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中药配方颗粒是以符合标准的单味中药饮片为原料,经现代工艺提取、浓缩、制粒而成的一种新型中药制剂[1]。1992年,国家批准了试点生产企业进行中药配方颗粒研发,2001年,将其规范命名为“中药配方颗粒”,同时纳入中药饮片管理范畴。2021年国家先后公布了两批次196种配方颗粒的国家标准[2-3],标志着中药配方颗粒正式步入历史舞台。地龙配方颗粒目前仍属于企业在研品种,由于药材来源、制备工艺和质量标准不同,其产品质量亦存在差异,加之2020年版《中国药典》中地龙项下缺少指标成分和定量评价方法[4],使其仍缺少统一的评价指标。
核苷类成分是地龙舒张支气管、抗组胺、平喘的物质基础[5],通过对核苷类成分的评测,可在一定程度上反映地龙药材和配方颗粒的内在质量。有研究表明,利用高效液相色谱法(HPLC)建立的特征图谱,能较好地表征地龙药材中核苷类成分[6-7],同时可对其进行含量测定[8-12],也有用该方法测定地龙配方颗粒中次黄嘌呤的含量并对其进行质量评价的研究报道[13-14]。本研究采用高效液相色谱法测定不同厂家地龙配方颗粒中次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷4种核苷类成分的含量,并应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》建立指纹图谱进行质量评价。
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Thermo AcclaimTM120 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-水(B),梯度洗脱,洗脱条件见表1;流速0.6 ml/min;柱温25 ℃;检测波长254 nm;进样量10 μl。理论塔板数按肌苷峰计算不小于3500。
表 1 梯度洗脱表
时间 (min) 流动相比例(%) 流动相A 流动相B 0~15 2 98 15~25 2~3 98~97 25~30 3~8 97~92 30~40 8~20 92~80 40~50 20 80 50~55 20~50 80~50 55~60 50~100 50~0 60~63 100 0 63~68 100~2 0~98 -
取地龙对照药材约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入双蒸水50 ml,称定重量。于60 ℃水浴30 min,再超声(功率300 W,频率40 kHz)30 min,放至室温,称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,取上清液,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
分别称取对照品适量,制成含尿嘧啶0.504 mg/ml,次黄嘌呤0.326 mg/ml,黄嘌呤0.345 mg/ml,尿苷0.420 mg/ml,肌苷0.420 mg/ml,鸟苷0.338 mg/ml,腺苷0.350 mg/ml的储备液,置4 ℃储存备用。取上述对照品储备液适量,制成含尿嘧啶20.16 μg/ml,次黄嘌呤60.52 μg/ml,黄嘌呤17.25 μg/ml,尿苷21.00 μg/ml,肌苷138.2 μg/ml,鸟苷33.82 μg/ml和腺苷35.02 μg/ml的混合对照溶液。
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取地龙配方颗粒适量,研细,取0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入双蒸水50 ml,称定重量,超声处理(功率300 W,频率40 kHz)30 min,放至室温,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,取上清液,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
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取混合对照溶液和样品S1,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样检测,记录色谱图。根据对照品的保留时间,指认了地龙配方颗粒HPLC图谱中7个主要色谱峰(图1),分别为尿嘧啶(峰1)、次黄嘌呤(峰2)、黄嘌呤(峰3)、尿苷(峰4)、肌苷(峰5)、鸟苷(峰6)和腺苷(峰7)。
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取样品S1,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定6次,以肌苷峰为参照峰,计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积,二者RSD分别小于0.12%和2.46%,表明仪器精密度良好。
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取样品S1,按“2.2.2”项制备供试品溶液,分别于0、4、8、12、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件测定,以肌苷峰为参照峰,各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别小于0.16%和2.73%,表明该溶液在24 h内稳定性良好。
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取6份样品S1,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,以肌苷峰为参照峰,各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别小于0.14%和2.52%,表明该方法重复性良好。
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取样品(S1~S10)和对照药材,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,将所得的HPLC图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》软件,以样品S1色谱图为参照图谱,时间窗宽度为0.1,经多点校正后,进行全谱峰匹配,采用中位数法生成对照指纹图谱R(图2)。
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使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》软件对各厂家的地龙配方颗粒和对照药材的HPLC图谱与对照特征图谱进行相似度计算。结果10批次地龙配方颗粒(S1~S10)和对照药材的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为:0.943、0.953、0.961、0.982、0.912、0.970、0.989、0.974、0.972、0.978、0.945,均大于0.912,表明不同厂家生产的地龙配方颗粒之间,及其与地龙对照药材所含成分种类较为相似,但成分含量上具有一定的差异。
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分别取混合对照溶液0.1、0.25、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ml置于10 ml容量瓶中,定容。取上述溶液和混合对照溶液适量,0.45 μm滤膜滤过,按“2.1”项下色谱条件检测(n=2),以样品浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,计算得回归方程和相关系数,结果见表2。结果各回归方程的相关系数r≥0.999 9,表明4种成分在各自浓度范围内线性关系良好。
