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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，以对称性多关节滑膜炎为主要临床表现，呈慢性、进行性及侵袭性，病情逐渐加重，最终可出现残疾，甚至累及脏器和神经系统而危及生命。目前RA 发病机制尚不明确，治疗主要是非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情抗风湿药及生物制剂等对症治疗或改善病情治疗，但存在不同程度的疗效限制、治疗费用高或长期应用副作用较大等问题。昆仙胶囊作为“九五”国家中医药重点科技攻关项目成果，由昆明山海棠、枸杞子、菟丝子及淫羊藿等组成。已有的研究提示，原方中昆明山海棠有较好的抗炎镇痛与免疫调节作用，枸杞子、菟丝子与昆明山海棠配伍可有效降低其毒性，而淫羊藿与昆明山海棠配伍则可增强免疫调节作用，改善骨损伤。总之，该方有较好的抗炎镇痛、免疫调节及保护关节软骨的作用，可减轻滑膜炎症、修复关节软骨的损伤，毒副作用也相对较低[1-2]。临床研究显示，昆仙胶囊用于治疗RA患者效果显著，能有效缓解关节疼痛、晨僵症状，改善关节功能活动，不仅有较好的疗效，安全性也得到验证[3-6]。
近年来，RA发病机制的研究取得了较快进展，有关昆仙胶囊治疗RA的作用机制有待进一步挖掘研究。网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点（nodes）进行多靶点药物分子设计的新学科。本研究基于网络药理学技术，依托相应数据库和软件，构建“药物-成分-关键靶点-信号通路”网络，科学系统地分析昆仙胶囊对 RA 的作用机制，以期为后续的实验研究奠定基础。
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本研究通过计算系统生物学实验室的中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索中药枸杞子、菟丝子、淫羊藿的活性成分，利用本草组鉴（即HERB数据库，http://herb.ac.cn/）检索昆明山海棠的活性成分。再根据化合物口服生物利用度（OB）与类药性指数（DL）筛选活性成分，其中，OB 阈值设为OB≥30%， DL阈值设为DL≥0.18 [7-8] 。最终得到81种有效活性成分，并通过TCMSP数据库获取其对应的靶点。
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以rheumatoid arthritis为关键词，检索 Genecards（https://www.genecards.org/）数据库及OMIM（https://omim.org/）数据库，收集 RA 的相关靶点。
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为探明药物活性成分靶点与疾病靶点之间的关系，将两部分靶点通过 Venn图制作网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）进行交集得出公共靶点，并导入Cytoscape3.7.2软件构建化合物-靶点网络。Cytoscape 软件的核心架构是网络，其中的每个节点代表基因或分子，而节点与节点之间的连接代表这些基因或分子之间存在相互作用，节点的度值代表网络中节点与节点相连的数目。
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为进一步探究靶点蛋白之间的相互作用，将所得的药物与疾病的公共靶点上传至在线STRING10.5软件(http://string db.org)，构建蛋白-蛋白相互作用网络模型。其参数修改物种为人（homosapiens），其他参数保持默认设置，获取PPI网络。
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利用Cytoscape软件中的ClueGo功能对公共靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析，其中，GO富集分析分为细胞组成、生物过程以及分子功能 3个部分。设定阈值P<0.05，保存富集分析的结果并将其可视化。
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使用TCMSP和HERB数据库检索枸杞子、菟丝子、淫羊藿及昆明山海棠的化合物共 384个：其中枸杞子有188个化合物，菟丝子有29个化合物，淫羊藿有130个化合物，昆明山海棠有37个化合物。依据OB≥30%且DL≥0.18筛选出化合物共131个：其中，枸杞子有45个，菟丝子有11个，淫羊藿有23个，昆明山海棠有7个。去除重复后，发现昆仙胶囊中活性成分81个，再通过TCMSP获取对应的药物成分靶点913个，删除重复后得到228个。部分活性成分见表1。
表 1 昆仙胶囊部分活性成分
