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冷损伤在冬季户外作业人员中常见，长时间冷暴露会造成不可逆性损伤甚至危及生命。目前，对冷损伤的研究主要侧重在肢端损伤的对症治疗，尚缺乏针对体温和机体功能下降的干预策略。冷暴露过程中，核心体温下降是导致冷损伤最直接的因素。核心体温降至35 ℃时，则损伤开始[1]。核心温度为33～35 ℃则发生轻度低温，降至28～32 ℃为中度低温、17～27 ℃为深度低温。核心体温下降将引起重要器官、组织发生系列生理和病理变化，造成不同程度的损伤[2]。然而，目前维持核心体温的主要方式为穿戴保暖装备[3]，有效维持核心体温的抗寒药物研究较少。因此，通过药物增加机体的产热作用，可能是预防冻伤的一种有效方法。
外界温度降低将导致基础产热无法维持体温恒定，继而发生颤抖性产热（shivering thermogenesis，ST）和非颤抖性产热（non-shivering thermogenesis，NST）[4]。与ST相比，NST可以持续产热且不会产生明显疲劳等不适感。棕色脂肪组织（brown adipose tissue，BAT）作为NST的最重要来源，在冷暴露中发挥着重要的调节产热能力[5]。当NST激活时，BAT线粒体内膜上的UCP1表达水平增多，线粒体中电子传递链断开ATP生成减少，使化学能转化为热能[6]，从而增加机体产热、维持核心体温[7]。
米格列醇（miglitol）为第二代半合成α-糖苷酶抑制剂[8]，结构与葡萄糖相似，通过延长餐后小肠中碳水化合物的吸收发挥降糖作用，为临床常用的口服抗糖尿病药物[9]。有证据表明，米格列醇有减脂作用[10, 11]，这可能与其改变肠道中短链脂肪酸的生成有关[12]。近年研究表明，米格列醇具有独立于延缓碳水化合物吸收的减重机制[13]。米格列醇抑制脂质积累的机制可能是通过增加脂肪组织产热实现[14]。因此米格列醇对BAT的能量消耗水平、产热激活以及体温调节作用机制值得进一步探讨。
本研究以诱导分化成熟的棕色脂肪细胞和冷暴露小鼠为研究对象，探究米格列醇对棕色脂肪细胞增殖和脂质消耗的影响，考察冷暴露小鼠体温以及产热通路关键蛋白的变化，为深入探究米格列醇产热作用机制提供理论依据，为冷损伤提供干预策略。
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CO2 培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；电热恒温水浴锅（DK-98-11，天津市泰斯特仪器有限公司）；水平层流洁净工作台（上海上净净化设备有限公司）；荧光倒置显微镜（日本IX71，Olympus公司）；酶标测试仪（ELX-800，上海伯乐生命医学产品有限公司）；动物肛温测定仪（ZS-DTY，北京众实迪创科技发展有限公司）；红外热成像仪（E5，美国菲力尔公司）；恒温实验动物冰箱（RXZ-0250，海尔公司）；电泳仪、转膜仪（北京六一仪器厂）；电泳凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）；
细胞培养及活性测定相关试剂：Ⅱ型胶原酶（北京索莱宝科技有限公司）；牛血清白蛋白（北京Biosharp公司）；HEPES（北京索莱宝科技有限公司）；红细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM 培养基（美国Hyclone公司）；FBS（美国Clark公司）；胰酶、胰岛素、3-异丁基-1-甲基次黄嘌呤（IBMX，纯度≥98%）、地塞米松（dexamethasone, Dex，纯度≥98%）、EDTA（美国Sigma公司），油红O染色试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司）。
蛋白印迹（Western blot）相关试剂：脂肪组织蛋白提取试剂盒（德国Invent公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Western blot相关试剂和抗体：甘氨酸、Tris-HCl缓冲液（pH 8.8）、Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）、20×TBS、Tween 20（北京索莱宝科技有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸铵（AP）（美国Sigma公司）；N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）（美国Amresco 公司）；30%丙烯酰胺（北京Biosharp公司）；UCP1抗体（英国Abcam公司）、PGC1α抗体（沈阳万类生物科技有限公司）；ECL化学发光底物（美国Bio-Rad公司）。