表 2 4种核苷类成分线性关系
组分 回归方程 相关系数 线性范围(μg/ml) 次黄嘌呤 Y=1.168 2X−0.004 5 0.999 9 0.605 2~60.520 0 肌苷 Y=0.605 0X+0.071 9 0.999 9 1.382 4~138.240 0 鸟苷 Y=0.705 3X+0.031 7 0.999 9 0.338 2~33.820 0 腺苷 Y=0.808 0X+0.029 1 0.999 9 0.350 2~35.020 0 -
取混合对照溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷峰面积的RSD分别为0.19%、0.07%、0.26%、0.13%,表明仪器精密度良好。
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取S1样品6份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件检测,记录峰面积并计算含量。次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷含量的RSD分别为1.94%、0.83%、0.94%、1.51%,表明该方法重复性良好。
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取S1样品按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件分别于配制0、4、8、12、16、24 h时检测,记录峰面积。次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷峰面积的RSD分别为0.37%、0.41%、0.47%、1.31%,表明供试品溶液在24 h之内稳定性良好。
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精密称取S1样品0.25 g,共9份,分别精密加入相当于已知含量的50%、100%和150%的次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷对照品溶液,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,计算平均加样回收率。结果,次黄嘌呤平均回收率为97.95%,RSD为0.47%;肌苷平均回收率为102.98%,RSD为0.71%;鸟苷平均回收率为99.20%,RSD为0.26%;腺苷平均回收率为103.45%,RSD为0.59%。表明该方法准确度良好。
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按上述供试品溶液的制备方法和测定条件,测定10批次地龙配方颗粒和对照药材中次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷的含量,结果见表3。
表 3 4种成分的含量(n=3)
样品 含量(mg/g) 总含量(mg/g) 次黄嘌呤 肌苷 鸟苷 腺苷 S1 4.457 4 7.805 0 1.596 1 0.689 2 14.547 7 S2 0.740 0 4.770 9 0.999 3 0.596 0 7.106 2 S3 1.037 5 2.323 6 0.386 8 0.814 2 4.562 1 S4 1.322 1 6.257 1 0.605 1 1.145 1 9.329 4 S5 1.070 8 4.487 3 0.993 1 2.222 9 8.774 1 S6 1.063 5 3.836 9 0.452 8 1.431 2 6.784 4 S7 1.444 6 5.775 1 0.839 6 1.077 7 9.137 0 S8 1.038 5 3.095 7 0.606 9 0.161 3 4.902 3 S9 3.672 3 6.932 4 1.332 5 0.477 3 12.414 5 S10 1.200 1 2.132 3 0.325 4 0.537 2 4.195 0 对照品 0.2526 1.8422 0.2962 0.0308 2.4218
Determination of multi-index components and quality evaluation of Dilong Formula Granules
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摘要:
目的 建立同时测定地龙配方颗粒中次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷含量的HPLC方法,结合测定结果和HPLC指纹图谱对地龙配方颗粒进行质量评价。 方法 采用Thermo AcclaimTM120 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,流速0.6 ml/min,柱温25 ℃,检测波长254 nm,对10批次样品进行4种成分含量测定和HPLC图谱采集;对所得图谱应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》进行分析评价。 结果 次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷成分在各自范围内线性关系良好(r≥0.999 9),平均加样回收率99.20%~102.98%,RSD 0.26%~0.71%;10批样品中4种成分含量范围分别为:0.740 0~4.457 4 mg/g、2.132 3~7.805 0 mg/g、0.325 4~1.596 1 mg/g、0.537 2~2.222 9 mg/g;不同厂家地龙配方颗粒HPLC图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.91。 结论 该方法可用于地龙配方颗粒中次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷等核苷类成分的含量测定;HPLC指纹图谱可用于地龙配方颗粒的质量评价;不同厂家生产的地龙配方颗粒的HPLC指纹图谱相似度较高,但次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷成分的含量差异较大。 Abstract:Objective To establish the method for the simultaneous determination of hypoxanthine, inosine, guanosine and adenosine in Dilong formula granules by HPLC and compare the fingerprints of Dilong formula granules from different manufacturers by HPLC chromatogram. Methods The contents of hypoxanthine, inosine, guanosine and adenosine were determined by Thermo AcclaimTM120C18 column (4.6 mm×250 mm 5 μm). The mobile phase was acetonitrile-water. Gradient elution with flow rate of 0.6 ml/min was used. Column temperature was 25 ℃. Detection wavelength was 254 nm. 10 