成分代码 化合物名称 OB(%) DL MOL000006 木犀草素（luteolin） 36.16 0.25 MOL000098 槲皮素（quercetin） 46.43 0.28 MOL000211 迈林（mairin） 55.38 0.78 MOL000296 赫达拉汀（hederagenin） 36.91 0.75 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 49.6 0.31 MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol） 36.91 0.75 MOL000359 谷甾醇（sitosterol） 36.91 0.75 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 41.88 0.24 MOL000449 豆甾醇（stigmasterol） 43.83 0.76 MOL000622 甘露聚糖（magnograndiolide） 63.71 0.19 MOL000953 胆固醇(cholesterol) 37.87 0.68 MOL001323 谷固醇α1(sitosterol alpha1) 43.28 0.78 MOL001494 甘露醇 (mandenol) 42 0.19 MOL001495 亚油酸乙酯（ethyl linolenate） 46.1 0.2 MOL001510 24-表氨酯（24-epicampesterol） 37.58 0.71 MOL001558 芝麻素（sesamin） 56.55 0.83 MOL001645 乙酸亚油酯（linoleyl acetate） 42.1 0.2 MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL001792 甘草苷元（liquiritigenin） 32.76 0.18 MOL001979 羊毛甾醇（lanosterol） 42.12 0.75 -
通过 Genecards 数据库得到 RA 靶点4465，通过OMIN数据库得到RA相关靶点41个。通过交集去除重复靶点，共得到RA相关靶点4 494个。
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利用 Venn 图制作网站将昆仙胶囊活性成分对应的 228 个靶点与 RA 对应的4494 个靶点进行交集，获得162个共有靶点（图1）。将 162个共有靶点导入 Cytoscape 3.7.2 软件，构建“化合物-靶点”的网络图并进行可视化分析（图2）。网络图包含65个化合物节点、162个靶点节点（公共靶点）和227条边，用绿色表示枸杞子的活性成分，紫色代表淫羊藿的活性成分，红色表示昆明山海棠的活性成分，黄色代表公共活性成分，橘色代表菟丝子的活性成分，蓝色代表靶点。连接活性成分与靶点的边表示两者之间具有相互作用。依据网络拓扑学性质可知，节点较多的化合物或药物靶点在整个网络中可能起到关键的作用，因此本研究筛选节点度较大的节点进行分析。
图 1 昆仙胶囊活性成分靶点与RA疾病靶点的公共靶点
图 2 昆仙胶囊主要成分-靶点网络
排名前5位的活性成分分别为槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素，分别能与103个、44个、36个、32个、31个靶点蛋白发生作用。排名前5位的靶点分别为孕酮受体（PGR）、前列腺素过氧化物合酶2（PTGS2）、前列腺素过氧化物合酶1（PTGS1）、盐皮质激素受体基因（NR3C2）、雄激素受体（AR），分别能与34个、32个、19个、18个、13个化合物发生作用。
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应用STRING软件构建PPI网络(图3)，此网络图中通过162个公共靶点得出，共有边84条，同时得到网络中关键靶点的频次。根据“度值>均值”筛选出关键节点20个，包括：IL-6、IKBKB、FOS、EGFR、EGF、CXCL8、CHUK、CCNB1、MYC、IL4、IL1B、VEGFA、JUN、CCND1、BCL2L1、CDKN1A、CASP8、STAT3、IL10、AKT1。度值排名前5位的靶点分别是AKT1、IL10、STAT3、CASP8及CDKN1A，可能为昆仙胶囊治疗RA的关键靶点。
图 3 昆仙胶囊靶蛋白PPI网络图
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GO生物过程（图4）主要包括：活性氧代谢过程的调控、正调控血管生成、凋亡信号通路的负调控、细胞对化学应激的反应等；分子功能（图5）包括：激酶活性的调节、肽酶活性的调节、DNA结合转录因子活性的正调控、激酶调节活性等；细胞组成（图6）包括：囊腔、宿主细胞内部分、突触前膜固有成分等；KEGG富集分析（图7）主要包括：IL-17信号通路、乙型肝炎、催乳素信号通路、麻疹等，其中，IL-17信号通路的占比最高，其次为乙型肝炎。
图 4 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的生物过程（P<0.05）
图 5 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的分子功能 (P<0.05)
图 6 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的细胞组成(P<0.05)
图 7 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的KEGG富集分析（P<0.05)
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RA致残率较高，是对健康危害较大的风湿病之一。昆仙胶囊由昆明山海棠、枸杞子、菟丝子及淫羊藿等中药组成，治疗RA疗效显著，但具体作用机制尚不十分明确。本研究借助网络药理学方法，获得昆仙胶囊治疗RA的主要活性分子及相关的靶点基因，进行GO 功能富集和 KEGG 功能分析，预测其治疗RA可能的物质基础和作用机制，为后续研究提供思路和依据。
