-
子宫内膜异位症(endometriosis,EM)是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一,以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证,临床治疗时以活血化瘀为主,常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等,能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰,其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象,探究药物、靶点、疾病之间的联系,系统完整地研究药物的机制,可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合,网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中,笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制,构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络,并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势,为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
-
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分,删除重复项,共有94种有效成分(supplementary materials table S1)。其中丹参有效活性成分达到65个,而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分,但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有,槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有,是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分(supplementary materials table S2)。与此同时,我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点(表1),包括孕酮受体(progesterone receptor)、前列腺素G/H合成酶1(prostaglandin G/H synthase 1)、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2)、凋亡调节剂Bcl-2(apoptosis regulator Bcl-2)、核受体共激活剂(nuclear receptor coactivator 2)等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点
序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基,γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 -
利用人类基因数据库查找EM作用靶点,与七味中药有效成分对应靶点进行比对,发现红花所含相关靶点数量最多,达到103个;而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少,为14个(图1A);王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高,为54.7%;而桃仁最低,为29.8%(图1B)。经过去重处理后,七味中药所含EM相关靶点共119个(supplementary materials table S3)。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分-靶点网络分析,获得图2,其中共计216个节点,其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分,而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能,对于网络各节点度值进行分析,网络中某些节点度值较高,提示该节点为网络中的关键节点(supplementary materials table S4)。在各中药所含有效成分中,槲皮素展现出极高的连接度(度值=87),远超其他有效成分,而其余较高连接度值依次是木犀草素(度值=43)、山柰酚(度值=33)、黄芩素(度值=23)、丹参酮A(度值=20)、花生四烯酸(度值=20)、β-谷固醇(度值=18)。中药是一个多有效成分的复杂系统,一个有效成分可作用于多个靶点,协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中,较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2,度值=82)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1,度值=39)两者拥有最高的度值,是临床上炎性疾病治疗的主要靶点;核受体辅活化子2(NCOA2,度值=35)、核受体辅活化子1(NCOA1,度值=34)紧跟其后,同样在各炎症通路中作用显著;凝血酶(度值=31)是临床上治疗出血的重要靶点,直接作用于血液凝固过程的最后一环;Mu-type阿片受体(OPRM1,度值=30)则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
-
利用STRING软件构建靶点PPI网络,图中包含119个节点,505条边,所有节点平均度值为8.49,具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个(supplementary materials table S6),前9位关键节点,平均度值为88,见表2,与PPI网络74%节点存在相互作用关系,提示它们在网络调控中起着关键作用,可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点
节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 -
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因,获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况,发现七味中药共有信号通路44条(supplementary materials table S5),筛选出与EM密切相关的19条通路(表3)。从表3中,不难发现,19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面,其中炎症相关通路达到7条,为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图,根据图4可知,在系列通路中,泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中,多味中药靶点存在高度富集,红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集,远超该药其他通路,值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路
序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关
