Determination and optimization of extraction process of the content of plantamajoside in plantain
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摘要: 目的 建立车前草中大车前苷的含量测定方法,并优选其提取工艺。 方法 采用HPLC法测定大车前苷的含量,并通过正交设计考察乙醇浓度、用量及提取时间对车前草中大车前苷提取工艺的影响。 结果 大车前苷在12.51~125.10 μg/ml浓度范围内,线性关系良好(r=0.999 6),平均加样回收率为98.57%,RSD为1.45%;最佳提取工艺为10倍量60%乙醇提取2次,每次1 h。 结论 本研究建立的含量测定方法简便、准确、重复性好;优选的提取工艺稳定可行。Abstract: Objective To establish a method for determination and optimize the extraction process of the content of plantamajoside in plantain. Methods Plantamajoside content was determined by HPLC.The effects of ethanol concentration, ethanol amount and extraction time on the extraction of plantamajoside from plantain were studied by orthogonal design. Results The calibration curve was linear (r=0.999 6) over the range of 12.52-125.10 μg/ml.The average recovery was 98.57% (RSD=1.45%).The optimum extraction process was as follows:60% ethanol, 10 times volumes, extracted 2 times, 1 h each time. Conclusion The established method was simple, accurate and reproducible for determination of the content of plantamajoside in plantain.The optimal extraction process was stable and feasible.
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Key words:
- plantain /
- plantamajoside /
- HPLC /
- extraction process /
- orthogonal test
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肺结核是我国青藏高原多发病[1]。2000年以来,全国肺结核发病率普遍下降,由峰值96.3/10万降至 59.3/10万。与之相反,肺结核发病率在青海地区呈总体上升趋势,由48.7/10万(2002年)上升至140.3/10万(2018年),远高于全国平均水平[2-5]。肺结核是一种慢性肺部疾病,由结核分枝杆菌引起,其特点是肺部损伤伴有干酪样化、坏死和纤维化,导致空腔形成,该空腔富含氧气和坏死组织物质,因此它成为包括念珠菌在内的多种生物的生长场所[6]。自然界中念珠菌种类众多,但绝大多数的侵袭性念珠菌感染由白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌,这5种最常见的病原体引起[7]。在临床治疗中,高原肺结核患者的特点为:症状重、病程进展快、合并症多;且肺结核与肺部念珠菌感染的症状类似,但肺部念珠菌感染症状更隐匿,易漏诊和延迟治疗,影响患者治疗及预后[8]。该研究选取2020年3月1日至2020年12月31日青海省第四人民医院(本院)3 012例住院肺结核患者为调查对象,分析肺结核合并肺部念珠菌感染分布特点及耐药率,为临床诊疗提供理论依据。
1. 资料与方法
1.1 临床资料
调查对象为2020年3月1日至2020年12月31日本院3 012例住院肺结核患者。男性1 895例,占62.92%;女性1 117例,占37.08%;年龄18~94岁,平均(39.30±5.5)岁;患者主要临床症状表现为胸痛、发热、咳痰、咯血、气短及呼吸困难等。
1.1.1 纳入标准
①经实验室和影像学检查,检测值均符合中华医学会结核病学分会肺结核的诊断标准及《内科学(第6版)》中肺部感染[9]的诊断标准;②签署知情同意书。
1.1.2 排除标准
①免疫性疾病相关患者;②肺部肿瘤等其他肺部疾病患者。本研究经医院伦理委员会批准,符合伦理规范,同意本研究的开展。
1.2 试验方法
收集确诊肺结核患者痰液样本,经过念珠菌培养2次,结果均为念珠菌属阳性感染。采用梅里埃公司VITEK-32-YBC细菌分析系统进行念珠菌鉴定,对检出念珠菌进行药敏试验,结果证明白念珠菌为质控菌株。
1.3 统计分析
使用SPSS21.0软件对数据进行统计分析,分析数据结果,率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 不同类型肺结核患者念珠菌感染分布特点
3 012例肺结核患者中合并念珠菌感染的患者为283例,感染率为9.40%,详见表1。
表 1 不同类型肺结核患者念珠菌感染率肺结核分型 调查例数 感染例数 感染率(%) χ2 P 浸润型 903 38 4.21 44.629 <0.001 纤维空洞型 2 044 242 11.84 血行播散型 65 3 4.62 2.2 肺结核患者感染念珠菌构成比
在283例念珠菌感染患者中,白念珠菌占79.86%,见表2。
表 2 肺结核患者痰培养念珠菌构成比念珠菌 株数 构成比(%) 白念珠菌 226 79.86 光滑念珠菌 35 12.37 热带念珠菌 10 3.53 克柔念珠菌 5 1.77 近平滑念珠菌 2 0.71 其他 5 1.77 合计 283 100.00 2.3 感染念珠菌对抗真菌药耐药率
