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多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性最常见的一种生殖内分泌疾病，其特征以生化或临床高雄激素血症、无排卵和卵巢多囊样改变等为主要表现[1-2]。流行病学显示PCOS在全世界范围内的总体发病率约为6%~20%[3]，而由PCOS引发的排卵障碍所致的不孕症占40%[4]。PCOS不仅影响女性的正常生殖功能，还会导致女性发生代谢系统方面的障碍，如高胰岛素血症、胰岛素抵抗，增加女性继发糖尿病、心血管疾病及子宫内膜癌的风险，对女性健康造成严重不良影响[2]。肥胖是PCOS发生的重要危险因素之一[5]。研究数据表明，28.3%的超重或肥胖的女性患有PCOS[6]，多达42%的PCOS患者超重或肥胖[7]。肥胖对PCOS的发展和进展产生显著影响，研究发现，脂肪细胞主要通过分泌脂肪因子，如IL-1、IL-6、瘦素、脂联素等，作用于相应的靶器官、靶组织、靶细胞，如卵巢、肾上腺等，刺激机体产生较多的雄激素，而雄激素又可通过抑制肾上腺素受体等导致体内脂肪分解减少，脂肪大量堆积在体内，导致体内高雄激素水平与肥胖之间形成恶性循环，严重影响PCOS患者的健康状况[3]。与普通女性相比，PCOS患者具有更高的肥胖倾向，且更容易出现腹部脂肪堆积[8]；而这种由于腹部脂肪堆积造成的中心性肥胖反过来又可加重PCOS患者的临床或生化表现，导致胰岛素抵抗、高雄激素血症、生殖功能异常等[9]。临床试验结果显示，若患者体质量减轻初始体质量的5%，其体内激素水平、血糖水平得以改善，同时，月经周期和排卵情况趋于正常化，这表明体质量减轻可增加患者排卵和妊娠的可能性[10]。
青蒿素（artemisinin，ART）是一种天然倍半萜内酯化合物，最初由2015年诺贝尔生理学或医学奖获得者屠呦呦从青蒿植物中提取出来并广泛用于抗疟疾治疗[11]；青蒿素还用于抗癌、抗炎药物等[12]。近年研究发现，青蒿素及其衍生物还具有预防肥胖的功效：在啮齿动物模型中，青蒿素及其衍生物通过调节p38MAPK/ATF2轴和Akt/mTOR途径等在脂肪生成过程中诱导脂肪细胞褐变，从而预防肥胖并改善肥胖相关的代谢紊乱[13]。Lee等[14]和Jang[15]体外实验数据表明，青蒿素及其衍生物可通过PPARγ途径抑制脂肪生成和脂肪因子的表达。本研究通过网络药理学方法和分子对接方法分析预测青蒿素可用于治疗PCOS的潜在靶点，旨在为深入研究其治疗的作用机制提供参考。
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通过Pubchem数据库[16]（
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）获得天然产物青蒿素的SMILES号，并将其输入Swiss TargetPrediction数据库[17]（http://www.swisstargetprediction.ch/ ）进行靶点预测，导出分析结果并保存；结合PharmMapper数据库[18]（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ ）预测的靶点，二者共同作为青蒿素的药物靶点，并将靶点导入Uniprot数据库[19]（https://www.uniprot.org/）进行靶点蛋白与基因名称转换。以“polycystic ovary syndrome”作为关键词检索，通过DisGeNET数据库[20]（https://www.disgenet.org/ ）、GeneCard数据库[21]（https://www.genecards.org/ ）进行疾病靶点预测。将搜集的青蒿素靶点和PCOS靶点分别导入Venny在线作图软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ ）绘制韦恩图，从而得到二者的共同靶点。 -
将共同靶点导入STRING数据库[22]（
https://cn.string-db.org/ ），物种选择“homo sapiens”，最低相互作用分数设置为“0.9”，隐藏游离点，其他保持默认设置，得到蛋白相互作用网络图（protein-protein interaction，PPI），将PPI网络图导入Cytoscape 3.9.1软件[23]，进行核心靶点筛选。 -
将共同靶点导入DAVID数据库[24]（
https://david.ncifcrf.gov/ ），分别进行基因本体（gene ontology，GO）功能、京都基因与基因组百科全书（kyotoencyclopodia of genes and genomes，KEGG）通路分析，其中GO功能富集内容从分子功能（molecular function，MF）、生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)三部分进行逐一分析，并利用微生信在线作图软件（http://www.bioinformatics.com.cn/ ）将分析结果进行可视化。 -