米格列醇（纯度≥98%，B25416，上海源叶生物科技有限公司）。
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新生SD大鼠（24 h内）10只，用于原代前棕色脂肪细胞的提取和培养。取健康昆明小鼠（18~22 g），随机分组，每组10只，分成空白对照组、冷暴露对照组、米格列醇组（40 mg/kg）、阳性对照组-全反式维甲酸组（ATRA，40 mg/kg），给药7 d。米格列醇和ATRA的给药剂量，结合临床常用最大给药剂量并参考其脂肪酸氧化及代谢的相关文献[15, 16]，并经过预实验确定。
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采用参考文献[17]的方法，从24 h新生SD（Sprague-Dawley）大鼠BAT中分离原代前棕色脂肪细胞。新生SD大鼠置75%乙醇中浸泡5 min，取出BAT，置预冷的PBS中剪碎置胶原酶Ⅱ（1.5 mg/ml）中，37 ℃消化30 min。消化后的组织匀浆经300目尼龙筛网过滤并离心（800 r/min×5 min），沉淀用红细胞裂解液重悬后再次洗涤和离心。分离得到前脂肪细胞接种于DMEM（含10%胎牛血清）培养基中，在37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞生长融合至80%~90%，更换为诱导分化液Ⅰ（含1 mmol/L Dex、0.5 mmol/L IBMX和1.67 mmol/L Insulin的DMEM培养液）培养48 h，再更换为诱导分化液Ⅱ（含1.67 mmol/L Insulin的DMEM培养液）培养48 h，于DMEM完全培养基中继续培养至细胞分化成熟、布满脂滴。
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采用参考文献[18]的方法，通过MTT实验评估米格列醇对棕色脂肪细胞活力的影响。原代前棕色脂肪细胞按照1×10 4个/孔接种于96孔板中。培养24 h后，分别向样品孔中加入米格列醇或ATRA，孵育24、48、72 h。然后加入MTT溶液（终浓度为0.5 mg/ml）继续孵育4 h。结束后，弃去MTT溶液，加入200 μl DMSO溶解甲臜，在490 nm下测定各孔的吸光度。
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采用参考文献[19]的方法，原代前棕色脂肪细胞接种于12孔板，分化成熟后，分别加入米格列醇及阳性药ATRA。48 h后，弃去培养液，细胞经10%中性甲醛溶液固定1 h后，加入油红O染色液，染色30 min。弃去染色液，双蒸水洗涤4次，拍照。各孔加入1 ml异丙醇萃取染色液，振荡10 min，在570 nm下测定各孔的吸光度A。脂滴消耗率=1−A样品/A对照。
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为了减少粪便对测定的干扰，小鼠在核心体温测定前12 h禁食。4 ℃和−20 ℃冷暴露1 h后，立即用红外热成像系统拍摄并测量体表温度，并用FLIR tools软件进行体表平均温度的调取和分析。在冷环境下测定不同时间的小鼠核心体温并记录。采用肛温仪测定小鼠的肛温作为核心体温，肛温仪的探头涂抹适量凡士林，插入直肠约1.5 cm，读数稳定后快速操作并记录数据。
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各组小鼠于给药7 d后，于−20 ℃恒温箱中冷暴露1 h取出至室温。3 h后测定小鼠足趾肿胀程度。
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采用脂肪组织/细胞蛋白提取试剂盒提取总蛋白，通过酶标仪进行蛋白定量。配置分离胶和浓缩胶，经过上样、电泳、转膜、封闭、抗体孵育和曝光成像，对蛋白表达水平进行分析。
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所有数据均以平均值±标准误（mean±SEM）表示，使用SPSS 17.0进行统计分析，采用GraphPad Prism 7.0（San Diego，USA）软件进行绘图。统计分析先对数据进行正态分布检验，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐性采用Tukey检验，方差不齐则采用Dunnett’s T3检验。以P<0.05为具有统计学意义。