该研究选取10种抗真菌药物,对白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌进行药敏试验,详见表3。
表 3 肺结核患者感染念珠菌对抗真菌药物的耐药率(%)抗真菌
药物白色念珠
菌耐药率光滑念珠
菌耐药率热带念珠
菌耐药率克柔念珠
菌耐药率近平滑念珠
菌耐药率两性霉素B 0.87 0.00 0.00 15.23 0.00 氟胞嘧啶 7.36 0.00 0.00 14.78 0.00 制霉菌素 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 咪康唑 0.50 0.00 0.12 0.26 0.00 伊曲康唑 78.35 63.89 0.00 45.63 0.00 伏立康唑 77.06 65.63 7.63 56.36 0.00 氟康唑 81.90 63.33 0.00 100 0.00 酮康唑 0.50 0.00 0.15 0.00 0.00 卡泊芬净 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 米卡芬净 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 3. 讨论
3.1 青藏高原肺结核合并念珠菌感染的主要类型
在该研究调查的3 012例肺结核患者中,念珠菌感染283例,占总数的9.40%,其中纤维空洞型242例,浸润性38例,血性播散型3例。纤维空洞型肺结核对肺部产生慢性破坏,干酪化、纤维化及坏死组织导致肺部空洞形成和支气管扩张,空洞内大量干酪样坏死物质形成,支气管扭曲变形,导致肺组织结构完整性被破坏,局部抵抗力下降,为结核杆菌和包括念珠菌在内的多种真菌提供下行感染的滋生地,即使在结核杆菌被消灭的情况下,念珠菌也经常会定植于肺部空腔并持续破坏已经扩张的支气管,导致纤维空洞型感染为肺结核合并念珠菌菌感染的主要类型[10]。
3.2 青藏高原肺结核合并念珠菌感染的主要因素
该次调查研究主要针对高海拔地区,秦毅等[1]通过青藏高原疾病流行分析,发现青海地区肺结核的发病率从2002−2018年持续上升,至2018年全省结核病发病率为全国平均水平的2.3倍。肺结核发病率高考虑与藏区自然条件艰苦,医疗条件、经济水平落后,群众防疫宣传教育普及率低,人民防病意识较差,人群总体疫苗接种率较低等因素相关。青藏高原地广人稀,近年来,随着交通状况改善,群众社会交往增多,但该地区海拔高,低气温时间长,春、秋、冬季社会活动多聚集于室内,温暖的室内环境导致结核菌更易通过飞沫传播。该疾病在临床上具有致死率高、传染力强、致病性高、病程长等特点,且易反复发作、难治愈[11]。高海拔地区肺结核治愈率仅有58.3%,仅达到平原地区治愈率的60%[1],且极其容易发生二重感染,尤其以合并念珠菌感染为主。高海拔肺结核合并念珠菌感染的原因主要包括:①肺结核患者处于慢性炎症状态,结核杆菌导致呼吸道黏膜损伤,长期服用抗结核药抑制正常菌群,故会引起菌群紊乱,条件致病菌生长,且高海拔地区慢性支气管炎、肺心病高发,并发症较多,使用广谱抗菌药,更易导致肺部念珠菌感染。肺结核合并咯血等重症患者,临床惯用糖皮质激素治疗,该类药物可以抑制中性粒细胞及巨噬细胞吞噬念珠菌孢子的能力,对免疫过程中的诸多环节有抑制作用,进而引发肺部念珠菌感染[10]。②高海拔地区基础医疗薄弱,患者用药依从性差,而肺部念珠菌感染症状隐匿,患者出现症状反复后才转入本院,导致延迟治疗,错失最佳治疗时机,治疗难度增大,病情控制差,且病情危重,更易导致念珠菌感染,严重影响患者治疗及预后。③该研究资料分析结果显示,肺结核合并念珠菌感染发生率约为9.40%,而相关文献报道发生率为3.95 %[12],考虑肺结核患者机体状况差,能量消耗增加,免疫力低,高海拔地区长期缺氧,气候干冷,天气变化剧烈,温差幅度大,容易快速削弱机体抵抗力,导致习服衰变[13],器官功能进一步损伤,口咽部白念珠菌通过被破坏的呼吸道黏膜下行至肺部,产生较多的细胞外酶,损害机体细胞,导致念珠菌感染率高。
3.3 青藏高原肺结核合并念珠菌感染的耐药性分析
在肺结核合并念珠菌感染的283例患者中,共检出6种念珠菌,其中白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌3种主要的念珠菌检出271例,占病原体分离株的95.76%,与孟笑等[14]报道一致,符合国内大多数医院病原菌感染特征,但感染率相对偏高,其中,白念珠菌226株,占79.86%,光滑念珠菌35株,占12.37%,热带念珠菌10株,占3.53%。肺结核合并念珠菌感染的主要致病菌为白念珠菌,与张海燕等[15]、黄国军等[16]和程玲[17]报道一致,其他两种致病菌为光滑念珠菌、热带念珠菌。上述念珠菌耐药性实验结果显示,白念珠菌对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的耐药率为70%以上;光滑念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的耐药率可达60%以上;克柔念珠菌对氟康唑固有耐药,对伏立康唑、伊曲康唑耐药率为40%以上;氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑为治疗肺部真菌感染的常用药物,抗菌谱广,临床使用广泛,患者反复长期使用,且药物半衰期长,可能是导致这几种药物耐药率高的原因,且存在交叉耐药的情况。两性霉素B、氟胞嘧啶等药物耐药率低,虽然抗真菌效果相对较好,但对肝肾功能影响较大,两性霉素B会导致高热、寒颤、恶心呕吐等不良反应,氟胞嘧啶治疗周期长,使用剂量较大,且需要与其他药物联合使用,不是临床治疗念珠菌感染的一线用药[18-19],但可以作为在唑类或棘白菌素不能使用时的治疗方案。棘白菌素对大多数念珠菌具有高度活性,且棘白菌素在本院使用量较少,考虑为棘白菌素类无耐药菌株产生的可能因素。
综上所述,抗念珠菌药物的选择需根据本地药敏结果和结核患者实际情况进行综合分析,得出更适合患者的有效治疗方案,从根源上使青藏高原地区肺结核合并念珠菌感染的发病率得到遏制。
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