下载:
-
METRNL（Meteorin-like）是一个新发现的分泌蛋白，为神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白。2014年，本实验室首次报道METRNL是一个新的脂肪因子，由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富，故也称为Subfatin[1]。10年来，我们对METRNL的功能进行了多方面的探索，并不断扩展METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现，该蛋白参与调节机体多种病理生理过程，比如：脂肪细胞METRNL可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症，从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗[2]；肠上皮细胞METRNL参与调节肠道抗菌肽的平衡[3]，且肠道METRNL缺乏会加重溃疡性结肠炎[4]；此外，METRNL促进小鼠皮肤创伤愈合[5]，并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍[6]。最近，我们新报道了血液METRNL的主要分泌来源是血管内皮细胞，并发现内皮细胞METRNL对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用[7]。在这些研究中，我们构建METRNL基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠，以及多种双基因敲除小鼠，并在体外细胞实验中充分利用METRNL重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室，全球其他多个实验室也展开了对METRNL的功能探索，并发现METRNL在能量代谢[8-9]、炎症[10-11]、心脏疾病[12-13]等多种病理生理过程中发挥积极作用。
尽管目前有很多关于METRNL的研究结果提示，该蛋白具有非常好的临床治疗潜力，但有关整体METRNL治疗学探索不多，尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场METRNL重组蛋白价格昂贵，而且我们前期研究结果发现：对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射1.75 µg METRNL重组蛋白后，血清METRNL在15 min后急剧升高（226 ng/ml），接着在4 h内迅速下降约90%。虽然在注射后24 h仍明显高于基础水平，但此时血中METRNL浓度已下降约97%[2]。因此，以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究METRNL的治疗学作用，尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面，对于一些已经体现METRNL治疗潜力的疾病（如动脉粥样硬化），疾病发展缓慢，短期给予METRNL重组蛋白很难起到治疗作用。
因此，本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL的小鼠作为METRNL的治疗学研究工具，并对该小鼠高表达METRNL的情况进行验证。
-
鼠尾DNA提取试剂盒（CW2094S）购自北京康伟试剂生物科技有限公司；5 × PrimeScript RT Master Mix（Takara 公司）；小鼠Tubulin抗体（ AT819，碧云天公司）；通用型RNA提取试剂盒Ⅱ（AG21022，艾瑞克生物科技）；Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA试剂盒（DY7867-05，R&D system公司）；山羊抗兔 IgG（ab175471）、山羊抗小鼠 IgG（ab216772）、抗METRNL抗体（ab235775）购自Abcam公司。
LightCycler96实时荧光定量PCR仪（Roche公司）；TP600PCR仪（Takara公司）；5200S化学发光分析系统（Tanon公司）。
-
人METRNL基因条件性过表达（R26-LSL-METRNL+/-）小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄 C57BL/6J 小鼠和Dppa-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。
所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒（IVC）系统中，温度（24±2）℃，相对湿度为40%~60%，饲养期间笼盒内保持清洁，小鼠在笼内自由活动、进食及饮水，动物房内照明系统为自动控制（12 h照明、12 h黑暗）。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》，并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。