从“化合物-靶点”的网络图可以看出，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素是昆仙胶囊中治疗RA的主要活性成分。槲皮素是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，临床研究提示，单用槲皮素治疗的RA患者晨僵、疼痛和活动后疼痛明显减轻，疾病活动评分（DAS）和健康评估问卷（HAQ）得分降低，有良好的治疗效果[9]。槲皮素能调节核转录因子κB（NF-κB）通路；抑制TNF-α、IL-1β、IL-17和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的水平；减少炎症细胞向关节部位募集来缓解RA的炎症[10]。槲皮素可降低基质金属蛋白酶 2（MMP-2）的表达和活性，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移[11]；促进RA成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡和抑制 FLS的迁移和侵袭来减轻 RA[12-13]。此外，调节破骨/成骨细胞和Th17/Treg平衡可能是槲皮素的另一种调节RA的机制[14]。木犀草素具有良好的抗炎活性，能明显降低胶原诱导性关节炎大鼠足跖的炎性肿胀程度，潜在抑制RA NLRP3炎性小体过表达、降低caspase-1、RANKL、VEGF和HIF-1α蛋白表达并增强OPG蛋白表达起到骨关节保护作用[15]。山奈酚拮抗bFGF / FGFR3 / RSK2轴可有效降低胶原诱导性关节炎小鼠的临床和组织学评分。山奈酚发挥抗关节炎作用的主要机制是抑制RA FLS增殖和迁移以及显著抑制Th17分化和破骨细胞生成[16]。β-谷甾醇是植物甾醇的重要组成成分，具有抗炎、调节人体甾体激素、抗氧化及抗肿瘤等作用[17]。研究显示，含有β-谷甾醇的白术醇提物具有显著的抗炎作用，可明显降低佐剂型关节炎大鼠血清和组织中的 TNF-α、C-反应蛋白和 IL-2 的含量[18]。研究证实，雷公藤甲素又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，具有较为显著的抗炎作用，RA病人用药后关节肿痛明显减轻，有很好的治疗效果。研究提示，雷公藤甲素可通过调节细胞因子、酶类、核转录因子 B 的表达，抑制炎症因子分泌，抑制血管的生成和诱导细胞的凋亡，保护软骨和基因调控等方面发挥抗 ＲA 药理作用[19]。
靶点PPI网络图提示，AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A等可能是昆仙胶囊治疗RA的关键靶点。现有研究提示，蛋白激酶B1(AKT1) 与RA滑膜成纤维细胞生成有关[20]，IL-10 在RA 患者血清中存在异常高表达，IL-10具有多种免疫功能，可以抑制炎症和细胞免疫反应，加强与适应性免疫和清除功能相关的耐受性，抑制由单核细胞和巨噬细胞产生的促炎因子[21]。STAT3 是一个关键性 RA致病因子，能够抑制成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡，促进 T 细胞存活及抗体产生，受促炎因子调控而失衡的 STAT3 信号可导致慢性滑膜炎的产生，抑制STAT3 的磷酸化对缓解关节炎症状、促进 FLS凋亡意义重大[22]。Caspase-8在滑膜抗原呈递细胞中发挥功能，通过控制RIPK3的作用来调节对炎症刺激的反应，这种微妙的平衡维持了关节内的稳态[23]。RA患者滑膜组织和成纤维样滑膜细胞（HFLS）中CDKN1A下调。若CDKN1A过表达可显著抑制HFLS的增殖和侵袭，并下调肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-6-的表达，上调了IL-10的表达[24]。
通路富集分析结果表明，昆仙胶囊治疗 RA的作用可能主要与干预IL-17、乙型肝炎及催乳素等信号通路有关，尤其是IL-17信号通路占比最大，达到57.89%。IL-17信号通路是细胞外信号引起细胞核内反应的通道之一，ACT1作为IL-17信号通路的衔接蛋白，与其关键底物TRAF6结合，激活下游NF-κＢ、JNK等核内基因信号通路，诱导炎性细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，继而促进RA滑膜细胞增殖和活化，参与并加重RA病情[25]。RA和牙周炎是影响全世界人群的两种常见的慢性炎症性疾病。两种条件之间的关联一直是许多研究的重点，试图探索这种关联的潜在机制。催乳激素除了促乳作用外，在免疫和炎症中具有多种作用。一些数据表明，滑膜和牙周组织中的催乳素水平显著增加，并且这种增加与疾病活动和组织破坏有关。干预催乳素相关的通路，可能给RA的治疗带来新的机遇[26]。
综上所述，昆仙胶囊可能是通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素等主要成分，作用于AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A等多个靶点，调节IL-17信号通路、乙型肝炎及催乳素等信号通路，从而抑制炎症反应、调节免疫功能、促进FLS凋亡和抑制FLS迁移和侵袭等以治疗 RA。本研究提示，昆仙胶囊治疗 RA 呈现出多成分、多靶点、多通路协同作用优势，为后续的实验研究和临床应用提供了依据。
致谢 感谢海军军医大学中医系博士研究生蔡孟成在网络药理学方面给予的技术支持及靶点筛选方面的意见与建议。
Mechanism of Kunxian capsule in the treatment of rheumatoid arthritis based on network pharmacology
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摘要:
目的 采用网络药理学方法，探讨昆仙胶囊治疗类风湿关节炎（RA）的分子靶点及可能的作用机制。 方法 利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）结合本草组鉴（HERB）检索昆仙胶囊所含中药的化学成分，并依据 TCMSP 数据库的口服生物利用度（OB）和类药性指数（DL）筛选出主要有效活性成分，并获取其对应的靶点。通过 Genecards数据库与OMIM数据库筛选出 RA 的靶点，利用 Venn图制作网站获取药物与疾病的共同靶点，运用Cytoscape构建“活性成分-靶点”网络；使用 String 数据库绘制靶蛋白相互作用（PPI）网络，利用Cytoscape软件中的ClueGo功能对公共靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析。 结果 该研究共筛选出昆仙胶囊的有效活性成分81个，作用靶点913个，去除重复得到228个。从GeneCard数据库与OMIM数据库中获得RA的靶点4494个，通过交集获得公共靶点162个。揭示了槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇及雷公藤甲素等5种成分是昆仙胶囊中的主要活性成分，AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A可能是该药治疗RA的关键靶点。GO及KEGG富集分析结果显示，昆仙胶囊干预RA的作用机制主要与活性氧代谢过程的调控、激酶活性的调节、IL-17信号通路等有关，涉及感染、炎症及免疫的重要生物过程和信号通路。 结论 本研究从网络药理学角度，初步探讨了昆仙胶囊治疗RA的物质基础和作用机制，提示了其多成分、多靶点、多途径的整体调节特点，为后续分子生物学实验研究提供了思路与依据。 Abstract:Objective To explore the molecular targets and associated potential pathways of Kunxian capsule in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) based on network pharmacology. Methods The constituents of Kunxian capsule were searched by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database, Analysis Platform (TCMSP) and a high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine（HERB）.The potential active ingredients and targets were retrieved based on TCMSP database. RA related gene targets were retrieved through GeneCards database and OMIM database. Venn online software was used to obtain the common target of drugs and diseases. The “compound-target” network diagram was constructed with Cytoscape software. String database was used to draw the protein interaction (PPI) network. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis of the intersection network were conducted by Bioconductor Database. Results 81 active ingredients and 913 targets were identified. 228 targets were obtained after removing the duplicates. 4494 target genes directly related to RA were obtained from the GeneCards databases and OMIM databases. 162 genes were obtained from the intersection of component-target and disease-target. It was revealed that five ingredients including quercetin, luteolin, kaempferol, β-sitosterol and triptolide are the main active ingredients in Kunxian capsule. AKT1, IL-10, STAT3, CASP8 and CDKN1A may be the main therapeutical targets. The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that the mechanism of Kunxian capsule is mainly related to the regulation of reactive oxygen metabolism, the regulation of kinase activity, and IL-17 signaling pathway. The important biological processes and signaling pathways include infection, inflammation and immunity. Conclusion This research preliminarily explored the mechanism of Kunxian capsule in the treatment of RA by network pharmacology and suggested that the overall regulation is characterized by multi-components, multi-targets, and multi-channels. It provided some ideas for further molecular biology experiments. -