将所获得的青蒿素、PCOS作用靶点及信号通路分别导入Cytoscape软件构建药物-疾病-靶点-通路网络图。
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从Pubchem数据库中下载青蒿素的2D结构，在RCSB PDB数据库[25]（
https://www.rcsb.org/ ）中下载核心靶蛋白结构。利用Chem3D软件对青蒿素的2D结构进行转化，用Pymol软件对核心靶蛋白结构进行初步处理，再用Auto Dock Tools软件做进一步加氢等处理，并将处理的核心靶蛋白保存为“pdbqt”格式进行分子对接，最后利用Pymol软件对分子对接结果进行可视化处理[26-27]。 -
通过数据库检索共得到青蒿素潜在作用靶点229个，PCOS疾病靶点1292个。利用在线作图软件将青蒿素作用靶点与PCOS疾病靶点进行韦恩图分析，得到二者的交集靶点90个，如图1所示。
图 1 青蒿素与PCOS靶点韦恩图
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将交集靶点导入String数据库，绘制PPI网络关系图，如图2所示，其中包括网络节点90个，边235条。将共同靶点导入Cytoscape 软件进行核心靶蛋白筛选。如图3所示。综合节点度值及本研究相关度排名靠前的分别为AKT1、ESR1、MMP9、PPARγ、MMP2（见表1）。
图 2 蛋白互作网络图
图 3 核心靶点筛选
表 1 青蒿素作用于PCOS的核心靶点
基因名称 节点度值 排名 ALB 66 1 AKT1 60 2 CASP3 53 3 SRC 51 4 EGFR 50 5 HSP90AA1 49 6 MMP9 48 7 ESR1 48 8 HRAS 47 9 PPARγ 43 10 ERBB2 41 11 MMP2 37 12 -
将得到的90个交集靶点导入DAVID数据库进行GO富集分析，富集结果分别根据基因富集程度进行排序，其中BP前10个条目主要涉及细胞增殖调控、蛋白质磷酸化和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物学过程，MF前10个条目主要与蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白结合和酶结合等分子功能有关，CC前10个条目主要在细胞膜、胞质和胞核等部位富集，如图4所示。KEGG富集分析共筛选到162条信号通路，根据基因富集程度排序，前20个条目主要涉及PI3K/Akt、MAPK、Ras、内分泌抵抗等信号通路，如图5所示。
图 4 GO富集分析
图 5 KEGG信号通路富集分析
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将相关靶点及通路文件导入Cytoscape 3.9.1软件，得到药物、疾病、靶点和通路之间的关系图（见图6）。
图 6 青蒿素-PCOS-靶点-通路网络图
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分子对接结果显示，青蒿素与核心靶蛋白AKT1、MMP9、ESR1、PPARγ、MMP2之间均存在结合位点。青蒿素与核心靶蛋白的最低结合能分数见表2，结合能越低表示结合活性越高，化合物越容易与该靶点结合。其中青蒿素与核心靶蛋白之间的氢键连接可视化情况如图7所示。
表 2 青蒿素与核心靶点分子对接结果
化合物 核心靶点 最低结合能（kJ/mol） 结合位点 青蒿素 MMP9 −8.2 ARG-143 AKT1 −7.9 HIS-152 ESR1 −7.9 THR-460 PPARγ −7.7 PRO-426、GLN-430、
LEU-431、PHE-432MMP2 −6.4 HIS-190 
图 7 青蒿素与核心靶点分子对接可视化（结合能≤8.2 kJ/mol）
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PCOS主要通过卵巢病变、机体内分泌紊乱等方式影响女性的生育能力[28]。目前关于PCOS的发病机制和病因尚未具体阐明，多认为是遗传和环境因素相互作用的结果；由于病因机制不明，临床治疗尚无统一方案，多采用对症治疗，如基础生活方式调整，通过控制饮食、增加体育运动以降低体质量和缩小腰围，增加机体胰岛素敏感性，降低胰岛素及雄激素水平，同时辅以相应的药物治疗，以减轻症状。
本研究基于临床发现，PCOS患者多伴有肥胖表现，遂以肥胖与PCOS之间的潜在联系为出发点，同时基于课题组现有天然活性物质进行药物筛选，经文献调研发现青蒿素有抗肥胖效果，继而通过网络药理学方法分析预测青蒿素可能用于治疗PCOS的潜在作用靶点，并探讨其可能用于临床治疗PCOS的可行性。