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如图1所示，与空白对照组比较，根据参考文献[15, 20-22]中的给药浓度，本研究使用浓度分别为10、20、40 μmol/L的两种化合物处理原代棕色脂肪细胞，给药48 h、72 h后对细胞活力均无显著影响。说明选用40 μmol/L米格列醇和40 μmol/L阳性药全反式维甲酸并未影响脂肪细胞的增殖。
图 1 MTT法检测米格列醇对棕色脂肪细胞活力的影响（mean±SEM, n=3）
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通过油红O染色的结果可知（图2），米格列醇显著增加了棕色脂肪细胞内的脂滴消耗水平，说明米格列醇提高了脂肪细胞内脂质的利用，消耗了产热底物。
图 2 油红O染色检测米格列醇对棕色脂肪细胞脂质消耗的影响（mean±SEM, n=3）
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由红外热成像结果可知，给药7 d后的米格列醇显著提高了4 ℃冷暴露后小鼠的体表温度，也上调了核心温度。但对−20 ℃冷暴露后的体温并未有显著影响，见图3。
图 3 米格列醇对小鼠体表温度和核心温度的影响（mean±SEM, n=10）
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足趾肿胀程度可以反映小鼠寒冷损伤的程度，如图4所示，冷暴露对照组较空白对照组显著增加了小鼠的足趾肿胀程度，而预防给予米格列醇7 d可显著改善足趾肿胀程度，其改善作用较UCP1激动剂全反式维甲酸更明显。
图 4 米格列醇对小鼠足趾肿胀的影响（mean±SEM, n=10）
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由蛋白印迹结果可知，与冷暴露对照组相比，米格列醇给药后可显著增加棕色脂肪组织中UCP1表达水平，且PGC1α的水平也有上调（图5），但对UCP1的表达水平调控作用较PGC1α更显著。
图 5 米格列醇对棕色脂肪组织产热关键蛋白表达水平的影响（mean±SEM, n=10）
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本研究通过体内外实验证实米格列醇可以通过激活UCP1的产热活性、增加脂肪组织的脂质消耗，从而进一步增加小鼠冷暴露后的体温、改善冷暴露引起的足趾肿胀程度。
米格列醇作为α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过延缓肠道碳水化合物吸收而实现降血糖的药物，作用机制为竞争性的抑制小肠中的α葡萄糖苷酶，从而减少淀粉分解为葡萄糖并抑制葡萄糖的吸收。由此，米格列醇应在餐前或餐中服用才会发挥该药的效果。因此，较多研究将成比例的米格列醇加入饲料中，从而模拟该药临床应用方法给药[23]。然而，本研究主要揭示其独立于延缓碳水化合物吸收之外的减重机制，侧重于对棕色脂肪细胞以及冷暴露前后棕色脂肪组织的产热激活，因此本研究未将米格列醇与饲料混合喂食小鼠，而采用脂代谢相关文献灌胃给药的方法。
本研究采用全反式维甲酸作为阳性药，由于本课题前期工作中表明其结构具有和UCP1良好对接的特点[16]，且可显著增加UCP1的表达水平和脂肪产热[24]，因此选择作用机制相同的化合物全反式维甲酸作为阳性药物。
本研究中，米格列醇给药对4 ℃冷暴露小鼠的体温水平显著上调，但对于−20 ℃冷暴露后的改善作用并不明显，分析其原因可能与脂肪代谢底物产热不足以抵抗长时间更低的冷环境，且UCP1产热活性尚需进一步激活。
综上，本研究明确了米格列醇对于冷暴露过程中的体温调节作用和抗足趾肿胀的寒冷损伤作用，但其如何调控UCP1的产热活性及深入机制尚需后续进一步探讨。
Anti-frostbite effect of miglitol on cold-exposed mice through UCP1-mediated thermogenic activation
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摘要:
目的 探讨米格列醇调控棕色脂肪细胞能量代谢、改善冷暴露后小鼠寒冷损伤的作用及机制。 方法 将原代棕色脂肪细胞诱导成为成熟的脂肪细胞，通过MTT法考察米格列醇对棕色脂肪细胞活力的影响，采用油红O染色技术考察细胞给药后的脂滴消耗水平。在4 ℃、−20 ℃冷暴露过程中考察改善寒冷损伤的活性。将昆明小鼠随机分为空白对照组、冷暴露对照组、米格列醇组、全反式维甲酸组，重复给药 7 d后，应用红外热成像系统检测小鼠体表温度变化、肛温测定仪检测核心体温变化，通过足趾肿胀度考察寒冷损伤水平，蛋白印迹法检测棕色脂肪中的产热关键蛋白解偶联蛋白1（uncoupling protein 1, UCP1）和过氧化物酶体增殖活化受体γ 辅助活化因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α, PGC1α）的水平。 结果 与空白对照组比较，米格列醇给药组的棕色脂肪细胞脂滴消耗水平显著增加。米格列醇给药组小鼠冷暴露后体表温度和核心温度水平显著增加，且小鼠棕色脂肪组织内的UCP1和PGC1α水平显著增高，表明米格列醇能够激活产热通路关键蛋白UCP1和PGC1α，增加小鼠在冷暴露后的产热能力，改善足趾肿胀的损伤作用。 结论 米格列醇可通过激活产热通路的关键靶点UCP1、PGC1α促进棕色脂肪产热而发挥改善冷暴露小鼠冷损伤的作用。 Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of miglitol on regulating the energy metabolism of brown adipocytes by activating UCP1 and preventing cold injury in mice after cold exposure. Methods Primary brown adipocytes were induced into mature adipocytes, the effect of miglitol on the viability of brown adipocytes was investigated by MTT method, the lipid droplet consumption level of cells after drug administration was investigated by Oil Red O staining technology, and the level of UCP1, a key protein of thermogenesis in brown adipocytes, was detected by Western blotting. The activity of anti-frostbite was investigated in cold exposure at 4 ℃ and −20 ℃. KM mice, which were randomly divided into control group, cold exposure group, miglitol group and all-trans retinoic acid group, and after 7 days of repeated administration, the body surface temperature of mice was detected by infrared thermal imaging system, the anal temperature change was detected by anal thermometer, and the expression levels of UCP1 and PGC1-α in adipose tissue were detected by immunoblotting. Results Compared with the control group, the lipid droplet consumption and UCP1 expression levels in brown adipocytes in the miglitol group were significantly increased. The levels of body surface temperature and rectal temperature increased significantly after cold exposure, and the levels of UCP1 and PGC1α in the brown adipose tissue of mice increased significantly, which indicated that the miglitol could activate the critical proteins UCP1 and PGC1α of the thermogenesis pathway, increase the thermogenesis of mice after cold exposure, and thus improve the effect of cold injury for toe swelling. Conclusion Miglitol could play a role in improving cold injury and body temperature in mice by increasing the level of UCP1 and PGC1α, which are key targets of the thermogenesis pathway to promote the thermogenesis of brown fat. -