Key words:
- Kunxian capsule /
- rheumatoid arthritis /
- network pharmacology
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根据世界卫生组织最新统计显示，心脑血管疾病如心肌梗死、缺血性卒中等是目前全球最主要的致死原因[1]。血小板作为动脉血栓形成的一项重要介质，其高反应性是导致动脉血栓事件发病率和病死率增加的重要危险因素[2, 3]。尽管现有的抗血栓药物可有效减少心血管疾病患者的动脉血栓形成，但出血的不良反应也极大限制了它们的使用。因此为了开发出能在抗血栓形成效果和出血之间取得更好平衡的新一代安全有效的抗血栓药物，迫切需要了解导致血管血栓闭塞的致病机制，开展新靶标的基础研究[4, 5]。
分泌蛋白可由机体各种组织器官分泌，在生理、病理过程中起关键作用，具备良好的研究前景，有望开发成为心脑血管疾病防治的药物、靶标、生物标志物[6, 7]。近期有多项研究表明部分分泌蛋白大量存在于血液之中，可直接作用于血栓调控[8-10]。Metrnl是本实验室前期通过构建限食模型筛选获得的一种与神经营养因子Metrn同源的新型分泌蛋白[11]。迄今为止，多项研究结果表明Metrnl在免疫炎症及代谢性心脑血管疾病中发挥重要作用，例如调节胰岛素敏感性、维持肠道稳态、对抗动脉粥样硬化、促进血管新生等[12-17]。此外，临床研究显示，血液Metrnl水平与冠心病、心肌梗死、缺血性脑卒中等多种血栓性疾病存在相关性[18-20]。以上结果均提示Metrnl在心脑血管疾病病理过程中扮演重要角色，但是Metrnl在血栓形成特别是其对血小板的直接作用尚未可知。
前期，本实验室通过使用Metrnl全身性敲除小鼠，已在多种血栓模型下证明Metrnl缺乏会导致血栓形成能力增强，并且在进一步的血小板功能检测中，证实Metrnl缺乏会导致血小板活性增强[21]。然而，我们尚未证明究竟是循环Metrnl还是血小板Metrnl的缺乏在促进血栓形成中扮演主要角色，且血小板Metrnl是否可以直接调控血小板活性改变，从而在血小板高活性与动脉血栓形成事件发生率增加之间建立联系，目前尚不清楚。
因此，本研究使用Metrnlloxp/loxp小鼠和Pf4-Cre小鼠进行交配繁殖，旨在构建血小板特异性Metrnl敲除小鼠模型，作为深入研究血小板内源性Metrnl在动脉血栓中的作用及调控机制的工具，并对该敲除小鼠的构建成功与否展开验证工作。
1. 材料与方法
1.1 实验试剂和仪器
鼠尾DNA提取试剂盒（CW2094S）购自北京康为世纪生物科技有限公司，5×Evo M-MLV RT Master Mix（AG11706）、通用型RNA提取试剂盒（AG21022）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，小鼠Actin抗体（
66009 -1-IG）购自武汉三鹰技术有限公司，Anti-METRNL抗体（ab235775）购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（A0208）购自上海碧云天生物技术有限公司，红细胞裂解液（BL503B）购自北京兰杰柯科技有限公司。实时荧光定量PCR仪（LightCycler96）来自Roche公司，PCR仪（TP600）来自Takara公司，化学发光分析系统（5200S）来自Tanon公司，动物全血计数仪（pocH-100iV）来自希森美康公司。
1.2 实验动物
Metrnlloxp/loxp小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄Pf4-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。
所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒（IVC）系统中，温度（24±2） ℃，相对湿度为40%~60%，饲养期间笼盒内保持清洁，小鼠在笼内自由活动、进食及饮水，动物房内照明系统为自动控制（12 h照明、12 h黑暗）。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》，并经过海军军医大学大学医学研究伦理委员会批准指导。
1.3 实验方法
1.3.1 动物基因型鉴定
将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm，剪碎，按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA。之后，对目的基因进行PCR扩增，各引物序列如表1。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） Metrnl loxp TGAGGGTTGGAGGCTCCTAGC GGATGAGCGTTTGAGCACAGC Pf4-Cre CCAAGTCCTACTGTTTCTCACTC TGCACAGTCAGCAGGTT 内参基因 CAAATGTTGCTTGTCTGGTG GTCAGTCGAGTGCACAGTTT 将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳，上样量为每孔6 μl，电泳条件为100 V×30 min，结束后进行拍照、分析。
1.3.2 小鼠取材
