性物质分离良好,SB两个峰的保留时间分别为30.8 min和32.3 min,内标的保留时间为37.1 min。
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精密吸取空白血浆1.0 ml,置于10 ml带塞圆底离心管,按“2.3.2”项下加入SB系列标准液50 μl,配制成浓度为0.060、0.120、0.580、1.160、2.320、4.640和11.60 μg/ml的血浆样品,按“2.3.3”项下方法处理,以SB的峰面积与内标甲萘酚峰面积的比值As/Ais对SB的浓度C(μg/ml)进行线性回归,用加权最小二乘法(权重为1/C)进行计算,得标准曲线方程:Y=0.680 7X+0.093 9(r=0.998 0),可见,在0.06~11.6 μg/ml的浓度范围内呈现良好的线性关系。
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取空白血浆加入逐级稀释的SB标准溶液,按照信噪比为10的标准确定血浆样品中SB的最低定量限为0.05 μg/ml。
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取低、中、高3个浓度(0.060、1.160、4.640 μg/ml)的血浆样品,按“2.3.3”项下方法处理,根据线性方程计算样品的浓度。于1天内连续测定5次,连续5天重复测定,计算日内、日间精密度和准确度,结果见表1。结果日内、日间精密度以及准确度均符合相关规定。
表 1 血浆样品中SB的精密度和准确度试验结果(n=5)
ρB
(μg/ml)日内试验 日间试验 $\bar x $±s
(μg/ml)RSD
(%)准确度
(%)$\bar x $±S
(μg/ml)RSD
(%)准确度
(%)0.060 0.060±0.006 12.56 88.3 0.051 8±0.004 8.12 86.3 1.160 1.072±0.084 7.84 92.4 1.084±0.077 7.07 93.4 4.640 4.240±0.252 5.95 91.4 4.368±0.028 8 6.60 94.1 -
取SB血浆样品(浓度为1.16 μg/ml),分别进行以下研究:(1)冻融考察:样品放置在冰箱中,冰冻温度为−80 ℃,解冻温度为25 ℃,反复冻融3次,进行稳定性考察。(2)长期冷冻考察:将SB血浆样品于−80 ℃的冰箱中放置1个月后进行稳定性考察。(3)血浆样品处理后24 h的稳定性考察:将血浆样品按“2.3.3”项下方法进行前处理,室温下保存24 h,按“2.3.1”项下条件进行测定,把测定的峰面积代入当天的标准曲线,计算回收率。结果表明,在3种稳定性考察中,SB的回收率>90.8%,RSD<9.5%(n=3),表明血浆样品反复3次冻融后稳定性良好;血浆样品在−80 ℃的冰箱中至少可以保存1个月;血浆样品处理后可在室温下保存24 h。因此,SB在比格犬血浆中的稳定性符合生物样品的检测要求。
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取SB低、中、高3个浓度(0.06、1.16、4.64 μg/ml)的血浆样品,按“2.3.3”项下方法处理,进样测定SB与内标峰面积的比值A1,另取配制好的相应浓度的SB和内标溶液,取20 μl进样,得SB与内标峰面积比值 A2,按照公式:提取回收率(%)=(A1/A2)×100 %计算SB在低、中、高三个浓度的提取回收率为(68.59±8.37)%、(73.58±5.62)%、(70.26±4.15)%,同法测得内标甲萘酚的提取回收率为(81.8±3.51)%。
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参考文献[12]并结合预实验,确定试验动物的给药剂量为水飞蓟素30 mg/kg。
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采用双周期两制剂的双交叉实验设计,即将6只健康比格犬按体质量随机分成两组,交叉给予受试制剂(SM-PC MPOP)和参比制剂(市售水飞蓟素胶囊),洗脱期为 1 周。比格犬喂药前应先禁食12 h,空腹抽取空白血5 ml,按照“2.4.1”项下确定的剂量分别给予比格犬SM-PC MPOP及市售水飞蓟素胶囊,给药4 h以后进食低脂肪食物,在比格犬前肢小静脉处安置留置针,受试制剂组分别于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h采血3 ml,参比试剂组分别于第0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 各采血3 ml。 因受试制剂为缓释制剂,故在前1 h内采样点相较参比制剂(普通胶囊)密集。完成采样后间隔1周,1周后交叉给药,同时间点采血。血样置于用肝素抗凝的真空采血管中,立即于3 500 r/min的条件下离心取血浆,于−20 ℃保存,待测。
