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乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤,居女性癌症发病率的首位,是引起女性死亡的主要原因之一[1]。乳腺癌最常用的联合化疗可降低复发率,但引起的肿瘤细胞多药耐药和严重的不良反应限制了其临床疗效。中医药已被广泛用于癌症的治疗,可通过提高肿瘤对药物的敏感性、调节机体免疫功能,增强化疗效果,改善患者预后[2]。其优势主要体现在中药作用多靶点、多途径而产生广泛的生物活性和较低的毒性,现已被用作乳腺癌在内的多种癌症的替代疗法[3]。
苦参(Sophora flavescens)味苦性寒,始载于《神农本草经》,具有清热燥湿、杀虫、利尿的功效。苦参的主要化学成分包括生物碱、黄酮类、苯丙素、萜类、甾体、有机酸和挥发油等。其中苦参生物碱占3%,苦参黄酮占1.5%,是苦参的两类特征性成分,具有抗炎和抗肿瘤等药理作用,对急性髓系白血病、鼻咽癌、宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌等均显示出较好的抗肿瘤活性[4]。
目前关于苦参抗乳腺癌的研究多局限于探索苦参中某种活性成分作用于特定靶点或通路的抗乳腺癌的机制,未从整体角度阐释苦参抗乳腺癌的作用机制。因此,本研究基于网络药理学的方法,从中药作用的整体理论和中医药现代化的研究思路,探究苦参抗乳腺癌的作用,初步构建其主要活性成分作用于多靶点、多通路的作用机制网络,为开发基于苦参的抗乳腺癌新药和临床用药提供参考[5-6]。
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在TCMSP数据库中检索苦参共得到113个化合物,根据OB≥30%、DL≥0.18,结合ETCM数据库和国内外文献,最终确定结构明确的化合物36种,见表1。
表 1 苦参中36种活性化合物基本信息
分子编号 化合物名称 分子式 OB(%) DL MOL006596 大豆素 C20H18O5 97.27 0.76 MOL000456 菜豆素 C20H18O4 78.20 0.73 MOL001484 高丽槐素 C16H12O5 75.18 0.54 MOL004941 甘草素 C15H12O4 71.12 0.18 MOL000392 刺芒柄花素 C16H12O4 69.67 0.21 MOL006565 异苦参碱 C15H24N2O 68.68 0.25 MOL003648 山槐素 C16H12O5 65.83 0.54 MOL003627 槐果碱 C15H22N2O 64.26 0.25 MOL005944 苦参碱 C15H24N2O 63.77 0.25 MOL006627 12,13-去氢苦参碱 C15H22N2O 62.23 0.25 MOL006571 安纳基林 C15H20N2O 62.01 0.24 MOL006626 勒奇黄烷酮 G C20H20O6 60.97 0.40 MOL003680 槐定碱 C15H24N2O 60.07 0.25 MOL006566 12,13-去氢苦参碱 C15H22N2O 58.34 0.25 MOL006649 5α-羟基苦参碱 C15H24N2O2 55.42 0.28 MOL006630 去甲藤黄素 C15H10O6 54.93 0.24 MOL006628 白羽扇豆碱 C15H24N2O 52.71 0.24 MOL006623 苦参新醇 T C25H30O7 51.28 0.64 MOL006650 三叶豆紫檀苷丙二酸酯 C25H24O13 48.69 0.52 MOL006652 三叶豆紫檀苷 C22H22O11 48.53 0.74 MOL006604 异黄腐醇 C21H22O5 48.09 0.39 MOL005100 橙皮素 C16H14O6 47.74 0.27 MOL006613 苦参素 C16H14O5 47.62 0.38 MOL000098 槲皮素 C15H10O7 46.43 0.28 MOL003347 贯叶金丝桃素 C35H52O4 44.03 0.60 MOL003673 怀特酮 C20H18O5 42.80 0.36 MOL006622 苦参新醇 O C27H30O13 42.41 0.76 MOL001040 柚皮素 C15H12O5 42.36 0.21 MOL003676 槐胺碱 C15H20N2O 42.16 0.25 MOL006582 5α,9α-二羟基苦参碱 C15H24N2O3 40.93 0.32 MOL003542 8-异戊烯醇去甲基淫羊藿苷 C20H18O6 38.04 0.39 MOL006569 14β-羟基苦参碱 C15H24N2O2 37.26 0.29 MOL000006 木犀草素 C15H10O6 36.16 0.25 MOL006561 14α-羟基苦参碱 C15H24N2O2 35.73 0.29 MOL006570 9α-羟基槐胺碱 C15H22N2O2 35.23 0.29 MOL006563 9α-羟基苦参碱 C15H24N2O2 32.04 0.29 -
通过Swiss Target Prediction数据库预测共得到苦参活性成分的药物靶点509个,分别从TTD数据库、Drugbank数据库和OMIM数据库获取乳腺癌疾病靶点137个、244个和506个,去除重复项得到756个疾病靶点。从GeneCards数据库获得乳腺癌疾病靶点15230个,保留分值≥4.38(2倍中位数)的疾病靶点3813个,合并4个数据库检索结果并删去重复项,得到275个乳腺癌相关靶点。采用Venny 2.1软件,绘制苦参活性成分靶点与乳腺癌疾病靶点韦恩图,得到70个共有靶点(图1)。