batches of samples were tested. The HPLC chromatogram were compared and analyzed by using the similarity Evaluation system of chromatographic fingerprint of traditional Chinese Medicine (version 2012.130723). Results The linear ranges for the detection of hypoxanthine, inosine, guanosine and adenosine showed good linear relationships within their own ranges (r≥0.999 9). The average recoveries were 99.20%~102.98% with RSD of 0.26 %~0.71%. The contents of 4 components in 10 batches of samples were 0.740 0~4.457 4 mg/g, 2.132 3~7.805 0 mg/g, 0.325 4~1.596 1 mg/g, 0.537 2~2.222 9 mg/g respectively. The similarity between HPLC chromatogram and control fingerprints of Dilong formula granules from different manufacturers was greater than 0.91. Conclusion The method could be used to determine the contents of hypoxanthine, inosine, guanosine and adenosine in Dilong formula granule. HPLC fingerprints could be used to evaluation the quality in Dilong formula granule. The similarity of HPLC fingerprints from different manufacturer production of Dilong formula granule is high, but 4 contents in composition are difference. -
Key words:
- Dilong formula granule /
- fingerprints /
- hypoxanthine /
- inosine /
- guanosine /
- adenosine /
- quality evaluation
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表 1 梯度洗脱表
时间 (min) 流动相比例(%) 流动相A 流动相B 0~15 2 98 15~25 2~3 98~97 25~30 3~8 97~92 30~40 8~20 92~80 40~50 20 80 50~55 20~50 80~50 55~60 50~100 50~0 60~63 100 0 63~68 100~2 0~98 表 2 4种核苷类成分线性关系
组分 回归方程 相关系数 线性范围(μg/ml) 次黄嘌呤 Y=1.168 2X−0.004 5 0.999 9 0.605 2~60.520 0 肌苷 Y=0.605 0X+0.071 9 0.999 9 1.382 4~138.240 0 鸟苷 Y=0.705 3X+0.031 7 0.999 9 0.338 2~33.820 0 腺苷 Y=0.808 0X+0.029 1 0.999 9 0.350 2~35.020 0 表 3 4种成分的含量(n=3)
样品 含量(mg/g) 总含量(mg/g) 次黄嘌呤 肌苷 鸟苷 腺苷 S1 4.457 4 7.805 0 1.596 1 0.689 2 14.547 7 S2 0.740 0 4.770 9 0.999 3 0.596 0 7.106 2 S3 1.037 5 2.323 6 0.386 8 0.814 2 4.562 1 S4 1.322 1 6.257 1 0.605 1 1.145 1 9.329 4 S5 1.070 8 4.487 3 0.993 1 2.222 9 8.774 1 S6 1.063 5 3.836 9 0.452 8 1.431 2 6.784 4 S7 1.444 6 5.775 1 0.839 6 1.077 7 9.137 0 S8 1.038 5 3.095 7 0.606 9 0.161 3 4.902 3 S9 3.672 3 6.932 4 1.332 5 0.477 3 12.414 5 S10 1.200 1 2.132 3 0.325 4 0.537 2 4.195 0 对照品 0.2526 1.8422 0.2962 0.0308 2.4218 -
[1] 孙源源, 施萍. 借助中药配方颗粒推进中药国际化的对策研究[J]. 中草药, 2013, 44(8): 929-934. [2] 国家药监局批准颁布第一批中药配方颗粒国家药品标准[EB/OL]. [2022-06-27]. https://www.nmpa.gov.cn/yaowen/ypjgyw/20210429094401110.htm. [3] 关于中药配方颗粒国家药品标准(第二批)的公示-国家药典委员会[EB/OL]. [2022-06-28]. https://www.chp.org.cn/gjyjw/zy/16007.jhtml. [4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 127. [5] 杜航, 孙佳明, 郭晓庆, 等. 地龙的化学成分及药理作用[J]. 吉林中医药, 2014, 34(7): 707-709. [6] 黄帅, 徐风, 杨平, 等. 地龙的HPLC特征图谱研究[J]. 中国药房, 2015, 26(21): 2971-2974. [7] 孙洁, 田芳, 毛润乾, 等. 广地龙饮片的HPLC特征图谱及5个核苷类成分的测定[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(11): 2010-2019. [8] 关水清, 周改莲, 董婧婧, 等. HPLC同时测定广地龙中5种核苷类成分含量[J]. 广西师范大学学报(自然科学版), 2020, 38(3): 85-91. [9] 吴文如, 李薇, 赖小平. HPLC法测定不同产地地龙中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷的含量[J]. 中国药师, 2011, 14(7): 914-917. [10] 周恒, 曹依敏, 苗水, 等. HPLC法测定沪地龙中7个核苷类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(1): 97-103. [11] 季倩, 高守红, 张汉明, 等. HPLC法测定各沪产地龙和广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶和尿苷的含量[J]. 第二军医大学学报, 2015, 36(4): 443-446. [12] 王莎莎, 曲悦, 薛大权, 等. 地龙药材的质量标准提升研究[J]. 中国药房, 2019, 30(17): 2379-2383. [13] 卢绮雯, 李坚, 何琳. 高效液相色谱法测定地龙配方颗粒中次黄嘌呤的含量[J]. 时珍国医国药, 2007, 18(9): 2200-2201. [14] 何琳, 龙晓英, 谢礼新, 等. 地龙配方颗粒的质量标准研究[J]. 中成药, 2007, 29(8): 1173-1177.