-
将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm，剪碎，按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA之后，对目的基因进行PCR扩增，各引物序列见表1。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳，上样量为每孔6 μl，电泳条件为100 V，30 min，结束后进行拍照、分析。
-
将小鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（100 mg/kg），待小鼠处于深度麻醉后，打开其胸腔，自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液，并转移至1.5 ml EP管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织，放入组织冻存管扔进液氮速冻，待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。血液于室温静置2 h后离心：4 ℃，3000×g，15 min，分离血清，储存至−80 ℃超低温冰箱。
-
使用RNA提取试剂盒提取组织RNA，将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录，得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验，各引物序列见表2。
表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
取适量组织至2 ml高速离心管，加入蛋白裂解液后，使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管，离心：12000 × g，20 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中，进行蛋白浓度测定，剩余样品加入5 × 蛋白上样缓冲液，97 ℃变性10 min得到蛋白样品。
使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳条件为：150 V，60 min。使用PVDF膜进行转膜，转膜条件为100 V，60 min。
转膜结束后，使用快速封闭液封闭15 min，之后使用1×TBST缓冲液洗膜，5 min × 3次。加入一抗（1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液，使用1 × TBST缓冲液洗膜，5 min × 3次。加入二抗孵育液（1∶2 000稀释）常温孵育1 h，用1 × TBST缓冲液洗去二抗，5 min × 4次，结束后即可进行扫膜。
-
使用酶联免疫吸附实验试剂盒（DY7867-05）测定小鼠血清中的METRNL水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。
-
实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。两组间的比较使用双尾t检验，P<0.05视为差异有统计学意义。
-
本研究基于前期构建好的人METRNL基因条件性过表达小鼠（简称为R26-LSL-METRNL+/-小鼠）和Cre-LoxP技术，最终获得全身过表达人METRNL基因小鼠（简称为R26-L-METRNL+/-小鼠），具体构建策略如图1所示。
图 1 全身过表达人METRNL基因小鼠的构建策略
R26-LSL-METRNL+/-小鼠是前期通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建而成，即在其中一个Rosa26基因位点定点插入了CAG-LoxP-Stop-LoxP-METRNL-3XFlag-Wpre-pA表达框，且该表达框的终止密码子Stop两侧插有同向LoxP位点，可基于Cre-loxP系统在Cre酶的作用下，将LoxP位点之间的序列切除，只留下一个LoxP位点，最终达到人METRNL基因过表达的目的。在该小鼠的名称“R26-LSL-METRNL+/-”中，“+”表示有外源基因表达框的插入，“-”表示无外源基因表达框插入。
Dppa3-Cre小鼠是由Dppa3基因启动子介导Cre重组酶在全身表达的工具鼠，将R26-LSL-METRNL+/-小鼠和Dppa3-Cre小鼠杂交，可获得R26-L-METRNL+/-小鼠，具体繁殖方法如图2所示。其中，野生对照小鼠简写为R26-WT，表示在Rosa26位点没有外源人METRNL基因表达框的插入。
图 2 全身过表达人METRNL基因小鼠的培育流程