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根据Cytoscape 3.7.2软件绘制的苦参抗乳腺癌“中药-活性成分-靶点”网络图的参数,筛选化合物Degree(度)值>5的节点,共筛选出24种核心活性成分,对应67个靶点,构建苦参抗乳腺癌的“中药-核心活性成分-靶点”网络图,如图2所示,每个参与互作的蛋白节点用一个圆圈表示,圆圈面积越大、颜色越深表示其Degree值越大,在药物-核心活性成分-靶点网络中,总共包括92个节点(其中包含1个药物节点、24个化合物节点和67个靶点节点)和 630 条边。按照Degree(度)值>5排列活性成分,从中可见木犀草素、槲皮素、菜豆素、甘草素等的Degree值最大,是苦参抗乳腺癌的核心活性成分。
为了更好地理解苦参抗乳腺癌的作用机制,按照Degree>5排列主要靶点,筛选出苦参抗乳腺癌的主要疾病靶点25个。用STRING数据库分析该网络参数,导入Cytoscape软件构建苦参蛋白互作网络(PPI)图,以明确生物分子间相互作用相关的重要靶蛋白(图3)。筛选出前12位的主要核心靶蛋白为EGFR、AKT1、ESR1、SRC、CYP19A1、AR、ABCB1、CDK1、ESR2、KDR、IGF1R和TOP1,各核心靶点的拓扑参数见表2。
表 2 核心靶点及其拓扑参数
靶点 蛋白名称 度 介数 紧密度 EGFR 表皮生长因子受体 16 1.28×10−1 7.86×10−1 AKT1 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 16 1.28×10−1 7.86×10−1 ESR1 雌激素受体 α 15 1.45×10−1 7.59×10−1 SRC 非受体酪氨酸激酶 Src 14 1.58×10−1 7.33×10−1 CYP19A1 细胞色素P450酶 19A1 11 0.95×10−1 6.47×10−1 AR 雄激素受体 10 0.32×10−1 6.47×10−1 ABCB1 ATP结合盒B亚家族成员1 9 0.65×10−1 6.11×10−1 CDK1 周期素依赖性激酶1 8 0.97×10−1 5.95×10−1 ESR2 雌激素受体β 8 0.18×10−1 5.95×10−1 KDR 血管内皮生长因子受体2 8 0.12×10−1 5.95×10−1 IGF1R 胰岛素样生长因子1受体 8 0.08×10−1 5.95×10−1 TOP1 DNA拓扑异构酶1 6 0.08×10−1 5.64×10−1 -
利用DAVID数据库对筛选出的12个关键靶点进行GO 功能富集分析,依据P<0.01,选出GO条目49个,其中生物过程(BP)29个,分子功能(MF)17个,及细胞组成(CC)3个。利用Hiplot在线平台对每个种类的前15个条目进行可视化分析。结果显示,苦参抗乳腺癌靶点的生物过程主要涉及蛋白自磷酸化、凋亡过程的负向调控、信号转导、细胞增殖、胞内雌激素受体信号通路等。分子功能涉及酶结合反应、一氧化氮合成酶调节活性、蛋白酪氨酸激酶活性、染色质结合反应、类固醇结合反应等。细胞过程涉及细胞核、细胞质膜和细胞膜(图4)。
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采用Hiplot在线平台对苦参关键作用靶点的KEGG信号通路进行富集分析,依据P<0.01筛选KEGG信号通路,以Gene Ratio代表目标基因中属于这个pathway的基因的数量在背景基因中所占的百分比,P 值以及调控通路上的基因个数来衡量 KEGG 富集程度,其中气泡颜色代表 P 值的大小,Gene Ratio代表富集的程度大小,气泡大小代表该通路中目标基因的数量,对前15个通路进行可视化分析,同时绘制苦参抗乳腺癌的基因-概念网络图。图5所示,按照P值从小到大富集的通路为内分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、肿瘤中的蛋白多糖、雌激素信号通路、乳腺癌、催乳素信号通路、黏着斑、Rap1信号通路、前列腺癌、VEGF信号通路、黏附连接、黑色素瘤、神经胶质瘤、ErbB信号通路、Ras信号通路;各信号通路对应的靶点包括SRC、IGF1R、ESR2、ESR1、EGFR、AKT1、KDR和AR(图6)。
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将24种核心活性成分的分子配体与12个靶点进行分子对接,得到275组分子对接数据。各靶点与核心活性成分对接能力的交叉数据如图7所示,图中红色越深,表示结合自由能越高,对接能力越强。结果显示活性成分与靶点EGFR、ESR1、CYP19A1、AR和ESR2等的对接能力较好。苦参中三种活性成分:甘草素、柚皮素和怀特酮与关键靶点AR结合的对接分数均大于10,结合能力较其他活性成分和靶点更强。
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CCK8检测结果显示,MCF-7细胞的存活率随着苦参提取物(KS)浓度的增大而降低,呈现药物浓度依赖性,当KS浓度达到20 mg/ml时,MCF-7细胞的存活率约为49%(图8A);绘制KS对MCF-7细胞作用的IC50曲线,计算IC50值约为17.3 mg/ml(图8B)。
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采用Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡形态变化,空白对照组的MCF-7细胞生长状态良好,细胞膜和细胞核形态正常,细胞核呈现均匀的淡蓝色弥散的荧光,未观察到明显凋亡的细胞形态;KS各浓度组Hoechst33342荧光强度较空白对照组显著增强(P<0.01),细胞形态发生变化,细胞数量略有减少,细胞呈不规则膨胀或皱缩,部分细胞膜破裂,细胞核呈碎块状致密浓染,且当KS浓度为20 mg/ml时,细胞凋亡特征最为明显,凋亡数量明显增加,荧光强度最强呈现蓝白色,表明 KS可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡(图9)。