将小鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（100 mg/kg），待小鼠处于深度麻醉后，打开其腹腔，用1 ml注射器吸取约100 μl 2%枸橼酸钠溶液（枸橼酸钠0.2 g，蒸馏水定容至10 ml），自腹主动脉处缓慢抽取抗凝血液，并转移至15 ml离心管中。组织灌流后迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、结肠组织，放入组织冻存管扔进液氮速冻，待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。骨髓提取分离小鼠股骨并剪去多余肌肉和纤维组织，剪掉股骨两端，在干净PBS中反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液室温离心
1000 r/min×5 min获得骨髓细胞，用1 ml Triozl溶液重悬混匀，储存至−80 ℃超低温冰箱。1.3.3 小鼠洗涤血小板制备
向小鼠抗凝全血中加入等体积0.9%生理盐水，并加入Apyrase（终浓度2 U/ml），快速颠倒混匀后室温离心800 r/min×10 min；离心后收集最上层富血小板血浆（PRP），转移至新的15 ml离心管，室温离心
1700 r/min×5 min，弃去上清液，取适量台式液重悬。1.3.4 小鼠外周血细胞制备
小鼠心脏采抗凝血后，室温离心
1000 r/min×5 min,弃去上清液后加入5 ml的红细胞裂解液，室温作用10 min，室温离心1000 r/min×5 min，重复1次，在血细胞沉淀中加入5 ml PBS洗涤，室温离心1000 r/min×5 min，弃去上清后根据白细胞沉淀的量加入100～500 μl PBS重悬。红细胞提取在全血中加入等体积红细胞保存液（枸橼酸钠0.8 g，葡萄糖2.05 g，枸橼酸0.0325 g，氯化钠0.42 g，蒸馏水定容至100 ml）, 室温离心2 000 r/min×10 min，连续离心洗涤3次后，取压积红细胞加入100～500 μl红细胞保存液重悬。1.3.5 实时荧光定量PCR实验
使用RNA提取试剂盒提取组织RNA，Triozl法提取骨髓RNA，将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录，得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验，各引物序列如表2。
表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） Mouse Metrnl CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT GGACAACAAAGTCACTGGTACAG Mouse Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 1.3.6 蛋白免疫印迹实验
取适量组织至2 ml高速离心管，加入蛋白裂解液后，使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管，离心：
12000 g×15 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中，进行蛋白浓度测定，剩余样品加入5×蛋白上样缓冲液，97 ℃变性10 min得到蛋白样品。使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳条件为：150 V×60 min。使用PVDF膜进行转膜，转膜条件为100 V×60 min。
转膜结束后，使用快速封闭液封闭20 min，之后使用1 × TBST缓冲液洗膜，5 min×3次。加入一抗孵育液（1∶
1000 稀释）4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液，使用1×TBST缓冲液洗膜，10 min×3次。加入二抗孵育液（1∶1000 稀释）常温孵育1 h，用1×TBST缓冲液洗去二抗，10 min×2次，结束后即可进行扫膜。1.3.7 统计学分析
实验数据使用GraphPad Prism 9.5进行统计分析。两组间的比较使用two-tailed Student’s t test检验，P<0.05视为结果存在统计学意义。
2. 结果
2.1 血小板特异性Metrnl敲除小鼠的构建和基因型鉴定
本研究构建策略基于前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠和Cre-LoxP重组酶系统,所构建血小板特异性Metrnl敲除小鼠（Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+）简称Plt-Metrnl-/-小鼠，具体构建策略如图1A所示。
图 1 血小板特异性Metrnl敲除小鼠构建策略、培育流程及基因型鉴定A. Pf4-Cre酶特异性切除巨核细胞及血小板谱系Metrnl同向LoxP位点间的序列，棕色框为等位基因编码区，红色框为非编码区； B. Plt-Metrnl-/-小鼠培育繁殖流程；C. 母代小鼠及DNA电泳条带图；D. 二代小鼠培育流程及DNA电泳条带代表图；E. Plt-Metrnl-/-小鼠培育流程及DNA电泳条带代表图Metrnlloxp/loxp小鼠是前期构建而成，该小鼠Metrnl基因的3号外显子两侧和4号外显子编码区的都插有同向LoxP位点（即图1A中所示“等位基因”），可基于Cre-LoxP系统在Cre酶的作用下，将LoxP位点之间的序列切除（图1A）[12]。
Pf4-Cre小鼠是由Pf4基因启动子Cre重组酶在巨核细胞及血小板谱系表达的工具鼠，最初开发用于研究APC-Wnt调节途径在巨核细胞生成和血小板产生中的作用，其Cre重组酶的表达受巨核细胞特异性受体Pf4基因的启动子介导，在巨核细胞的成熟Ⅰ期（最早可识别形态期）中即开始发生转录激活，之后广泛表达于成熟的血小板[22, 23]。