在繁殖过程中进行基因型鉴定时，需确认外源人METRNL基因表达框、终止密码子Stop和Dppa-Cre基因的存在情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定，外源性表达框阳性条带为699 bp，对应野生型序列条带为996 bp，终止密码子Stop阳性条带为408 bp，Cre基因阳性条带为100 bp。如图3所示，泳道1为R26-LSL-METRNL+/-小鼠，泳道2为R26-L-METRNL+/-小鼠，泳道3为R26-WT小鼠，泳道4为R26-L-METRNL+/-Cre小鼠，泳道5为R26-WT;Cre小鼠。
图 3 DNA电泳条带图
-
为验证R26-L-METRNL+/-小鼠是否存在人METRNL基因过表达，本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测了该小鼠各组织中人METRNL mRNA的表达情况。如图4所示，以 R26-WT 小鼠白色脂肪的人 METRNL mRNA表达量为1，肝、脾、肺、肾、白色脂肪和脑组织的相对表达量分别为94 008.6、618.1、88 537.3、68 897.9、32 386.3和24 816.5。该结果说明，R26-L-METRNL+/-小鼠在组织mRNA水平上实现了人METRNL基因过表达。
图 4 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL mRNA相对表达量（n=5～6，
$ \bar x \pm s $ ） -
接着，本研究提取各组织的蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证R26-L-METRNL+/-小鼠各组织中人METRNL蛋白表达情况。在该实验中，所用METRNL抗体可同时抗人和小鼠的METRNL蛋白。如图5所示，METRNL蛋白在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺和肌肉组织中的含量明显高于R26-WT小鼠，而在肾组织中METRNL抗体的结合效果不佳，且并未发现两组小鼠肾METRNL蛋白存在明显差异。该结果提示，R26-L-METRNL+/-小鼠在组织蛋白水平上实现了人METRNL基因过表达。
图 5 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL 蛋白表达情况
-
由于METRNL为分泌性蛋白，本研究最后使用ELISA方法测定R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠血清中人METRNL蛋白水平。如图6所示，可成功检测到R26-L-METRNL+/-小鼠血液中的人METRNL，浓度在1 100.3～1 579.3 pg/ml，而在R26-WT小鼠血液中检测不到人METRNL。该结果说明，R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白，提示R26-L-METRNL+/-小鼠实现了人METRNL基因过表达。
图 6 R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠的血清METRNL蛋白水平（n=5，
$ \bar x \pm s $ ） -
本研究利用Dppa-Cre小鼠和实验室前期构建的R26-LSL-METRNL+/-小鼠进行杂交繁殖，最终获得R26-L-METRNL+/-小鼠。该小鼠与R26-LSL-METRNL+/-小鼠都在Rosa26基因位点含有外源性基因表达框，不同的是在R26-L-METRNL+/-小鼠外源表达框中的终止密码子Stop被Cre酶成功切除，因此R26-L-METRNL+/-小鼠可实现全身细胞过表达人METRNL。
本研究从mRNA水平、组织蛋白水平和血清蛋白水平考察了R26-L-METRNL+/-小鼠过表达METRNL的情况。由于该小鼠插入的外源METRNL基因是人METRNL基因，因此在进行实时荧光定量PCR实验时，使用的是人METRNL引物和小鼠Gapdh引物。类似地，在ELISA实验中，使用的是检测人METRNL的试剂盒。由于没有特异性抗人的METRNL抗体，因此在蛋白免疫印迹实验中使用的是可同时抗人和小鼠的METRNL抗体，而内参使用的是抗鼠的Tubulin抗体。本研究结果显示，R26-L-METRNL+/-小鼠的各组织存在人METRNL mRNA高表达，虽然各组织的表达量有所波动，但都比R26-L-WT小鼠的表达量高几千倍甚至是数十万倍。蛋白免疫印迹实验结果显示，在R26-L-METRNL+/-小鼠的心、肝、脾、肺、肌肉组织存在明显升高的METRNL蛋白水平，但该实验中检测的METRNL蛋白量升高倍数不多，可能与使用的METRNL抗体可以同时抗人和小鼠的METRNL有关。另外，我们也注意到两组小鼠肾组织的METRNL蛋白水平并没有明显差异，并且两组条带都非常微弱，为确证实验结果，我们进行了重复实验，得出相同结果。经过分析可能是因为该METRNL抗体对肾组织蛋白的亲和力不是很高，导致检测出的蛋白绝对量都太低而使两组之间很难出现差异。在血清水平，本研究结果提示R26-L-METRNL+/-小鼠的血液中存在大量人METRNL蛋白，而R26-L-WT小鼠血中检测不到该蛋白，说明R26-L-METRNL+/-小鼠成功过表达人METRNL，并可以成功分泌至血液中。同时，该实验提示，本研究所使用的人METRNL ELISA试剂盒特异性比较好，可以清晰区别人和鼠来源的METRNL蛋白。