Key words:
- miglitol /
- brown adipose /
- thermogenesis /
- cold injury /
- UCP1
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多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性最常见的一种生殖内分泌疾病，其特征以生化或临床高雄激素血症、无排卵和卵巢多囊样改变等为主要表现[1-2]。流行病学显示PCOS在全世界范围内的总体发病率约为6%~20%[3]，而由PCOS引发的排卵障碍所致的不孕症占40%[4]。PCOS不仅影响女性的正常生殖功能，还会导致女性发生代谢系统方面的障碍，如高胰岛素血症、胰岛素抵抗，增加女性继发糖尿病、心血管疾病及子宫内膜癌的风险，对女性健康造成严重不良影响[2]。肥胖是PCOS发生的重要危险因素之一[5]。研究数据表明，28.3%的超重或肥胖的女性患有PCOS[6]，多达42%的PCOS患者超重或肥胖[7]。肥胖对PCOS的发展和进展产生显著影响，研究发现，脂肪细胞主要通过分泌脂肪因子，如IL-1、IL-6、瘦素、脂联素等，作用于相应的靶器官、靶组织、靶细胞，如卵巢、肾上腺等，刺激机体产生较多的雄激素，而雄激素又可通过抑制肾上腺素受体等导致体内脂肪分解减少，脂肪大量堆积在体内，导致体内高雄激素水平与肥胖之间形成恶性循环，严重影响PCOS患者的健康状况[3]。与普通女性相比，PCOS患者具有更高的肥胖倾向，且更容易出现腹部脂肪堆积[8]；而这种由于腹部脂肪堆积造成的中心性肥胖反过来又可加重PCOS患者的临床或生化表现，导致胰岛素抵抗、高雄激素血症、生殖功能异常等[9]。临床试验结果显示，若患者体质量减轻初始体质量的5%，其体内激素水平、血糖水平得以改善，同时，月经周期和排卵情况趋于正常化，这表明体质量减轻可增加患者排卵和妊娠的可能性[10]。
青蒿素（artemisinin，ART）是一种天然倍半萜内酯化合物，最初由2015年诺贝尔生理学或医学奖获得者屠呦呦从青蒿植物中提取出来并广泛用于抗疟疾治疗[11]；青蒿素还用于抗癌、抗炎药物等[12]。近年研究发现，青蒿素及其衍生物还具有预防肥胖的功效：在啮齿动物模型中，青蒿素及其衍生物通过调节p38MAPK/ATF2轴和Akt/mTOR途径等在脂肪生成过程中诱导脂肪细胞褐变，从而预防肥胖并改善肥胖相关的代谢紊乱[13]。Lee等[14]和Jang[15]体外实验数据表明，青蒿素及其衍生物可通过PPARγ途径抑制脂肪生成和脂肪因子的表达。本研究通过网络药理学方法和分子对接方法分析预测青蒿素可用于治疗PCOS的潜在靶点，旨在为深入研究其治疗的作用机制提供参考。
1. 材料和方法
1.1 青蒿素及PCOS靶点预测
通过Pubchem数据库[16]（
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）获得天然产物青蒿素的SMILES号，并将其输入Swiss TargetPrediction数据库[17]（http://www.swisstargetprediction.ch/ ）进行靶点预测，导出分析结果并保存；结合PharmMapper数据库[18]（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ ）预测的靶点，二者共同作为青蒿素的药物靶点，并将靶点导入Uniprot数据库[19]（https://www.uniprot.org/）进行靶点蛋白与基因名称转换。以“polycystic ovary syndrome”作为关键词检索，通过DisGeNET数据库[20]（https://www.disgenet.org/ ）、GeneCard数据库[21]（https://www.genecards.org/ ）进行疾病靶点预测。将搜集的青蒿素靶点和PCOS靶点分别导入Venny在线作图软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ ）绘制韦恩图，从而得到二者的共同靶点。1.2 PPI网络构建及核心靶点筛选
将共同靶点导入STRING数据库[22]（
https://cn.string-db.org/ ），物种选择“homo sapiens”，最低相互作用分数设置为“0.9”，隐藏游离点，其他保持默认设置，得到蛋白相互作用网络图（protein-protein interaction，PPI），将PPI网络图导入Cytoscape 3.9.1软件[23]，进行核心靶点筛选。1.3 富集分析