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为验证苦参作用靶点的分子对接结果,采用免疫荧光染色检测MCF-7细胞内AR蛋白定位和表达水平。采用DAPI对细胞核进行染色,发现AR定位在细胞核内。与对照组相比,20 mg/ml 的KS浓度组,AR荧光强度显著最强(P<0.01),提示KS可显著上调AR蛋白的表达水平,与分子对接的结果一致(图10)。
Potential mechanism of Sophora flavescens against breast cancer via network pharmacology and molecular docking
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摘要:
目的 采用网络药理学和分子对接的方法分析苦参抗乳腺癌的主要活性成分及潜在分子机制。 方法 采用TCMSP、ETCM数据库和查阅国内外文献收集筛选苦参化学成分,通过Swiss Target Prediction 数据库对有效活性成分的靶点进行预测,通过GeneCards、TTD、Drugbank、OMIM收集乳腺癌相关靶点,根据Venny 2.1.0软件筛选出苦参抗乳腺癌疾病靶点;采用Cytoscape软件构建苦参-核心活性成分-靶点网络图,用 STRING数据库分析共有靶点,构建PPI网络图,通过DAVID数据库和Hiplot平台对关键靶点蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并采用Schrodinger软件对活性成分与靶点进行分子对接,同时采用分子生物学方法对关键靶点进行验证。 结果 从苦参中共筛选出结构明确的活性成分36个,筛选出70个苦参抗乳腺癌的疾病靶点,其中EGFR、AKT1、ESR1、SRC、CYP19A1、AR、ABCB1等12个核心靶点参与乳腺癌中内分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、雌激素等信号通路,且核心成分与关键靶点AR之间的结合能最高。体外细胞实验显示,苦参提取物可抑制乳腺癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡,上调AR蛋白的表达。 结论 苦参通过多成分作用于多靶点和多个信号通路,调节复杂的生物过程发挥抗乳腺癌的作用,苦参对AR蛋白的上调可能成为治疗乳腺癌新的治疗策略。 Abstract:Objective To analyze the main active components and potential molecular mechanism of Sophora flavescens against breast cancer based on network pharmacology and molecular docking. Methods The chemical constituents were collected and screened by TCMSP, ETCM database and literature review. The targets of active ingredients were predicted by Swiss Target Prediction database. Breast cancer-related targets were collected by GeneCards, TTD, Drugbank and OMIM. The anti-breast cancer targets of Sophora flavescens were screened by Venny 2.1.0 software. Cytoscape software was used to construct the network diagram of Sophora flavescens-key active ingredients-targets. STRING database was used to analyze the common targets, and PPI network diagram was constructed. GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of key target proteins were performed by DAVID database and Hiplot online platform. Schrodinger software was used to calculate the molecular docking between the active ingredients and targets. Molecular biological methods were used to verify the key targets. Results A total of 36 active components with clear structures were screened from Sophora flavescens. 70 anti-breast cancer targets of Sophora flavescens were screened out. 12 core targets including EGFR, AKT1, ESR1, SRC, CYP19A1, AR and ABCB1 participate in endocrine resistance, EGFR tyrosine kinase inhibitors and estrogen signaling pathways in breast cancer. Moreover, the docking score between the core component and the key target AR is the highest. In vitro experiments showed that the extract of