在小鼠培育过程当中，尚未发现R26-L-METRNL+/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面有何差异。根据图2中R26-L-METRNL+/-小鼠的培育方式，采用R26-L-METRNL+/-小鼠与C57BL/6J 小鼠杂交进行扩大繁殖和保种，基于孟德尔遗传定律，后代鼠中R26-L-METRNL+/-小鼠理论得率为50%，但实际中，我们发现该小鼠的得率仅为15%左右，远低于理论值。这一现象非常有趣，因为此前本实验室构建过多种基因工程动物模型，均没有发现类似偏离孟德尔遗传定律的现象，而这一现象是否与METRNL蛋白的全身性过表达有关，值得我们进一步研究。
Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene
-
摘要:
目的 构建全身过表达人METRNL基因的小鼠模型（R26-L-METRNL+/-小鼠）。 方法 基于Cre-loxP系统利用Dppa3-Cre小鼠和实验室前期构建的人METRNL基因条件性过表达（R26-LSL-METRNL+/-）小鼠进行交配繁殖，得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠。将该目标小鼠进行基因型鉴定，收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织，利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验，考察人METRNL基因在小鼠的表达情况。 结果 R26-L-METRNL+/- 小鼠的人METRNL在组织mRNA水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达，远高于野生对照组小鼠。 结论 R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功。 Abstract:Objective To generate mice with whole-body overexpression of human METRNL gene. Methods Based on Cre-loxP system, Dppa3-Cre mice were mated with Rosa26-LSL-METRNL knock-in mice（R26-LSL-METRNL+/-）to generate R26-L-METRNL+/- mice. The genotypes of the offsprings were identified, and tissues of the blood, heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, white adipose and muscle were collected. The expression of human METRNL gene in mice was investigated by quantitative real-time PCR, western blot and enzyme linked immunosorbent assay. Results Compared with wild type control mice, human METRNL in R26-L-METRNL+/- mice significantly expressed at both mRNA and protein levels in tissues, with abundant METRNL protein in blood. Conclusion The mouse model overexpressing human METRNL gene（R26-L-METRNL+/- mouse）was successfully constructed. -
Key words:
- METRNL /
- systemic overexpression /
- mouse
-
脓毒症是感染引起的机体反应失衡，继而导致的危及生命的多器官功能障碍[1]。脓毒症是对人类生命健康的威胁，是全球范围内感染致死的主要原因[2]。随着人口老龄化日益严重、多重耐药菌不断出现，脓毒症的发病率居高不下[3-4]，并以每年1.5%～13%的速率增长[5]。近年来新型冠状病毒肺炎在全球肆虐，研究发现病毒性脓毒症是新冠肺炎患者死亡的主要原因[6]，这进一步提升了我们对脓毒症的认识。中医药在新冠肺炎患者治疗过程中发挥了重要作用，使我们对中医药治疗脓毒症的优势和重要性有了新的认识[7]。中医没有对应脓毒症的概念，因此，根据不同的症状将脓毒症归为中医的温病、温毒和伤寒证型。本文针对脓毒症的病因病机和治疗方法两大方面对中医药治疗脓毒症的研究现状进行综述。
1. 中医病因病机