本研究根据PPI网络拓扑属性分析筛选出核心靶点AKT1、MMP9、ESR1、PPARγ、MMP2等，推测这些可能是青蒿素用于治疗PCOS的潜在作用靶点。有研究表明[29]，AKT1在颗粒细胞增殖中起关键作用，而其表达量的高低主要与机体雄激素水平异常有关，这会导致PCOS患者卵巢颗粒细胞正常功能受损。此外，AKT1还具有组织特异性，Song等[30]通过小鼠实验发现脂肪组织中AKT1的选择性抑制可以刺激白色脂肪组织发生褐变，从而可增加机体能量消耗发挥抗肥胖的效果。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一种锌依赖性酶，可由卵巢产生，在卵泡发育和PCOS的发病机制中起重要作用[31]；研究发现PCOS女性患者MMPs活性增加，其血液、卵泡液和颗粒细胞中MMP9、MMP2水平升高，高水平的MMPs会通过改变细胞外基质重塑，引起异常卵泡闭锁和卵巢基质组织增加，从而对患者的排卵和生育能力产生不良影响[32]。Barbara等[33]在对正常女性和肥胖女性血清样本中的MMP浓度对比发现，体质量增加可影响女性血清中的MMP浓度。ESR是维持卵巢颗粒细胞分化、卵泡和卵母细胞生长发育以及排卵功能的关键受体[34]；ESR1是一种核激素受体，作为转录因子的激活剂发挥作用[35]；Schomberg等[36]在ESR基因敲除的小鼠模型中发现ESR基因缺失会导致卵泡发育受阻，以致卵泡闭锁及无排卵现象发生。Artimani等[37]在评估PCOS患者颗粒细胞中ESR基因表达时发现，ESR mRNA的表达显著低于排卵功能正常女性，认为ESR基因的显著减少可作为颗粒细胞成熟缺陷或卵泡发育停滞的指标。ESR1也是一种与线粒体功能相关的基因，研究发现其在肥胖女性脂肪组织中有减少，Zhou等[38]在人类和啮齿动物实验中证实，脂肪组织中ESR1的表达与脂肪量呈负相关，同时ESR-α作用的降低还会损害线粒体功能，促进肥胖增加，破坏机体代谢稳态。PPARγ是一种调节脂肪细胞发育和葡萄糖稳态的核受体，主要在脂肪组织中表达[39]；此外在发育阶段的卵巢颗粒细胞中表达，并可受黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平的影响来调节机体雌激素分泌和卵巢功能[40]。此外，Lee等[41]在PCOS患者颗粒细胞中发现PPARγ mRNA表达水平下调。胡卫红等[42]研究发现PPARγ 在PCOS患者的卵巢颗粒细胞的表达异常可能与PCOS的高雄激素血症有关。
GO生物学过程富集分析表明，青蒿素治疗PCOS的生物学功能可能与细胞增殖调控、蛋白质磷酸化和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程有关。KEGG通路富集分析表明，青蒿素可能通过作用于PI3K/Akt、MAPK、Ras、癌症等信号通路发挥治疗作用。有研究表明，PI3K/Akt信号通路参与调节细胞增殖分化和迁移，在卵泡发育过程中对卵巢颗粒细胞的生长和凋亡起着关键作用[43]，在PCOS患者颗粒细胞中与氧化应激相关的凋亡多伴随PI3K/Akt信号下调[44]。此外，研究表明PI3K/Akt信号通路还可以调节脂肪细胞的脂解与分化，从而参与机体脂质代谢[45]。MAPK信号通路参与调节多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控等，且该通路与卵巢颗粒细胞类固醇激素的合成有关[46]。研究发现，在PCOS女性中，异常的MAPK信号传导可导致代谢信号缺陷和卵巢雄激素分泌异常增多[47]。
为进一步探索青蒿素在PCOS治疗中的潜在分子机制，本研究将天然产物青蒿素和5个与PCOS密切相关的核心靶蛋白进行分子对接验证，寻找二者之间存在的最佳结合位点以及评估它们之间的结合能力。验证结果显示，青蒿素与核心靶蛋白之间能够较好结合。
综上所述，本研究采用网络药理学方法分析天然物青蒿素用于治疗PCOS的潜在作用靶点，其机制可能主要涉及PI3K/Akt、MAPK、内分泌抵抗等信号通路。这些信息为后续青蒿素用于治疗PCOS的实验验证提供了重要理论依据。
Exploration on the potential therapeutic mechanism of artemisinin in polycystic ovary syndrome based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:
目的 应用网络药理学和分子对接技术探索青蒿素对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）的潜在作用机制。 方法 通过Pubchem、Swiss Target Prediction、PharmMapper数据库预测青蒿素作用靶点,利用GeneCard、DisGeNET数据库获取与PCOS有关靶点；应用韦恩图分析青蒿素与PCOS的交集靶点；利用String软件对交集靶点进行PPI蛋白网络互作分析，并利用Cytoscape软件进行核心靶点筛选；应用DAVID数据库进行基因本体（gene ontology，GO）功能、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，并借助在线软件对分析结果进行可视化；通过Chemdraw、PyMol、Auto Dock Tools软件及RCSB PDB数据库对青蒿素及核心靶蛋白进行分子对接。 结果 得到青蒿素靶点229个，PCOS靶点1292个，韦恩图分析交集靶点90个，潜在核心靶点5个，分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、雌激素受体（estrogen receptor 1，ESR1）、基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein 9，MMP9）、过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein 2，MMP2），主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、Ras、内分泌抵抗等信号通路。分子对接结果显示青蒿素与对应核心靶蛋白之间存在分子结合位点。 结论 初步预测分析青蒿素可能通过多靶点、多机制对PCOS发挥治疗作用。 Abstract:Objective To explore the potential mechanism of artemisinin in the treatment of polycystic ovary syndrome (PCOS) by network pharmacology and molecular docking technology. Methods The corresponding targets of natural product artemisinin were obtained from PubChem, Swiss Target Prediction and PharmMapper databases, targets related to PCOS were obtained through GeneCards and DisGeNET databases; the intersection target genes of Artemisinin and PCOS were screened by Draw Venn diagram. Then the protein-protein interaction network (PPI) was constructed according to the intersection target genes through the STRING Database, and the core targets were screened by Cytoscape. Besides, gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis was performed by DAVID Database, and finally the data were analyzed visually by the online platform. Molecular docking of artemisinin and core targets were performed by Chemdraw, Pymol, Auto Dock Tools and RCSB PDB database. Results A total of 229 targets of artemisinin and 1292 targets of PCOS were screened out, 90 overlapping targets were obtained by Draw Venn diagram, and 5 potential core targets, AKT1, ESR1, MMP9, PPARG, MMP2, were mainly act on PI3K Akt, MAPK, RAS, endocrine resistance and other signal pathways. Molecular docking results showed that there were molecular binding sites between artemisinin and core targets. Conclusion It is preliminarily analyzed that artemisinin may play a therapeutic role in PCOS through multiple targets and mechanisms. -