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受试制剂和参比试剂的血药浓度-时间曲线见图2。
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将受试制剂和参比制剂对应采血时间的血药浓度数据进行处理,计算非房室模型药动学参数,结果见表2。
表 2 非房室模型主要药动学参数(n=6)
药动学参数 单位 受试制剂 参比制剂 Tmax h 3.2±0.4 0.9±0.1 Cmax μg/ml 0.298 6±0.0689 0.629 9±0.076 5 ke h 0.119 4±0.017 6 0.274 2±0.100 5 t1/2 h 5.81±0.96 2.39±0.64 MRT h 3.469 4±0.075 8 7.485 7±0.082 4 AUC0→24 h·μg /ml 2.997 0±0.583 3 2.269 0±0.432 8 AUC0→∞ h·μg /ml 3.202 0±0.591 4 2.367 0±0.548 5 -
以非房室模型的数据计算SM-PC MPOP对市售水飞蓟素胶囊的相对生物利用度,可用下面的公式来计算:
$$ {F_r} = \frac{{{{(AU{C_{0 \to t}})}_T}}}{{{{(AU{C_{0 \to t}})}_R}}} \times 100\% $$ 虽受试制剂和参比制剂在剂量方面有所不同,但受试制剂具备线性药动学特征,故对计算结果进行剂量校正,计算得到Fr=(162.21±30.82)%。
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反卷积分法(convolution)是FDA推荐的缓控释制剂评价体内外相关性的经典方法,其不需要进行房室模型拟合,直接用数学方法以真实的实验数据计算体内吸收分数。方程的实用形式如下:
$$ C(ti)={\displaystyle \sum _{k=1}^{i}Rk\cdot AU{C}_{ti-tk}^{ti-t_{K-1}}} $$ 由该方程可以解出:
$$ \begin{array}{l} R_1 = C(ti)/AUC_0^{t1} \\ R_2 = [C(t2) - R_1 AUC_{t2 - t1}^{t2}]/AUC_0^{t2 - t1} \\ R_3 = [C(t3) - R_1 AUC_{t3 - t1}^{t3} - R_2 AUC_{t3 - t2}^{t2}]/AUC_0^{t3 - t2} \\ R_i = [C(ti) - R_1 AUC_{ti - t1}^{ti} - R_2 AUC_{ti - t2}^{ti - t1} - R_{i-1}\\AUC_{ti - ti - 1}^{ti - ti - 2}]/AUC_0^{ti - ti - 1} \end{array} $$ 以市售水飞蓟素胶囊为参比,根据体内药动学试验结果计算出市售水飞蓟素胶囊的药-时曲线下面积及自制SM-PC MPOP各时间点的药物浓度,代入方程求出输入函数R(θ)。以R(θ)对相应时间点的累积释放百分率进行线性回归,直线的相关系数大于临界值表示体外释放与体内吸收相关性良好,结果见表3。
表 3 反卷积分参数
参数 时间(t/h) 2 4 6 8 10 12 SM-PC MPOP 释放度(%) 15.92 32.43 47.12 60.68 74.62 85.56 水飞蓟素胶囊分段AUC(h·μg/ml) 0.815 8 0.687 2 0.38 0.192 0.118 0.076 输入函数R(θ) 0.294 3 0.087 2 0.051 7 0.051 7 0.043 7 0.002 1 以累积释放百分率Y与输入函数R建立的回归方程为Y=−210.008 3R+71.301 7(r=0.839 0),当自由度df=n−2=4时,临界值r4,0.05=0.811,回归方程的相关系数r>r4,0.05,表明SM-PC MPOP的体外释放与体内吸收具有较好的相关性,即体外释放介质采用pH7.5的磷酸盐缓冲液(含0.5 %十二烷基硫酸钠)是可行的。
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由于SM各组分中只有SB含量较高,其余成分含量均较低,采用HPLC法仅能测得主要成分SB的血药浓度。液质联用技术在近年来发展迅猛,不仅分离性能好,而且灵敏度高[13]。后续可借助超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术(UPLC-MS/MS)同时检测SM的5种成分在比格犬血浆中的含量,更能科学地反映SM-PC MPOP各成分的体内吸收情况。
难溶性药物在血浆样品中多采用乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等进行萃取。试验中对这3种溶剂进行了考察,发现采用乙酸乙酯萃取时回收率较低,乙醚和甲基叔丁基醚无显著差异,但后者沸点比乙醚高,且在实际提取操作过程中溶剂挥发较少,安全性相对较高,因此选择甲基叔丁基醚作为萃取溶剂。