脓毒症（Sepsis)是一种复杂的临床综合征，现代学者对脓毒症的病机有不同的看法。刘清泉教授[8]认为脓毒症是因正气虚于一时，邪气暴盛而突发，这与《黄帝内经》[9]所记载邪之所凑，其气必虚的思想不谋而合，当正气充盈的存在于体内时，病邪就难以侵袭机体，这也体现了正气对于机体的重要性。脓毒症病因分为外来之毒和内生之毒[10]。外来之毒包括外感六淫之邪；内生之毒指痰、热、瘀、毒等病理产物。外邪入侵加上内生毒邪积滞于体内，气血运行不畅致使络脉瘀滞，气血无法滋养脏腑则引起脏腑虚损、阳脱阴竭[11]。另一种被大多数学者认可的理论是王今达教授的三证三法理论[12]，即毒热证与清热解毒法；瘀血证与活血化瘀法；急性虚证与扶正固本法。可以简单概述为毒邪入侵致使正邪争锋、正气亏损、毒邪阻塞于内、络脉受损、瘀血阻滞，最终致使正气亏虚不足以战胜邪气。临床上因正气是否充盈可以形成不同的转归，即正气尤盛者，见正邪交锋致使热毒炽盛；正气虚损至极，可见阴阳逆乱、厥脱之证。
2. 中医治法
2.1 清热解毒法
脓毒症在中医又称作热病、温病，由于热邪、温邪、火邪三者性质类似但又有所差异，可以概括为火为热之源、热为火之性、温为热之微。热邪的产生大致可以分为阳气过度亢盛致使与阴精失衡转为热邪，痰浊、瘀血等久郁化火，或为情志所伤过极化火，或阴虚阳亢致虚热内生[13]。不管是何原因产生的热邪，最终为了维持患者机体的阴阳平衡都应选择合适的清热药物。黄连解毒汤主要治疗实热火毒，三焦热盛之证。包括大热烦躁、热病吐血、神昏错语等症状。杨李旺等[14]发现黄连解毒汤可以有效降低脓毒症小鼠的炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α含量，并显著降低包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平，从而减轻肝脏损伤、提升脓毒症小鼠存活率。有研究发现脓毒症患者经大柴胡汤治疗后，机体外周血中炎症因子含量以及中医证候积分均大幅下降，机体加速恢复[15]。清瘟败毒饮主要治疗瘟疫热毒充斥内外气血两燔证，临床上常表现为身大热、口渴欲饮、性情狂躁、头痛等症状。而凉膈散主要治疗上中二焦积热，临床上常表现为面热头昏、谵语狂妄症状。清瘟败毒饮合凉膈散加减通腑能减轻炎症反应，缓解脓毒症患者的胃肠功能障碍从而增强临床疗效[16]。犀角地黄汤也是清热解毒的方剂，适用于由热毒炽盛于血分所致病证。病人热扰心神，身热谵语，热伤血络则致出血，蓄血瘀热、喜忘如狂，治以犀角地黄汤，清热解毒、凉血散瘀。梁志奇等[17]发现脓毒症患者经犀角地黄汤治疗后，凝血功能障碍得到改善、序贯器官衰竭评分降低，临床症状得到缓解。因此，在脓毒症的过度炎症反应期，合理应用清热解毒中药可以抑制患者体内的炎症因子释放，降低炎症反应，进而提高临床疗效。
2.2 通里攻下法
腑气不通时脏腑应以通为顺，而造成腑气不通的因素包括燥屎、瘀血等有形之邪，还包括气滞、湿热等无形之邪阻塞肠道脏腑[18]，从而出现发热、多汗、咳嗽痰黄、气促气喘、脘腹灼热疼痛等症状。中医认为脾胃为气血生化之源，后天之本，当出现上述症状时，脾胃已经受到了损伤。脾胃是保障机体能抵御外邪的不可或缺的要素，当脾胃功能受损时肠道蠕动减缓，肠道内的细菌随着肠道的微环境改变传至其他脏器[19]，引发机体的过度炎症最终导致脓毒症，这也与中医理论有胃气生，无胃气死相印证[20]。大黄具有泻下攻积、清热泻火的功效，是泻下药的代表类药物。有研究发现大黄能够有效调节脓毒症急性胃肠损伤，促使胃肠功能恢复正常，提高临床疗效[21]。而大黄的主要有效成分大黄素可以通过抗氧化VDR/Nrf2/HO-1途径改善肠道黏膜屏障损伤[22]。研究发现大黄提取物干预后的脓毒症大鼠，炎症因子释放和肾组织细胞凋亡减少，急性肾损伤得到改善[23]。大承气汤为寒下的重要方剂，方中大黄作为君药具有泄热通便，荡涤胃肠的功效，主治阳明腑实之证。陈敏等人[24]发现大承气汤可有效促进患者胃肠功能恢复，抑制炎症反应，从而改善脓毒症患者胃肠损伤，有利于患者的恢复。此外谭鑫等人[25]发现大承气汤联合乌司他丁可显著改善患者肠道功能，且安全性较高。徐洁如等[26]发现运用大黄附子汤，可以有效改善脓毒症伴胃肠功能紊乱患者的症状，且效果显著。因此，通里攻下法可以在脓毒症急性胃肠损伤时发挥较好的效果，达到增强肠道黏膜屏障功能、降低肠功能障碍、改善病情的目的。
2.3 活血化瘀法
有学者认为脓毒症的发生始终与瘀血有密切关系[27]。中医认为血为气之帅，气为血之母，这句话可以概括气与血的关系，一是指气存在于血液之中而行血，二是指气的化生以血为物质基础，气能行血，血能载气，气存在于血液之中[28]。正气不足导致运行血液无力，血行不畅最终导致瘀血。另一方面外来毒邪侵袭机体时，会阻滞气机，气机阻滞血流不畅则形成瘀血。现代中医治疗脓毒症最具代表性的药物是血必净注射液，在国家卫健委颁布的“新型冠状病毒肺炎诊疗方案”中将其列为重型和危重型新冠肺炎患者的推荐治疗药物。血必净注射液在血府逐瘀汤的基础上研制而成，包括五种常用的活血化瘀中药提取物，具有活血化瘀、疏通经络、溃散毒邪等功效。既往研究发现血必净注射液及其组分羟基红花黄色素A能有效改善脓毒症大鼠凝血功能障碍，提高生存率[29]。Wang等 [30]发现血必净注射液中的红花黄色素A、羟基红花黄色素A和无水黄色素B均可以抑制内毒素诱导的炎症反应、降低血浆中髓过氧化物酶的水平，并抑制佛波酯诱导的中性粒细胞胞外诱捕网释放，从而对内毒素血症肺损伤起到保护作用。