Key words:
- artemisinin /
- polycystic ovary syndrome /
- network pharmacology /
- molecular docking
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西红花为名贵药材，来源于鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。原产于地中海地区、希腊、小亚细亚和伊朗，后经西藏传入国内，故又名藏红花[1]。《本草纲目》中记载番红花“主治心忧郁积、气闷不散，活血，亦治惊悸”[2]。2020版《中国药典》描述西红花具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效[3]。越来越多的现代药理研究表明，西红花具有抗肿瘤、抗血小板聚集与凋亡、抗心血管细胞凋亡、降血脂和降血糖等活性[4–6]，在健康和医疗领域具有重要作用。
世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的最新数据，2020年全球癌症新发患者病例数超过1 930万例，癌症死亡患者接近1 000万例[7]。天然活性成分是抗肿瘤药物研发的重要来源[8]。有研究表明，西红花中特有的西红花酸、西红花苷等具有抗肿瘤活性[9]，已有学者在西红花治疗结直肠癌、乳腺癌等的抗肿瘤作用方面进行了相关研究[10-11]，但其主要活性成分及抗肿瘤作用机制仍需进一步探索。
网络药理学[12]将系统生物学、生物信息学、计算生物学、网络科学和靶向药理学相结合，从系统层次和生物网络的整体角度探讨成分—靶标—通路的相互作用关系，为中药多靶点、多成分、系统性、整体性的作用机制研究提供了有力的技术支撑，从而指导新药研发和临床诊疗。因此，本研究应用网络药理学结合反向分子对接的方法，对西红花的抗肿瘤作用成分及靶点机制进行研究，为深入探索西红花抗肿瘤药效物质基础及作用机制提供参考。
1. 方法
1.1 西红花化学成分获取
利用TCMSP平台获取西红花化学成分，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-likeness，DL) 是药物筛选的关键参数，一般设置OB≥30%和DL≥0.18的化学成分作为候选药效成分，并结合文献报道[13–15]补充4个西红花化学成分。
1.2 西红花活性成分和肿瘤疾病相关靶点整理
应用TCMSP平台和PharmMapper[16]工具获取西红花活性成分的作用靶点，并借助UniProt数据库将靶点转换为对应基因。以“tumor”、“cancer”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）和TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）进行检索。将得到的疾病靶点和药物靶点取交集，作为药物作用于疾病的预测靶点。
1.3 “成分-靶点”网络的构建
根据预测的西红花药效成分、交集靶点，使用Cytoscape 3.9.1软件建立“成分-靶点”的网络图。
1.4 蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）的构建与分析
将药物疾病交集靶点输入String数据库构建PPI网络进行初步筛选，再将PPI网络导入Cytoscape 3.9.1中，以半数degree为参考标准，选取关键靶点。
1.5 基因功能注释和富集通路分析
将筛选获得的37个核心靶点录入Metascape平台（http://metascape.org/gp/index.html），物种设置为人，选择Custom Analysis，设置P<0.01，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。
1.6 分子对接
将筛选出的西红花主要活性成分通过PubChem下载SDF格式；利用RCSB PDB数据库下载关键蛋白靶点，优先选择有配体、结构相对完整的晶体结构，并采用AutoDock Tools对获取的PDB蛋白分子进行除水、加氢、计算电荷预处理；使用AutoDock Vina进行分子对接，计算结合能；选取最优构象，使用PyMOL软件做出3D结合模式图。
2. 结果
2.1 西红花化学成分获取
通过TCMSP获得70个西红花化学成分，设置OB≥30%且DL≥0.18进行筛选，再添加文献检索相关成分，共获得9个西红花活性成分，见表1。