SB口服吸收以后,大部分在肝微粒体中经葡萄糖醛酸化结合形成苷,游离型含量较低,故加入β-葡萄糖醛酸酶水解苷键后测定血药浓度[14-15]。孵化前加入pH5.0的磷酸缓冲盐溶液调整血浆样品的 pH 以保证β-葡萄糖醛酸酶的活性,水解后再加入pH8.5硼酸盐缓冲液,使SB更多的以分子的形式存在,增加其脂溶性,再使用有机溶剂甲基叔丁基醚提取药物。其中,β-葡萄糖醛酸酶的加入量对测定结果准确性的影响至关重要,加入过少则难以水解完全,而加入过多会使具有紫外吸收的内源性物质被提取出来,增加干扰。
市售水飞蓟素胶囊(Legalon®)是一种高品质的水飞蓟素制剂,其采用特殊的工艺提取后,水飞蓟素纯度提高,水溶性增加[16],具有高含量、高纯度和高体外溶出度等特点。而自制的SM-PC MPOP则是基于卵磷脂复合技术,使得药物脂溶性增加,适宜的脂水分配系数使得药物更容易被胃肠道黏膜吸收,从而提高了生物利用度,两者在制剂技术方面的区别造成生物利用度有所差异。在本研究中,药动学研究结果显示自制的SM-PC MPOP峰浓度降低,实现了SM的成分缓慢释放的目标,且生物利用度高于市售水飞蓟素胶囊。
In vivo pharmacokinetics and in vitro-in vivo correlation of silymarin phospholipid complex microporous osmotic pump controlled-release tablets in beagle dogs
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摘要:
目的 评价水飞蓟素磷脂复合物微孔渗透泵(SM-PC MPOP)控释片的体外释药特性、比格犬体内药动学及其体内外相关性。 方法 释放介质为pH7.5的磷酸盐缓冲液(添加0.5%十二烷基硫酸钠),以高效液相色谱法(HPLC)检测SM-PC MPOP的体外释放特征。用6只比格犬进行双周期交叉对照实验,按照30 mg/kg的剂量给药。HPLC法测定比格犬血浆内水飞蓟素的主要成分水飞蓟宾的质量浓度,应用药动学软件进行数据分析。 结果 SM-PC MPOP在12 h累积释放度超过85%。药动学研究情况表明,受试制剂(SM-PC MPOP)和参比制剂(市售水飞蓟素胶囊)在比格犬体内的主要药动学参数:Tmax分别为(3.2±0.4)、(0.9±0.1)h,Cmax分别为(0.298 6±0.068 9)、(0.629 9±0.076 5) μg/ml,AUC0→24分别为(2.996 8±0.583 3)、(2.268 9±0.432 8) h·μg /ml,SM-PC-MPOP对市售水飞蓟素胶囊的相对生物利用度为(162.21±30.82)%。 结论 自制的SM-PC MPOP实现了缓慢释药且增加生物利用度的目标,其体内吸收与体外释药具备相对较好的关联性(r=0.839 0)。 Abstract:Objective To evaluate the release characteristics in vitro, pharmacokinetics in rabbits and in vivo-in vitro correlation of silymarin phospholipid complex microporous osmotic pump controlled release tablets(SM-PC MPOP). Methods The release characteristics of SM-PC MPOP in vitro were detected by HPLC in the artificial gastric fluid. Six beagle dogs were subjected to double cycle cross control, which were given SM-PC MPOP and Legalon(30 mg/kg). The concentration of silybin in plasma was determined by HPLC and the data were processed by software. Results The cumulative release rate of SM-PC MPOP in vitro was over 85% in 12 h. The pharmacokinetics in beagle dogs showed that SM-PC MPOP and legalon conformed to double compartment first-order absorption model and the pharmacokinetic parameters were obtained: tmax:(3.2±0.4)and(0.9±0.1)h, Cmax:(0.298 6±0.068 9)and(0.629 9±0.076 