Wang等[31]发现血必净注射液中的芍药苷和羟基红花黄色素A可以通过抑制IL-6及IL-1β的产生来调节脓毒症引起的心肌功能障碍，改善脓毒性休克。研究显示超过50%的脓毒症患者伴有凝血功能障碍，其预后与血小板的减少程度密切相关。李兵等[32]发现对脓毒症患者进行抗感染治疗的同时加用丹参多酚酸盐，能够缓解脓毒症患者凝血功能障碍，预防弥散性血管内凝血的出现。牡丹皮是一种常用的活血化瘀药物，Mei等[33]发现牡丹皮的主要活性成分丹皮酚可以通过上调miR-339-5p表达来减轻高迁移率族蛋白B1和IKK-β介导的炎症，降低炎症反应，保护脓毒症小鼠肾脏并提高存活率。因此，活血化瘀法不仅可以改善脓毒症凝血功能障碍，还可以抑制炎症反应，降低脓毒症病死率。根据脓毒症不同时期的辩证分型，笔者认为在脓毒症早期毒热内盛阶段可以加入凉血化瘀的中药，瘀象明显时，加入强效的赤芍、桃仁等化瘀解毒，出现正气亏虚致瘀时加入当归、生地等养血活血[34]。
2.4 扶正固本法
传统医学视正气为机体的防护壁垒，正气的充盈水平直接决定了机体在感受外邪时是否会发病。正气强盛时，即使感受了外邪，机体中的正气也能驱邪外出，这正是《黄帝内经》[10]中说的正气存内，邪不可干。然而，当正气虚损恰逢感染邪气，机体会变得无力抗邪，毒邪由表及里、由浅入深阻塞气机，致使气机逆乱，机体气血脏腑功能失常最终发展为脓毒症。脓毒症本质上属于本虚标实证，运用扶正固本的方法有助于抵御外邪，预防病情发展，调和阴阳。参附注射液、生脉注射液等是扶正固本的代表方剂。有研究表明参附注射液能够通过Notch信号通路调节Th17/Treg免疫平衡，缓解脓毒症小鼠的脾脏功能损伤和免疫抑制[35]。另一项研究发现参附注射液还可以抑制炎症，抑制基质金属蛋白酶1的过量表达,降低肺毛细血管通透性，改善氧合,减轻脓毒症大鼠肺部及全身的炎症反应[36]。此外有研究发现生脉注射液可在常规治疗的基础上提高重症脓毒症患者的存活率[37]。作为名贵补气药材的人参，其主要活性成分人参皂苷可以降低脓毒症小鼠体内的炎症反应，减轻组织损伤[38-39]。脓毒症属于本虚标实证，正气虚于一时而无力抗击外邪，因此，在脓毒症各阶段适时的使用扶正固本药物有助于恢复机体的正气，调和阴阳，改善机体状态，利于康复。
3. 讨论
脓毒症的发病机制涵盖了全身过度炎症反应、凝血功能障碍、组织损伤、免疫抑制等多方面，最终导致机体的多器官功能障碍。与此相符，中医药研究发现，脓毒症的病因病机与毒、热、瘀、虚等多个方面息息相关。根据脓毒症证型的不同，病机的着眼点也有所差别。临床上中医药疗法治疗脓毒症有清热解毒、活血化瘀、通里攻下、扶正固本四种策略，取得了较好的临床疗效。然而，由于脓毒症患者个体差异大、证型复杂,不同专家对脓毒症的认识尚存在分歧，脓毒症的中医诊治标准尚未完全统一，与此同时，在中药治疗的过程中由于药物成分复杂、作用靶点多样、有效成分含量存在不确定性，中药治疗脓毒症难以实现标准化。我们有必要对脓毒症的辨证论治进行更深入地研究，形成统一治疗标准，利用现代技术明确中药抗脓毒症的物质基础和作用靶点，为中医药疗法广泛用于抗脓毒症奠定工作基础。
-
图 5 R26-L-METRNL+/-小鼠各组织的METRNL 蛋白表达情况
A.心脏组织；B.肝组织；C.脾组织；D.肺组织；E.肾组织；F.肌肉组织 （n=3，$ \bar x \pm s $）*P<0.05，**P<0.01，与 R26-WT组比较。
图 6 R26-L-METRNL+/-小鼠及其对照小鼠的血清METRNL蛋白水平（n=5，
$ \bar x \pm s $ ）A.“METRNL浓度-吸光度”标准曲线（R2=0.992 9）；B.R26-L-METRNL +/-小鼠血清METRNL浓度 *** P <0.001，与 R26-WT 组比较。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 
下载: 导出CSV
表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG
下载: 导出CSV
-
[1] LI Z Y, ZHENG S L, WANG P, et al. Subfatin is a novel adipokine and unlike Meteorin in adipose and brain expression[J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20(4):344-354. doi: 10.1111/cns.12219 [2] LI Z Y, SONG J, ZHENG S L, et al. Adipocyte metrnl antagonizes insulin resistance through PPARγ signaling[J]. Diabetes, 2015, 64(12):4011-4022. doi: 10.2337/db15-0274 [3] LI Z Y, FAN M B, ZHANG S L, et al. Intestinal Metrnl released into the gut lumen acts as a local regulator for gut antimicrobial peptides[J]. Acta Pharmacol Sin, 2016, 