表 1 西红花活性成分序号 化合物编号 化合物英文名 中文名 OB (%) DL 1 MOL001389 n-heptanal 庚醛 79.74 0.59 2 MOL001406 crocetin 西红花酸 35.3 0.26 3 MOL000354 isorhamnetin 异鼠李素 49.6 0.31 4 MOL000422 kaempferol 山柰酚 41.88 0.24 5 MOL000098 quercetin 槲皮素 46.43 0.28 6 MOL001405 crocin Ⅰ 西红花苷Ⅰ 2.54 0.12 7 MOL001407 crocin Ⅱ 西红花苷Ⅱ 1.65 0.21 8 MOL000720 safranal 藏红花醛 39.56 0.04 9 MOL001409 picrocrocin 苦番红花素 33.71 0.04 2.2 西红花活性成分和肿瘤疾病靶点
将TCMSP平台和PharmMapper获取结果进行整理，并借助UniProt数据库进行靶基因匹配，获得201个潜在靶点。以“tumor”和“cancer”为关键词，在GeneCards、OMIM和TTD数据库进行预测整理，剔除重复，筛选得到5896个潜在疾病靶点。将得到的疾病靶点和药物靶点取交集，共得到可作为药物作用于疾病的179个预测靶点。
2.3 “成分-靶点”网络的构建与分析
将西红花的9个活性成分与预测到的179个潜在靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，构建“药物-活性成分-靶点”网络（图1），网络中绿色代表药物作用于疾病的靶点，蓝色代表西红花活性成分，全图包括189个节点、299条边，其中degree值排名靠前的活性成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、苦番红花素和西红花苷Ⅰ，这些可能是西红花发挥抗肿瘤作用的潜在活性成分。
2.4 蛋白相互作用PPI的构建与分析
将疾病与活性成分的潜在靶点导入String数据库，采用Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图，依据degree值进行排序，以大于半数degree值为标准进行两次筛选，获取核心靶点37个（图2）。度值排名前5的靶点分别为EGF、MMP9、NFKBIA、IL-1B和IL-10，提示这些靶点可能是西红花发挥抗肿瘤作用的关键潜在靶点。
2.5 基因功能注释和富集通路分析
GO分析常用于注释基因和基因产物生物功能，分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）三部分。此次GO富集分析共得到BP富集结果193个、CC富集结果83个和MF富集结果123个，选取排名前10的条目绘制GO功能分析图（图3）。如图3所示，BP主要涉及对激素的反应、对脂质的反应、对异源刺激的反应等；CC主要涉及膜筏、膜微区、囊腔、细胞质囊泡腔等；MF主要涉及转录因子结合、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等。通过比较发现，细胞生物过程富集的基因数较多，说明西红花可能主要通过调节生物过程发挥抗肿瘤作用。
KEGG分析共富集到194条信号通路，其中34条癌症相关通路，并对前20条通路绘制气泡图（图4）。依据KEGG分析，西红花可能通过p53信号通路、TNF通路发挥抗肿瘤作用,可能对膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤具有治疗作用，西红花靶点-通路相互作用网络见图5，红色三角形代表与肿瘤相关的信号通路，蓝色矩形代表关键靶点。其中，西红花通过膀胱癌信号通路调控EGF、MMPs、Raf、VEGF、ERK等基因发挥抗肿瘤作用（图6），红色矩形代表西红花可能干预的关键靶点。
2.6 分子对接
将前15个潜在核心靶点与西红花活性成分进行分子对接。结合能(affinity)<0表明配体分子能够与受体蛋白自发结合，结合能≤−17.78 kJ/mol表明配体与受体有一定的结合活性，结合能≤−20.92 kJ/mol 表明配体与受体有较好的结合活性，结合能≤−29.29 kJ/mol 表明配体与受体有强的结合活性[17],且结合能越低,表明对接的效果越好，结合的构象越稳定[18]。经AutoDock Vina对接，将得到的结合能数据使用热图展示（图7）。本研究结合自由能小于−20.92kJ/mol 的活性成分有102个，占75.6%；小于−29.29kJ/mol 的活性成分有73个，占54.1%，可见这些核心化合物与受体结合活性较高，结构相对稳定。选取结合能力最好的4个组合用Pymol软件进行可视化处理（图8）。
3. 讨论