Sophora flavescens can inhibit the proliferation of breast cancer cells, induce cell apoptosis and up-regulate AR protein expression. Conclusion It was revealed that Sophora flavescens plays an anti-breast cancer role by regulating complex biological processes through multiple components acting on multiple targets and signaling pathways. The upregulation of AR protein by Sophora flavescens may become a new therapeutic strategy for the treatment of breast cancer. -
Key words:
- Sophora flavescens /
- breast cancer /
- network pharmacology /
- molecular docking /
- androgen receptor
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表 1 苦参中36种活性化合物基本信息
分子编号 化合物名称 分子式 OB(%) DL MOL006596 大豆素 C20H18O5 97.27 0.76 MOL000456 菜豆素 C20H18O4 78.20 0.73 MOL001484 高丽槐素 C16H12O5 75.18 0.54 MOL004941 甘草素 C15H12O4 71.12 0.18 MOL000392 刺芒柄花素 C16H12O4 69.67 0.21 MOL006565 异苦参碱 C15H24N2O 68.68 0.25 MOL003648 山槐素 C16H12O5 65.83 0.54 MOL003627 槐果碱 C15H22N2O 64.26 0.25 MOL005944 苦参碱 C15H24N2O 63.77 0.25 MOL006627 12,13-去氢苦参碱 C15H22N2O 62.23 0.25 MOL006571 安纳基林 C15H20N2O 62.01 0.24 MOL006626 勒奇黄烷酮 G C20H20O6 60.97 0.40 MOL003680 槐定碱 C15H24N2O 60.07 0.25 MOL006566 12,13-去氢苦参碱 C15H22N2O 58.34 0.25 MOL006649 5α-羟基苦参碱 C15H24N2O2 55.42 0.28 MOL006630 去甲藤黄素 C15H10O6 54.93 0.24 MOL006628 白羽扇豆碱 C15H24N2O 52.71 0.24 MOL006623 苦参新醇 T C25H30O7 51.28 0.64 MOL006650 三叶豆紫檀苷丙二酸酯 C25H24O13 48.69 0.52 MOL006652 三叶豆紫檀苷 C22H22O11 48.53 0.74 MOL006604 异黄腐醇 C21H22O5 48.09 0.39 MOL005100 橙皮素 C16H14O6 47.74 0.27 MOL006613 苦参素 C16H14O5 47.62 0.38 MOL000098 槲皮素 C15H10O7 46.43 0.28 MOL003347 贯叶金丝桃素 C35H52O4 44.03 0.60 MOL003673 怀特酮 C20H18O5 42.80 0.36 MOL006622 苦参新醇 O C27H30O13 42.41 0.76 MOL001040 柚皮素 C15H12O5 42.36 0.21 MOL003676 槐胺碱 C15H20N2O 42.16 0.25 MOL006582 5α,9α-二羟基苦参碱 C15H24N2O3 40.93 0.32 MOL003542 8-异戊烯醇去甲基淫羊藿苷 C20H18O6 38.04 0.39 MOL006569 14β-羟基苦参碱 C15H24N2O2 37.26 0.29 MOL000006 木犀草素 C15H10O6 36.16 0.25 MOL006561 14α-羟基苦参碱 C15H24N2O2 35.73 0.29 MOL006570 9α-羟基槐胺碱 C15H22N2O2 35.23 0.29 MOL006563 9α-羟基苦参碱 C15H24N2O2 32.04 0.29 表 2 核心靶点及其拓扑参数
靶点 蛋白名称 度 介数 紧密度 EGFR 表皮生长因子受体 16 1.28×10−1 7.86×10−1 AKT1 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 16 1.28×10−1 7.86×10−1 ESR1 雌激素受体 α 15 1.45×10−1 7.59×10−1 SRC 非受体酪氨酸激酶 Src 14 1.58×10−1 7.33×10−1 CYP19A1 细胞色素P450酶 19A1 11 0.95×10−1 6.47×10−1 AR 雄激素受体 10 0.32×10−1 6.47×10−1 ABCB1 ATP结合盒B亚家族成员1 9 0.65×10−1 6.11×10−1 CDK1 周期素依赖性激酶1 8 0.97×10−1 5.95×10−1 ESR2 雌激素受体β 8 0.18×10−1 5.95×10−1 KDR 血管内皮生长因子受体2 8 0.12×10−1 5.95×10−1 IGF1R 胰岛素样生长因子1受体 8 0.08×10−1 5.95×10−1 TOP1 DNA拓扑异构酶1 6 0.08×10−1 5.64×10−1 -
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