将共同靶点导入DAVID数据库[24]（
https://david.ncifcrf.gov/ ），分别进行基因本体（gene ontology，GO）功能、京都基因与基因组百科全书（kyotoencyclopodia of genes and genomes，KEGG）通路分析，其中GO功能富集内容从分子功能（molecular function，MF）、生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)三部分进行逐一分析，并利用微生信在线作图软件（http://www.bioinformatics.com.cn/ ）将分析结果进行可视化。1.4 药物-疾病-靶点-通路网络图构建
将所获得的青蒿素、PCOS作用靶点及信号通路分别导入Cytoscape软件构建药物-疾病-靶点-通路网络图。
1.5 分子对接
从Pubchem数据库中下载青蒿素的2D结构，在RCSB PDB数据库[25]（
https://www.rcsb.org/ ）中下载核心靶蛋白结构。利用Chem3D软件对青蒿素的2D结构进行转化，用Pymol软件对核心靶蛋白结构进行初步处理，再用Auto Dock Tools软件做进一步加氢等处理，并将处理的核心靶蛋白保存为“pdbqt”格式进行分子对接，最后利用Pymol软件对分子对接结果进行可视化处理[26-27]。2. 结果
2.1 青蒿素及PCOS作用靶点
通过数据库检索共得到青蒿素潜在作用靶点229个，PCOS疾病靶点1292个。利用在线作图软件将青蒿素作用靶点与PCOS疾病靶点进行韦恩图分析，得到二者的交集靶点90个，如图1所示。
2.2 PPI网络构建及核心靶点筛选
将交集靶点导入String数据库，绘制PPI网络关系图，如图2所示，其中包括网络节点90个，边235条。将共同靶点导入Cytoscape 软件进行核心靶蛋白筛选。如图3所示。综合节点度值及本研究相关度排名靠前的分别为AKT1、ESR1、MMP9、PPARγ、MMP2（见表1）。
图 2 蛋白互作网络图注：图中节点代表蛋白质，其中红色节点表示查询蛋白质，其他颜色节点表示与查询蛋白只有相互作用的其他蛋白质，空白节点表示未知3D结构的蛋白质，填充节点表示已知3D结构，连线代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系表 1 青蒿素作用于PCOS的核心靶点基因名称 节点度值 排名 ALB 66 1 AKT1 60 2 CASP3 53 3 SRC 51 4 EGFR 50 5 HSP90AA1 49 6 MMP9 48 7 ESR1 48 8 HRAS 47 9 PPARγ 43 10 ERBB2 41 11 MMP2 37 12 2.3 富集分析
将得到的90个交集靶点导入DAVID数据库进行GO富集分析，富集结果分别根据基因富集程度进行排序，其中BP前10个条目主要涉及细胞增殖调控、蛋白质磷酸化和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物学过程，MF前10个条目主要与蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白结合和酶结合等分子功能有关，CC前10个条目主要在细胞膜、胞质和胞核等部位富集，如图4所示。KEGG富集分析共筛选到162条信号通路，根据基因富集程度排序，前20个条目主要涉及PI3K/Akt、MAPK、Ras、内分泌抵抗等信号通路，如图5所示。
2.4 药物-疾病-靶点-通路网络图构建
将相关靶点及通路文件导入Cytoscape 3.9.1软件，得到药物、疾病、靶点和通路之间的关系图（见图6）。
2.5 分子对接
分子对接结果显示，青蒿素与核心靶蛋白AKT1、MMP9、ESR1、PPARγ、MMP2之间均存在结合位点。青蒿素与核心靶蛋白的最低结合能分数见表2，结合能越低表示结合活性越高，化合物越容易与该靶点结合。其中青蒿素与核心靶蛋白之间的氢键连接可视化情况如图7所示。
表 2 青蒿素与核心靶点分子对接结果化合物 核心靶点 最低结合能（kJ/mol） 结合位点 青蒿素 MMP9 −8.2 ARG-143 AKT1 −7.9 HIS-152 ESR1 −7.9 THR-460 PPARγ −7.7 PRO-426、GLN-430、
LEU-431、PHE-432MMP2 −6.4 HIS-190 3. 讨论