5)μg/ml, AUC0→24:(2.996 8±0.583 3)and(2.268 9±0.432 8)h·μg /ml. The relative bioavailability of SM-PC MPOP was(162.21 ± 30.82)%. Conclusion SM-PC MPOP could release slowly, which could increase the relative bioavailability significantly. The correlation between the absorption in vivo and release in vitro was fine(r = 0.839 0). -
金沸草(Inulae Herba)为菊科(Asteraceae)植物条叶旋覆花(Inula linariifolia Turcz.)或旋覆花(Inula japonica Thunb.)的干燥地上部分,被列入2015年版《中国药典》,具有降气、消痰、行水的功效,临床上应用广泛 [1]。金沸草的不同基源中,已有多篇文献报道过旋覆花的含量测定,而条叶旋覆花的含量测定目前尚未见报道[2-6]。
前期研究发现线叶旋覆花内酯A(britanin)是从条叶旋覆花中分离得到的含量较高且抗炎活性显著的一个倍半萜内酯,其结构式如图1所示。据文献报道,线叶旋覆花内酯A可应用于慢性阻塞性肺疾病[7]及心肌炎[8]的预防和治疗,具有神经保护[9]功能,能够通过抑制NF-κB和MAPK信号通路降低脂多糖(LPS)诱导的一氧化氮(NO)、前列腺素和炎性细胞因子的分泌水平[10]。这些功能与金沸草治疗“外感风寒,痰饮蓄结,胸膈脾满”相对应,因此可将其作为条叶旋覆花的重要质量标志物[1]。本研究优化了线叶旋覆花内酯A的提取方法和色谱条件,并开展系统适应性试验,建立了HPLC-UV法测定条叶旋覆花的干燥地上部位和头状花序中线叶旋覆花内酯A的含量测定方法,确定了含量较高的部位,有助于药材的合理应用。该方法操作简单,方便快捷,可为金沸草的基源药材条叶旋覆花的质量标准制定提供数据支持和科学依据。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
HP-1100系列高效液相色谱仪(惠普,美国);G1311A 四元泵、G1313A 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1314A VWD可变波长检测器、G1315B DAD二极管阵列检测器(安捷伦,美国);Agilent Zorbax SB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 µm;安捷伦,美国);BP211D 型电子天平(Sartotius,德国)。
1.2 药材与试剂
7批条叶旋覆花的干燥地上部分购自不同地区,获得的头状花序部位经由海军军医大学药学院生药学教研室张汉明教授鉴定;线叶旋覆花内酯A对照品(britanin)为实验室自制,化学分子式为C19H26O7,相对分子质量为366。经紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)和质谱(MS)分析,纯度≥98%,符合中药化学对照品的含量测定要求;乙腈为J.T Baker 色谱纯,水为Milli-Q超纯水,其他试剂均为分析纯。
2. 方法与结果
2.1 提取条件
超声法提取,超声时间为40 min。溶剂:100%甲醇。溶剂体积倍数:40倍。
2.2 色谱条件
色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm,5 µm;安捷伦,美国);初始流动相为乙腈-水(30:70),在20 min内升至乙腈-水(40:60)进行梯度洗脱,流速始终为1.2 ml/min;柱温为恒温30 ℃;检测波长212 nm。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取1.21 mg线叶旋覆花内酯A对照品,置于10 ml容量瓶中,用100%甲醇溶解后定容,摇匀,获得1 ml中含有线叶旋覆花内酯A 0.121 mg的对照品溶液(浓度为0.121 mg/ml),冷藏备用。
2.4 供试品溶液的制备
精密称定条叶旋覆花(头状花序)粉末(过3号筛) 和条叶旋覆花(干燥地上部分)粉末(过3号筛) 各1.0 g,分别置于具塞锥形瓶中,精密加入40 ml 100%甲醇,密塞,称重,超声提取60 min后,静置放冷,再称重,加100%甲醇溶液补足失重,摇匀,过滤,取续滤液,在5 000 r/min条件下离心10 min,取上清液,即得条叶旋覆花头状花序和干燥地上部分的供试品溶液。
2.5 方法学考察
2.5.1 专属性试验
取“2.3”项下制备的对照品溶液(0.121 mg/ml)和“2.4”项下制备的两种供试品溶液,分别按“2.2”项下的色谱条件进样测定,采用二极管阵列检测器(DAD)进行全波长扫描,记录并查看保留时间为12.2 min处峰上5点的紫外吸收图。如图2所示,两种供试品溶液的最大吸收波长与对照品溶液的最大吸收波长一致,峰形均为单一峰,分离度达到规定的要求,该方法的专属性良好。