37(11):1458-1466. doi: 10.1038/aps.2016.70 [4] ZHANG S L, LI Z Y, WANG D S, et al. Aggravated ulcerative colitis caused by intestinal Metrnl deficiency is associated with reduced autophagy in epithelial cells[J]. Acta Pharmacol Sin, 2020, 41(6):763-770. doi: 10.1038/s41401-019-0343-4 [5] XU T Y, QING S L, ZHAO J X, et al. Metrnl deficiency retards skin wound healing in mice by inhibiting AKT/eNOS signaling and angiogenesis[J]. Acta Pharmacol Sin, 2023, 44(9):1790-1800. doi: 10.1038/s41401-023-01090-x [6] HONG C, WANG Z, ZHENG S L, et al. Metrnl regulates cognitive dysfunction and hippocampal BDNF levels in D-galactose-induced aging mice[J]. Acta Pharmacol Sin, 2023, 44(4):741-751. doi: 10.1038/s41401-022-01009-y [7] ZHENG S L, LI Z Y, SONG J, et al. Endothelial METRNL determines circulating METRNL level and maintains endothelial function against atherosclerosis[J]. Acta Pharm Sin B, 2023, 13(4):1568-1587. doi: 10.1016/j.apsb.2022.12.008 [8] AMANO Y, NONAKA Y, TAKEDA R, et al. Effects of electrical stimulation-induced resistance exercise training on white and brown adipose tissues and plasma meteorin-like concentration in rats[J]. Physiol Rep, 2020, 8(16):e14540. [9] RAO R R, LONG J Z, WHITE J P, et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis[J]. Cell, 2014, 157(6):1279-1291. doi: 10.1016/j.cell.2014.03.065 [10] USHACH I, ARREVILLAGA-BONI G, HELLER G N, et al. Meteorin-like/meteorin-β is a novel immunoregulatory cytokine associated with inflammation[J]. J Immunol, 2018, 201(12):3669-3676. doi: 10.4049/jimmunol.1800435 [11] JUNG T W, LEE S H, KIM H C, et al. METRNL attenuates lipid-induced inflammation and insulin resistance via AMPK or PPARδ-dependent pathways in skeletal muscle of mice[J]. Exp Mol Med, 2018, 50(9):1-11. [12] REBOLL M R, KLEDE S, TAFT M H, et al. Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase[J]. Science, 2022, 376(6599):1343-1347. doi: 10.1126/science.abn3027 [13] LU Q B, DING Y, LIU Y, et al. Metrnl ameliorates diabetic cardiomyopathy via inactivation of cGAS/STING signaling dependent on LKB1/AMPK/ULK1-mediated autophagy[J]. J Adv Res, 2023, 51:161-179. doi: 10.1016/j.jare.2022.10.014 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 8173
- HTML全文浏览量: 2399
- PDF下载量: 40
- 被引次数: 0