A network pharmacology approach to explore mechanisms of activating blood circulation and removing blood stasis herbs in the treatment of endometriosis
-
摘要:
目的 利用网络药理学探究活血化瘀药治疗子宫内膜异位症(endometriosis,EM)的可能作用机制。 方法 以桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等七味临床常用活血化瘀中药为研究主体。利用中药化学成分数据库TCMSP平台,检索获取七味活血化瘀药有效活性成分,通过Targets information软件获得有效成分对应靶点。使用GeneCards数据库收集EM相关靶基因,利用韦恩图工具得到活血化瘀药有效成分治疗EM的靶基因。应用Cytoscape 3.6.0软件构建活性成分-作用靶点-疾病网络。应用KEGG数据库分析获得靶点基因富集的信号通路。 结果 七味活血化瘀药共筛选出94种活性成分,119个作用靶标。其中槲皮素、木犀草素、山柰酚等为关键活性成分,PTGS2、PTGS1、NCOA2、NCOA1等为关键靶点。七味中药共有20条EM相关KGEE通路,涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面,其中PI3K-Akt、IL-17、TNF-α等炎症相关通路为主要通路。 结论 活血化瘀药治疗EM具有多成分、多靶点、多通路的特点,针对EM的疼痛、炎症以及月经紊乱状态均有治疗作用。 Abstract:Objective To explore the possible mechanism of activating blood circulation and removing blood stasis herbs in the treatment of endometriosis (EM) with network pharmacology approach. Methods Seven kinds of commonly used activating blood circulation and removing blood stasis herbs, such as: peach kernel, safflower, zeilan, salvia miltiorrhiza, leonuri, radix cyathulae, and wang buliuxing were selected as the research subjects. TCMSP platform, a database of traditional Chinese medicine chemical ingredients, was used to retrieve the effective ingredients of 7 herbs. The targets of the effective ingredients were obtained through the Targets information software. GeneCards database was used to collect EM related target genes. Venn diagram tool was used to obtain the target genes of active ingredients of activating blood circulation and removing blood stasis herbs. Cytoscape 3.6.0 software was used to construct the active ingredient-target-disease network. KEGG database was used to analyze the signal pathways of target gene enrichment. Results A total of 94 active ingredients and 119 targets of 7 herbs were screened. Quercetin, luteolin and kaempferol were the key active components. PTGS2, PTGS1, NCOA2 and NCOA1 were the key targets. The 7 herbs have 20 related KGEE pathways, involving sex hormones, inflammation, apoptosis and angiogenesis. PI3K-Akt signaling pathway, IL-17 signaling pathway, TNF signaling pathway were the main pathways. Conclusion The treatment of EM with activating blood circulation and removing blood stasis herbs has the characteristics of multiple components, multiple targets and multiple pathways, which can relieve the pain, inflammation and menstrual disorders symptoms of EM. -
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点
序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基,γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 表 2 PPI网络中关键节点
节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路
序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 -
[1] ZHAO R H, SUN W W, LIU Y, et al. Chinese medicine in management of chronic disease endometriosis[J]. Chin J Integr Med,2020,26(2):88-91. doi: 10.1007/s11655-018-2937-3 [2] 邢心睿, 吕狄亚, 柴逸峰, 等. 网络药理学在中药作用机制中的研究进展[J]. 药学实践杂志, 2018, 36(2):97-102. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2018.02.001 [3] LUO T T, LU Y, YAN S K, et al. Network pharmacology in research of Chinese medicine formula: methodology, application and prospective[J]. Chin J Integr Med,2020,26(1):72-80. doi: 10.1007/s11655-019-3064-0 [4] RU J L, LI P, WANG J N, et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. J Cheminform,2014,6:13. doi: 10.1186/1758-2946-6-13 [5] 薛潇春, 胡晋红. 网络药理学的研究方法与应用进展[J]. 药学实践杂志, 2015, 33(5):401-405. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2015.05.005 [6] MA C T, JIANG Y X, ZHANG X H, et al. Isoquercetin ameliorates myocardial infarction through anti-inflammation and anti-apoptosis factor and regulating TLR4-NF-κB signal pathway[J]. Mol Med Rep,2018,17(5):6675-6680. [7] VAN DER WOUDE H, TER VELD M G, JACOBS N, et al. The stimulation of cell proliferation by quercetin is mediated by the estrogen receptor[J]. Mol Nutr Food Res,2005,49(8):763-771. doi: 10.1002/mnfr.200500036 [8] 李星霞, 郭澄. 木犀草素的药理活性研究[J]. 中国药房, 2007, 18(18):1421-1424. doi: 10.3969/j.issn.1001-0408.2007.18.029 [9] 王继双, 何焱, 张文静, 等. 木犀草素的药理作用研究进展[J]. 生命科学, 2013, 25(6):560-565. [10] 张雅雯, 邵东燕, 师俊玲, 等. 山奈酚生物功能研究进展[J]. 生命科学, 2017, 29(4):400-405. [11] LAI Z Z, YANG H L, HA S Y, et al. Cyclooxygenase-2 in endometriosis[J]. Int J Biol Sci,2019,15(13):2783-2797. doi: 10.7150/ijbs.35128 [12] 吴亚玲, 郝敏. 趋化因子在子宫内膜异位症发病机制中的作用[J]. 国际妇产科学杂志, 2009, 36(5):352-355. doi: 10.3969/j.issn.1674-1870.2009.05.004 [13] KUMAGAMI A, ITO A, YOSHIDA-KOMIYA H, et al. Expression patterns of the steroid receptor coactivator family in human ovarian endometriosis[J]. J Obstet Gynaecol Res,2011,37(10):1269-1276. doi: 10.1111/j.1447-0756.2010.01509.x [14] SHI X, XU W, DAI H H, et al. The role of SRC1 and SRC2 in steroid-induced SDF1 expression in normal and ectopic endometrium[J]. Reproduction,2014,147(6):847-853. doi: 10.1530/REP-14-0027 [15] 倪喆鑫, 张丹英, 姚睿嫔, 等. 活化血小板在子宫内膜异位症病理过程中的作用及抗血小板相关药物的治疗[J]. 生殖医学杂志, 2018, 27(12):1250-1254. doi: 10.3969/j.issn.1004-3845.2018.12.018 [16] GUO S W, DU Y B, LIU X S. Endometriosis-derived stromal cells secrete thrombin and thromboxane A2, inducing platelet activation[J]. Reprod Sci,2016,23(8):1044-1052. doi: 10.1177/1933719116630428 [17] 陈晓莉, 焦桂青. Ang-2、VEGF在子宫内膜异位症中的表达[J]. 海南医学院学报, 2016, 22(2):166-168. [18] 尉伟东, 阮菲, 涂飞霞, 等. 细胞因子信号传送阻抑物-3和caspase-3在子宫内膜异位症中的表达及其相关性[J]. 中华病理学杂志, 2013, 42(8):515-518. doi: 10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2013.08.003 [19] MADANES D, BILOTAS M A, BASTÓN J I, et al. PI3K/AKT pathway is altered in the endometriosis patient's endometrium and presents differences according to severity stage[J]. Gynecol Endocrinol,2020,36(5):436-440. doi: 10.1080/09513590.2019.1680627 [20] JIANG L, YAN Y, LIU Z, et al. Inflammation and endometrio- sis[J]. Front Biosci,2016,21(5):941-948. doi: 10.2741/4431 [21] 许丽华. EMAb、CA125、TNF-α与子宫内膜异位症的相关性[J]. 中国妇幼保健, 2011, 26(28):4336-4338. [22] 任伟俏, 孙高高, 李晶, 等. 子宫内膜异位症患者血清CD38、缩宫素、白介素-1β表达情况及相关性研究[J]. 中国妇幼保健, 2019, 34(7):1660-1663. [23] SIKORA J, MIELCZAREK-PALACZ A, KONDERA-ANASZ Z. Association of the precursor of interleukin-1β and peritoneal inflammation-role in pathogenesis of endometriosis[J]. J Clin Lab Anal,2016,30(6):831-837. doi: 10.1002/jcla.21944 [24] SIKORA J, FERRERO S, MIELCZAREK-PALACZ A, et al. The delicate balance between the good and the bad IL-1 proinflammatory effects in endometriosis[J]. Curr Med Chem,2018,25(18):2105-2121. doi: 10.2174/0929867325666180111093547 [25] TANIGUCHI F, KAPONIS A, IZAWA M, et al. Apoptosis and endometriosis[J]. Front Biosci,2011,E3(2):648-662. doi: 10.2741/e277 [26] YU C Q, YU J, HAN J, et al. Regulatory mechanism of malignant behavior of endometriosis mediated by puerarin[J]. J Chin Integr Med,2009,7(1):41-47. doi: 10.3736/jcim20090106 [27] CHO S, CHOI Y S, JEON Y E, et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its soluble receptor-1 in endometriosis[J]. Microvasc Res,2012,83(2):237-242. doi: 10.1016/j.mvr.2011.12.004 [28] DING S J, ZHU T H, TIAN Y H, et al. Role of brain-derived neurotrophic factor in endometriosis pain[J]. Reprod Sci,2018,25(7):1045-1057. doi: 10.1177/1933719117732161