2.5.2 标准曲线的绘制
精密吸取“2.3”项下制备的浓度为0.121 mg/ml的线叶旋覆花内酯A对照品溶液各0.5、1、2、4、10、16、20、24 µl,根据“2.2”项下的条件进行色谱测定,记录峰面积积分值。以线叶旋覆花内酯A的进样量为横坐标(X,相当于µg数),峰面积积分值为纵坐标(Y),计算并绘制标准曲线。计算得线叶旋覆花内酯A含量测定的回归方程为Y = 1 040.5X+1.379(r = 1.000 0),理论板数平均为25 554。结果显示线叶旋覆花内酯A在0.060~2.904 µg范围内呈现良好的线性关系。
2.5.3 精密度试验
精密吸取等量 “2.3”项下制备的线叶旋覆花内酯A对照品溶液(0.121 mg/ml),根据“2.2”项下的条件进行色谱测定,记录线叶旋覆花内酯A的峰面积,连续测定6次。计算结果显示6份线叶旋覆花内酯A对照品溶液的峰面积RSD值为0.59%。表明仪器和方法具有较高的精密度,符合要求。
2.5.4 稳定性试验
取 “2.4”项下制备的同一供试品,分别于提取后0、1、2、4、6、8、10、12 h按“2.2”项下的条件进行色谱测定,记录各谱图中线叶旋覆花内酯A的峰面积。结果显示,12 h内线叶旋覆花内酯A的峰面积的RSD为0.97%,具备良好的稳定性。
2.5.5 重现性试验
取样品批号为000 3的条叶旋覆花5份,分别精密称重,按照“2.2”项下的色谱条件,测定并计算线叶旋覆花内酯A的峰面积。根据结果计算得到其平均峰面积积分值为399.9,平均峰面积积分值的RSD值为1.04%,表明该方法测定线叶旋覆花内酯A的含量重现性良好。
2.5.6 检测限和定量限
在“2.2”项下的色谱条件下,以100%的甲醇为溶剂对线叶旋覆花内酯A对照品溶液(0.121 mg/ml)进行倍比稀释,按信噪比为3测定最低检测限。结果表明,当线叶旋覆花内酯A对照品的浓度为1.51 µg/ml、进样量为1 µl时,峰信号约为噪声的2 ~ 3倍,即最低检测限为1.51 ng。将线叶旋覆花内酯A对照品溶液稀释至浓度为0.453 µg/ml且信噪比约为10时,重复进样6次,计算得峰面积的RSD为1.96%,表明线叶旋覆花内酯A对照品的定量限为0.453 µg/ml,即4.53 ng。
2.5.7 回收率试验
取同一批号的样品6份(批号为000 3),分别精密加入与样品中线叶旋覆花内酯A含量相等的对照品,按“2.2”项下的色谱条件进行测定,计算线叶旋覆花内酯A的含量、回收率和RSD值。结果如表1所示,线叶旋覆花内酯A的平均回收率为95.77%,RSD为1.80%,表明该方法测定线叶旋覆花内酯A的加样回收率良好。
表 1 回收率试验结果取样量(m/g) 样品中的含量(m/mg) 对照品加入量(m/mg) 测定量(m/mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 0.505 0 0.803 0.770 1.555 97.8 95.77 1.80 0.524 2 0.834 0.770 1.557 94.3 0.502 8 0.799 0.770 1.519 93.7 0.509 1 0.809 0.770 1.562 97.8 0.504 9 0.803 0.770 1.534 95.2 0.509 6 0.810 0.770 1.546 95.8 2.6 样品的含量测定
分别精密称取对照品与7个批次样品的头状花序和干燥地上部分,按“2.3”项下与“2.4”项下分别制备对照品溶液和供试品溶液,按“2.2”项下的条件进行色谱测定分析,每批样品平行3次,记录峰面积。根据上述标准曲线计算7批样品中线叶旋覆花内酯A的平均含量。结果如表2所示,条叶旋覆花的头状花序中线叶旋覆花内酯A的平均含量为0.732%,干燥地上部分中线叶旋覆花内酯A的平均含量为0.125%,仅为头状花序的1/7。
表 2 条叶旋覆花的头状花序及地上干燥部分的含量测定结果部位 编号 采集点 含量(%) 平均含量(%) 头状花序 0001 江苏省南京市玄武区 0.733 0.732 0002 江苏省南京市溧水区 0.693 0003 安徽省马鞍山市含山县 0.936 0004 江苏省淮安市盱眙县 0.509 0005 安徽省滁州市明光市 0.709 0006 安徽省滁州市凤阳县 0.564 0007 安徽省六安市霍邱县 0.983 干燥地上部分 0001 江苏省南京市玄武区 0.202 0.125 0002 江苏省南京市溧水区 0.141 0003 安徽省马鞍山市含山县 0.158 0004 江苏省淮安市盱眙县 0.123 0005 安徽省滁州市明光市 0.059 0006 安徽省滁州市凤阳县 0.068 0007 安徽省六安市霍邱县 0.122 3. 讨论