将Metrnlloxp/loxp小鼠和Pf4-Cre小鼠进行交配繁殖，巨核细胞特异性表达的Cre酶可将Metrnl同向LoxP位点之间的序列切除，以达到在巨核细胞及血小板谱系特异性敲除Metrnl基因的目的，具体构建繁殖流程如图1B所示，最终可以获得Plt-Metrnl-/-小鼠及其对照小鼠（WT）。
繁殖过程中进行基因型鉴定时，需确认Metrnlloxp基因和Pf4-Cre基因的表达情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定，Metrnlloxp突变型基因阳性条带为243bp，对应野生型序列条带为131bp，Pf4-Cre基因阳性条带为420bp，内参基因阳性条带为200bp。对培育繁殖过程中的母代及子代小鼠均进行了基因型鉴定，如图1C、D、E中DNA电泳条带图所示：图1C中泳道1、2为母代Metrnlloxp/loxp小鼠，泳道3、4为母代Pf4-Cre小鼠；图1D中泳道1、2为Metrnlloxp/WT小鼠，泳道3、4为Metrnlloxp/WT/Pf4-Cre+小鼠；图1E泳道1、2、4为Plt-Metrnl-/-小鼠，泳道3、5、6为WT小鼠。
2.2 血小板特异性Metrnl敲除小鼠血小板蛋白表达情况
为验证血小板特异性Metrnl敲除小鼠是否实现血小板特异性Metrnl基因敲除，分别提取Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血小板蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证敲除情况，结果如图2所示，Plt-Metrnl-/-小鼠血小板蛋白Metrnl表达较对照WT小鼠明显降低，提示Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl成功敲除。
2.3 血小板特异性Metrnl敲除小鼠各组织Metrnl mRNA及蛋白表达情况
为验证血小板特异性Metrnl敲除小鼠是否存在其他组织非特异性敲除，本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测了该小鼠各组织中Metrnl mRNA的表达情况。如图3所示，以WT对照小鼠的心脏Metrnl mRNA表达量为1，Plt-Metrnl-/-小鼠在心、肝、脾、肺、肾、脑、结肠、骨髓组织mRNA水平上并未存在显著差异。该结果说明，血小板特异性Metrnl基因敲除小鼠在组织mRNA水平上并未发生其他组织非特异性敲除。
然后，本研究提取血细胞及各组织的蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证Plt-Metrnl-/-小鼠各血细胞及组织中Metrnl蛋白表达情况。如图4所示，并未发现Metrnl蛋白在Plt-Metrnl-/-小鼠和对照WT小鼠各组织中存在显著差异，该结果提示，Plt-Metrnl-/-小鼠在其他血细胞蛋白水平及各组织蛋白水平上并未发生非特异性敲除。
图 4 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠各血细胞及各组织的Metrnl蛋白表达情况（$\bar x $ +s, n=3）A.心脏组织；B.肝组织；C.脾组织；D.肺组织；E.肾组织；F.脑组织；G.结肠组织；H.外周血白细胞；I.外周血红细胞2.4 血小板特异性Metrnl敲除小鼠外周血常规指标情况
分别对Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠外周血进行血常规指标检测，结果如表3所示，外周血血常规计数红细胞、白细胞、血小板数量未见明显改变，血小板大小及分布未见显著差异，提示血小板特异性敲除Metrnl后不影响外周血细胞数量，且对血小板形态没有明显影响。
表 3 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血常规指标对比（n=6）血常规检验项目 WT Plt-Metrnl-/- 白细胞计数（109/L） 2.10±0.50 2.25±0.30 淋巴细胞计数（109/L） 1.28±0.20 1.52±0.20 淋巴细胞比率（%） 63±3 68±3 嗜酸性粒细胞计数（109/L） 0.10±0.05 0.05±0.02 嗜酸性粒细胞比率（%） 3.0±1.8 1.0±0.3 其他细胞计数（109/L） 0.72±0.20 0.68±0.10 其他细胞比率（%） 34.0±3.3 31±3 红细胞计数（1012/L） 8.49±0.40 7.83±0.40 血红蛋白（g/L） 122.0±5.5 113.0±4.6 红细胞压积（%） 42±2 37±2 平均红细胞体积（fL） 49.1±0.8 47.7±0.9 平均血红蛋白含量（pg） 14.30±0.08 14.5±0.1 平均血红蛋白浓度（g/L） 292±5 304.0±7.7 红细胞分布宽度-SD（fL） 27.6±0.4 26.2±0.6 红细胞分布宽度-CV（%） 13.2±0.4 12.4±0.3 血小板计数（109/L） 1121 ±581049 ±132血小板平均宽度（fL） 6.7±0.4 6.1±0.1 平均血小板体积（fL） 6.20±0.26 5.80±0.08 大型血小板比率（%） 1.9±1.0 3.5±0.3 2.5 血小板特异性Metrnl敲除小鼠一般繁殖情况
Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠和对照WT小鼠为首次繁殖培育的转基因动物，在生理状态下，血小板Metrnl缺失是否影响动物繁殖情况尚未见报道，因此，本研究统计记录了小鼠基因型分布情况。Plt-Metrnl-/-小鼠扩大繁殖流程如图5A所示，按照遗传学规律，Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠杂交繁殖获得子代鼠中Plt-Metrnl-/-小鼠和WT小鼠的比例应为1∶1。如图5B、5C所示，对繁殖过程中所获得的16窝次共计130只目的鼠进行统计，Plt-Metrnl-/-小鼠共有67只，其中雄鼠31只，雌鼠36只；WT小鼠共有63只，其中雄鼠37只，雌鼠26只。结果表明繁殖鼠遗传规律基本符合预期，无明显差异，提示血小板特异性敲除Metrnl对小鼠胚胎发育和性别比例无明显影响。
图 5 Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠扩大繁殖流程和子代鼠一般繁殖情况A. Plt-Metrnl-/-小鼠扩大繁殖流程；B.子代鼠性别比例；C.子代鼠基因型比例3. 讨论与总结
Cre-LoxP重组酶系统主要用于构建条件性基因敲除小鼠模型，是当前阐释基因功能的最直接的方式之一。Pf4-Cre工具鼠长期以来应用于巨核谱系基因敲除动物的构建，虽然有研究表明Pf4-Cre表达不仅限于巨核细胞/血小板谱系，也表达于其他骨髓造血干细胞以及远端肠道的上皮细胞中，但是该小鼠目前仍是巨核细胞谱系遗传修饰的最佳工具，且不影响血小板和血栓形成功能的考察[22-24]。因此本研究利用Pf4-Cre工具鼠和实验室前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠进行杂交繁殖，最终获得血小板特异性Metrnl敲除小鼠，即Plt-Metrnl-/-小鼠。
本研究从mRNA水平、组织蛋白水平、外周血常规水平考察了Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl敲除的情况。本研究结果显示，Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl蛋白表达较对照WT小鼠减低约50%，可能是由于本实验室前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠插入的loxp序列位点在3、4号外显子，因此Pf4-Cre仅介导3、4号外显子间的同向基因序列切除，并未实现Metrnl基因全长敲除。另外，血小板是骨髓巨核细胞分化形成的“细胞碎片”，由于无法获得原代骨髓巨核细胞，本研究并未对骨髓巨核细胞的Metrnl敲除情况进行验证，未证实Metrnl敲除是否会对骨髓巨核细胞的生成和形态产生影响，仅从血常规计数中初步得知血小板的生成未受到明显影响。Metrnl与骨髓巨核细胞之间的关系也可作为下一步的研究方向。
在小鼠培育的过程中，尚未发现Plt-Metrnl-/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面的差异。基于孟德尔遗传定律，Plt-Metrnl-/-小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠杂交进行扩大繁殖和保种的得率也接近50%，说明血小板Metrnl缺失不影响小鼠繁殖情况。
前期本课题组已证实Metrnl全身敲除小鼠血栓形成能力增强，血小板活性明显增强，构建Plt-Metrnl-/-小鼠可考虑用于血小板内源性Metrnl与血小板功能相关性的研究，并且该小鼠可与Metrnl全身敲除小鼠进行血栓形成能力比较，比较全身Metrnl和局部血小板Metrnl的作用，深入研究其作用方式及机制，为血栓性疾病的防治提供新靶点。
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表 1 昆仙胶囊部分活性成分
成分代码 化合物名称 OB(%) DL MOL000006 木犀草素（luteolin） 36.16 0.25 MOL000098 槲皮素（quercetin） 46.43 0.28 MOL000211 迈林（mairin） 55.38 0.78 MOL000296 赫达拉汀（hederagenin） 36.91 0.75 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 49.6 0.31 MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol） 36.91 0.75 MOL000359 谷甾醇（sitosterol） 36.91 0.75 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 41.88 0.24 MOL000449 豆甾醇（stigmasterol） 43.83 0.76 MOL000622 甘露聚糖（magnograndiolide） 63.71 0.19 MOL000953 胆固醇(cholesterol) 37.87 0.68 MOL001323 谷固醇α1(sitosterol alpha1) 43.28 0.78 MOL001494 甘露醇 (mandenol) 42 0.19 MOL001495 亚油酸乙酯（ethyl linolenate） 46.1 0.2 MOL001510 24-表氨酯（24-epicampesterol） 37.58 0.71 MOL001558 芝麻素（sesamin） 56.55 0.83 MOL001645 乙酸亚油酯（linoleyl acetate） 42.1 0.2 MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL001792 甘草苷元（liquiritigenin） 32.76 0.18 MOL001979 羊毛甾醇（lanosterol） 42.12 0.75 
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