肿瘤的发生和发展是多基因、多步骤的结果。中药多成分、多靶点的特点使其在肿瘤治疗方面有独特的优势。大量的临床实践表明，中药在治疗肿瘤中能够改善症状、提高患者生存质量、延长生存期等，有着其他治疗药物及手段不可替代的作用[19-20]。以中药黄芪为例，不仅可以通过Wnt5/β-catenin信号通路抑制肿瘤生长[21]，同时具有通过PD-L1下调诱导耐药黑色素瘤的干性抑制和化疗敏感性增强的作用，可以减少化疗药物用量[22]，还能充当免疫佐剂，提高患者免疫力，改善生存质量[23]。网络药理学最大的优势在于可以运用系统生物学的分析，为中药多成分、多靶点、多通路的机制研究提供有力的技术支撑[12]，其分析理念和技术路径又与中医药治疗疾病的整体观相契合，已用于多种中药和中药复方作用机制的研究，如灯盏细辛、半枝莲等中药和茵陈蒿汤、桃红四物汤等中药复方，利用网络药理学的方法得到治疗机制的详细阐述和证明[24–27]，为中药药理作用机制的探索提供了很好的参考。
本研究发现西红花中多种成分，如西红花酸、西红花苷等可与IL-6、AKT1、CCND1、IL-1β、MMP9、EGFR、TP53靶点产生适度结合，提示这些靶点可能是西红花中活性成分发挥抗肿瘤作用的关键靶点。研究发现，AKT1是PI3K-AKT-mTOR信号通路中的重要靶点，被磷酸化激活后可以促进细胞的增殖与存活，与肿瘤细胞的生长密切相关[28]。多项研究表明，通过抑制AKT1可以治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种实体癌[29]。EGFR与一些全球发病率和致死率高的癌症发病机制直接或间接相关，包括肺癌、乳腺癌和结直肠癌等[30]。当EGFR过度表达时，细胞表面会出现过量的受体，诱导正常的细胞转化为癌细胞，并为癌细胞持续生存提供条件[31]。CCND1是细胞周期家族的一员[32]，公认的原癌基因,在甲状旁腺瘤、乳腺癌、肝癌及食管、肺、头颈部鳞状细胞癌的发生、发展过程中均起着重要作用[33-34]。西红花苷是由西红花酸和龙胆二糖或葡萄糖结合形成的二萜苷类化合物，西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的差别在于分子中糖苷基数目的多少 [35]。西红花酸已具有抗肿瘤作用，以其为苷元形成的西红花苷同样也表现出较好的抗肿瘤活性，其中西红花苷Ⅱ的表现最好。西红花苷可以通过P53途径下调细胞周期蛋白d1和p21的表达，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，从而抑制肿瘤生长[36]。分子对接的结果与GO富集分析、KEGG通路富集分析结果一致，验证了网络药理学分析结果的正确性。
Buyun等学者在肝癌Hep3B和HepG2细胞中使用西红花苷抑制了IL-6对STAT3以及细胞周期蛋白D1的激活，验证了西红花对肝癌细胞的抗增殖，凋亡和阻断入侵作用[37]。在转移性乳腺癌的研究中，Ali等研究人员在体内和体外实验中均证明了西红花苷可以通过VEGF和MMP9下调发挥抗肿瘤作用，而且对乳腺癌的转移扩散有较好的抑制作用[38]。这些研究成果在一定程度上验证了利用网络药理学探究发现的西红花抗肿瘤作用机制的可行性。
综上所述，本研究利用网络药理学结合分子对接技术，探究西红花抗肿瘤作用的活性成分、作用靶点及信号通路。发现西红花抗肿瘤的作用具有多成分、多靶点、多通路、多机制的特点，其中以西红花苷为代表的西红花特有化学成分显示出了良好的抗肿瘤活性，可以在多条肿瘤发生通路中发挥作用，为西红花治疗肿瘤的深入研究提供了理论基础。但这些结果受限于各个数据库信息的片面性，而且只关注了成分，没有考量到成分的含量及其之间是否存在相互作用，预测的结果存在一定的片面性和局限性，需要进一步进行体内、外实验验证。
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图 2 蛋白互作网络图
注：图中节点代表蛋白质，其中红色节点表示查询蛋白质，其他颜色节点表示与查询蛋白只有相互作用的其他蛋白质，空白节点表示未知3D结构的蛋白质，填充节点表示已知3D结构，连线代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系
表 1 青蒿素作用于PCOS的核心靶点
基因名称 节点度值 排名 ALB 66 1 AKT1 60 2 CASP3 53 3 SRC 51 4 EGFR 50 5 HSP90AA1 49 6 MMP9 48 7 ESR1 48 8 HRAS 47 9 PPARγ 43 10 ERBB2 41 11 MMP2 37 12 
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表 2 青蒿素与核心靶点分子对接结果
化合物 核心靶点 最低结合能（kJ/mol） 结合位点 青蒿素 MMP9 −8.2 ARG-143 AKT1 −7.9 HIS-152 ESR1 −7.9 THR-460 PPARγ −7.7 PRO-426、GLN-430、
LEU-431、PHE-432MMP2 −6.4 HIS-190
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