提取方法和色谱条件是经过优化后选用的。本研究考察了超声、回流、浸渍3种提取方法,其中冷浸法提取出的线叶旋覆花内酯A含量最高,尽管提出率高,但提取的杂质最多,影响测定,热回流法提出的含量最低。考虑提取方法的提出率及操作的可行性和便捷性,选用超声法提取条叶旋覆花中的线叶旋覆花内酯A。随后本研究考察了选择不同溶剂(水、不同浓度的乙醇或甲醇等)、不同溶剂倍数的溶剂体积(10、20、40、60倍)及不同超声时间(10、20、40、60 min)等条件对线叶旋覆花内酯A的提取效果。结果显示,当溶剂为100%甲醇、体积倍数为样品质量的40倍、超声时间为40 min时,可以将条叶旋覆花中的线叶旋覆花内酯A充分提出。
通过比较 Inertsil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm,5 µm;岛津,日本)、Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm,5 µm;瑞典)和 Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm,5 µm;安捷伦,美国)3种色谱柱,发现Agilent Zorbax SB C18 柱能更好地分离条叶旋覆花药材的化学成分,而且线叶旋覆花内酯A峰峰形较好,理论板数较高,故选用该色谱柱分析。另外,本研究考察了不同柱温(20、25、30 ℃)、不同流动相系统(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-甲酸等系统)、不同流速(0.8、1.0、1.2 ml/min)等条件对分离效果的影响,结果表明柱温在30 ℃,以乙腈-水为流动相在1.2 ml/min的流速下梯度洗脱时,线叶旋覆花内酯A峰能较好地与其他峰达到基线分离。通过上述优化实验最终确定了方法部分所用的提取条件和色谱条件。
本文建立的以线叶旋覆花内酯A为标志物的金沸草的质量控制方法,能够帮助研究人员在对金沸草的研究开发过程中,对线叶旋覆花内酯A的含量进行质量控制,区分伪劣及混淆药材,选择质量合格的金沸草药材。另外,本研究发现相对于条叶旋覆花的干燥地上部分,线叶旋覆花内酯A在条叶旋覆花的头状花序中含量更高,是更有效的用药部位,为临床医师用药提供了参考。
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表 1 血浆样品中SB的精密度和准确度试验结果(n=5)
ρB
(μg/ml)日内试验 日间试验 $\bar x $ ±s
(μg/ml)RSD
(%)准确度
(%)$\bar x $ ±S
(μg/ml)RSD
(%)准确度
(%)0.060 0.060±0.006 12.56 88.3 0.051 8±0.004 8.12 86.3 1.160 1.072±0.084 7.84 92.4 1.084±0.077 7.07 93.4 4.640 4.240±0.252 5.95 91.4 4.368±0.028 8 6.60 94.1 表 2 非房室模型主要药动学参数(n=6)
药动学参数 单位 受试制剂 参比制剂 Tmax h 3.2±0.4 0.9±0.1 Cmax μg/ml 0.298 6±0.0689 0.629 9±0.076 5 ke h 0.119 4±0.017 6 0.274 2±0.100 5 t1/2 h 5.81±0.96 2.39±0.64 MRT h 3.469 4±0.075 8 7.485 7±0.082 4 AUC0→24 h·μg /ml 2.997 0±0.583 3 2.269 0±0.432 8 AUC0→∞ h·μg /ml 3.202 0±0.591 4 2.367 0±0.548 5 表 3 反卷积分参数
参数 时间(t/h) 2 4 6 8 10 12 SM-PC MPOP 释放度(%) 15.92 32.43 47.12 60.68 74.62 85.56 水飞蓟素胶囊分段AUC(h·μg/ml) 0.815 8 0.687 2 0.38 0.192 0.118 0.076 输入函数R(θ) 0.294 3 0.087 2 0.051 7 0.051 7 0.043 7 0.002 1 -
[1] THI T H, Nguyen, . Improving silymarin oral bioavailability using silica-installed redox nanoparticle to suppress inflammatory bowel disease[J]. J Control Release, 2021, 331: 515-524. doi: 10.1016/j.jconrel.2020.10.042 [2] OMMATI M M, FARSHAD O, AZARPIRA N, et al. Silymarin mitigates bile duct obstruction-induced cholemic nephropathy[J]. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol, 2021, 394(6): 1301-1314. doi: 10.1007/s00210-020-02040-8 [3] ZENG Q P, LIU Z H, HUANG A W, et al. Preparation and characterization of silymarin synchronized-release microporous osmotic pump tablets[J]. Drug Des Devel Ther, 2016, 10: 519-531. [4] MASTRON J K, SIVEEN K S, SETHI G, et al. Silymarin and hepatocellular carcinoma: a systematic, comprehensive, and critical review[J]. Anticancer Drugs, 2015, 26(5): 475-486. doi: 10.1097/CAD.0000000000000211 [5] KIM S H, CHOO G S, YOO E S, et al. Silymarin induces inhibition of growth and apoptosis through modulation of the MAPK signaling pathway in AGS human gastric cancer cells[J]. Oncol Rep, 2019, 42(5): 1904-1914. [6] KUMAR J, PARK K C, AWASTHI A, et al. Silymarin extends lifespan and reduces proteotoxicity in C. elegans Alzheimer’s model[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2015, 14(2): 295-302. doi: 10.2174/1871527314666150116110212 [7] ATAIHIRE J U, NWANGWA E K, IGWEH J C. Modulations in anti-oxidant activities of selected gastro-intestinal tissues in alloxan-induced, silymarin treated diabetic wistar rats[J]. OJGas, 2019, 9(5): 73-90. doi: 10.4236/ojgas.2019.95010 [8] TVRDÝ V, POUROVÁ J, JIRKOVSKÝ E, et al. Systematic review of pharmacokinetics and potential pharmacokinetic interactions of flavonolignans from silymarin[J]. Med Res Rev, 2021, 41(4): 2195-2246. doi: 10.1002/med.21791 [9] 袁晓炫, 要辉, 张欣, 等. 天麻素微孔渗透泵缓释片的制备及其药动学评价[J]. 中国医院药学杂志, 2021, 41(17): 1742-1748. [10] 王玉华, 杨海燕, 郝海军. 环维黄杨星D包合物微孔渗透泵控释片的制备及处方优化[J]. 中成药, 2020, 42(10): 2555-2560. [11] 国家药典委员会. 中国药典2015年版四部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 121-124. [12] ZHU H J, BRINDA B J, CHAVIN K D, et al. An assessment of pharmacokinetics and antioxidant activity of free silymarin flavonolignans in healthy volunteers: a dose escalation study[J]. Drug Metab Dispos, 2013, 41(9): 1679-1685. doi: 10.1124/dmd.113.052423 [13] 王迪, 俞佳, 詹固, 等. 液质联用技术在中药研究中的应用进展[J]. 中华中医药学刊, 2022, 40(2): 68-71. [14] 李秉新, 王鑫, 刘有平, 等. 水飞蓟宾非对映异构体在大鼠肝微粒体中葡萄糖醛酸化代谢的酶动力学比较研究[J]. 沈阳药科大学学报, 2018, 35(4): 289-294, 305. [15] 肖衍宇, 宋赟梅, 陈志鹏, 等. 水飞蓟素前体脂质体的制备和大鼠药代动力学的研究[J]. 药学学报, 2005, 40(8): 758-763. [16] 周旖璇, 张纯刚, 尹丽, 等. 水飞蓟宾原料药、利加隆、水林佳大鼠体内药物动力学研究[J]. 亚太传统医药, 2021, 17(6): 11-15. -