PCOS主要通过卵巢病变、机体内分泌紊乱等方式影响女性的生育能力[28]。目前关于PCOS的发病机制和病因尚未具体阐明，多认为是遗传和环境因素相互作用的结果；由于病因机制不明，临床治疗尚无统一方案，多采用对症治疗，如基础生活方式调整，通过控制饮食、增加体育运动以降低体质量和缩小腰围，增加机体胰岛素敏感性，降低胰岛素及雄激素水平，同时辅以相应的药物治疗，以减轻症状。
本研究基于临床发现，PCOS患者多伴有肥胖表现，遂以肥胖与PCOS之间的潜在联系为出发点，同时基于课题组现有天然活性物质进行药物筛选，经文献调研发现青蒿素有抗肥胖效果，继而通过网络药理学方法分析预测青蒿素可能用于治疗PCOS的潜在作用靶点，并探讨其可能用于临床治疗PCOS的可行性。
本研究根据PPI网络拓扑属性分析筛选出核心靶点AKT1、MMP9、ESR1、PPARγ、MMP2等，推测这些可能是青蒿素用于治疗PCOS的潜在作用靶点。有研究表明[29]，AKT1在颗粒细胞增殖中起关键作用，而其表达量的高低主要与机体雄激素水平异常有关，这会导致PCOS患者卵巢颗粒细胞正常功能受损。此外，AKT1还具有组织特异性，Song等[30]通过小鼠实验发现脂肪组织中AKT1的选择性抑制可以刺激白色脂肪组织发生褐变，从而可增加机体能量消耗发挥抗肥胖的效果。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一种锌依赖性酶，可由卵巢产生，在卵泡发育和PCOS的发病机制中起重要作用[31]；研究发现PCOS女性患者MMPs活性增加，其血液、卵泡液和颗粒细胞中MMP9、MMP2水平升高，高水平的MMPs会通过改变细胞外基质重塑，引起异常卵泡闭锁和卵巢基质组织增加，从而对患者的排卵和生育能力产生不良影响[32]。Barbara等[33]在对正常女性和肥胖女性血清样本中的MMP浓度对比发现，体质量增加可影响女性血清中的MMP浓度。ESR是维持卵巢颗粒细胞分化、卵泡和卵母细胞生长发育以及排卵功能的关键受体[34]；ESR1是一种核激素受体，作为转录因子的激活剂发挥作用[35]；Schomberg等[36]在ESR基因敲除的小鼠模型中发现ESR基因缺失会导致卵泡发育受阻，以致卵泡闭锁及无排卵现象发生。Artimani等[37]在评估PCOS患者颗粒细胞中ESR基因表达时发现，ESR mRNA的表达显著低于排卵功能正常女性，认为ESR基因的显著减少可作为颗粒细胞成熟缺陷或卵泡发育停滞的指标。ESR1也是一种与线粒体功能相关的基因，研究发现其在肥胖女性脂肪组织中有减少，Zhou等[38]在人类和啮齿动物实验中证实，脂肪组织中ESR1的表达与脂肪量呈负相关，同时ESR-α作用的降低还会损害线粒体功能，促进肥胖增加，破坏机体代谢稳态。PPARγ是一种调节脂肪细胞发育和葡萄糖稳态的核受体，主要在脂肪组织中表达[39]；此外在发育阶段的卵巢颗粒细胞中表达，并可受黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平的影响来调节机体雌激素分泌和卵巢功能[40]。此外，Lee等[41]在PCOS患者颗粒细胞中发现PPARγ mRNA表达水平下调。胡卫红等[42]研究发现PPARγ 在PCOS患者的卵巢颗粒细胞的表达异常可能与PCOS的高雄激素血症有关。
GO生物学过程富集分析表明，青蒿素治疗PCOS的生物学功能可能与细胞增殖调控、蛋白质磷酸化和RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程有关。KEGG通路富集分析表明，青蒿素可能通过作用于PI3K/Akt、MAPK、Ras、癌症等信号通路发挥治疗作用。有研究表明，PI3K/Akt信号通路参与调节细胞增殖分化和迁移，在卵泡发育过程中对卵巢颗粒细胞的生长和凋亡起着关键作用[43]，在PCOS患者颗粒细胞中与氧化应激相关的凋亡多伴随PI3K/Akt信号下调[44]。此外，研究表明PI3K/Akt信号通路还可以调节脂肪细胞的脂解与分化，从而参与机体脂质代谢[45]。MAPK信号通路参与调节多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控等，且该通路与卵巢颗粒细胞类固醇激素的合成有关[46]。研究发现，在PCOS女性中，异常的MAPK信号传导可导致代谢信号缺陷和卵巢雄激素分泌异常增多[47]。
为进一步探索青蒿素在PCOS治疗中的潜在分子机制，本研究将天然产物青蒿素和5个与PCOS密切相关的核心靶蛋白进行分子对接验证，寻找二者之间存在的最佳结合位点以及评估它们之间的结合能力。验证结果显示，青蒿素与核心靶蛋白之间能够较好结合。
综上所述，本研究采用网络药理学方法分析天然物青蒿素用于治疗PCOS的潜在作用靶点，其机制可能主要涉及PI3K/Akt、MAPK、内分泌抵抗等信号通路。这些信息为后续青蒿素用于治疗PCOS的实验验证提供了重要理论依据。
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