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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，以对称性多关节滑膜炎为主要临床表现，呈慢性、进行性及侵袭性，病情逐渐加重，最终可出现残疾，甚至累及脏器和神经系统而危及生命。目前RA 发病机制尚不明确，治疗主要是非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情抗风湿药及生物制剂等对症治疗或改善病情治疗，但存在不同程度的疗效限制、治疗费用高或长期应用副作用较大等问题。昆仙胶囊作为“九五”国家中医药重点科技攻关项目成果，由昆明山海棠、枸杞子、菟丝子及淫羊藿等组成。已有的研究提示，原方中昆明山海棠有较好的抗炎镇痛与免疫调节作用，枸杞子、菟丝子与昆明山海棠配伍可有效降低其毒性，而淫羊藿与昆明山海棠配伍则可增强免疫调节作用，改善骨损伤。总之，该方有较好的抗炎镇痛、免疫调节及保护关节软骨的作用，可减轻滑膜炎症、修复关节软骨的损伤，毒副作用也相对较低[1-2]。临床研究显示，昆仙胶囊用于治疗RA患者效果显著，能有效缓解关节疼痛、晨僵症状，改善关节功能活动，不仅有较好的疗效，安全性也得到验证[3-6]。
近年来，RA发病机制的研究取得了较快进展，有关昆仙胶囊治疗RA的作用机制有待进一步挖掘研究。网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点（nodes）进行多靶点药物分子设计的新学科。本研究基于网络药理学技术，依托相应数据库和软件，构建“药物-成分-关键靶点-信号通路”网络，科学系统地分析昆仙胶囊对 RA 的作用机制，以期为后续的实验研究奠定基础。
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本研究通过计算系统生物学实验室的中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索中药枸杞子、菟丝子、淫羊藿的活性成分，利用本草组鉴（即HERB数据库，http://herb.ac.cn/）检索昆明山海棠的活性成分。再根据化合物口服生物利用度（OB）与类药性指数（DL）筛选活性成分，其中，OB 阈值设为OB≥30%， DL阈值设为DL≥0.18 [7-8] 。最终得到81种有效活性成分，并通过TCMSP数据库获取其对应的靶点。
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以rheumatoid arthritis为关键词，检索 Genecards（https://www.genecards.org/）数据库及OMIM（https://omim.org/）数据库，收集 RA 的相关靶点。
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为探明药物活性成分靶点与疾病靶点之间的关系，将两部分靶点通过 Venn图制作网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）进行交集得出公共靶点，并导入Cytoscape3.7.2软件构建化合物-靶点网络。Cytoscape 软件的核心架构是网络，其中的每个节点代表基因或分子，而节点与节点之间的连接代表这些基因或分子之间存在相互作用，节点的度值代表网络中节点与节点相连的数目。
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为进一步探究靶点蛋白之间的相互作用，将所得的药物与疾病的公共靶点上传至在线STRING10.5软件(http://string db.org)，构建蛋白-蛋白相互作用网络模型。其参数修改物种为人（homosapiens），其他参数保持默认设置，获取PPI网络。
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利用Cytoscape软件中的ClueGo功能对公共靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析，其中，GO富集分析分为细胞组成、生物过程以及分子功能 3个部分。设定阈值P<0.05，保存富集分析的结果并将其可视化。
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使用TCMSP和HERB数据库检索枸杞子、菟丝子、淫羊藿及昆明山海棠的化合物共 384个：其中枸杞子有188个化合物，菟丝子有29个化合物，淫羊藿有130个化合物，昆明山海棠有37个化合物。依据OB≥30%且DL≥0.18筛选出化合物共131个：其中，枸杞子有45个，菟丝子有11个，淫羊藿有23个，昆明山海棠有7个。去除重复后，发现昆仙胶囊中活性成分81个，再通过TCMSP获取对应的药物成分靶点913个，删除重复后得到228个。部分活性成分见表1。
表 1 昆仙胶囊部分活性成分
成分代码 化合物名称 OB(%) DL MOL000006 木犀草素（luteolin） 36.16 0.25 MOL000098 槲皮素（quercetin） 46.43 0.28 MOL000211 迈林（mairin） 55.38 0.78 MOL000296 赫达拉汀（hederagenin） 36.91 0.75 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 49.6 0.31 MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol） 36.91 0.75 MOL000359 谷甾醇（sitosterol） 36.91 0.75 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 41.88 0.24 MOL000449 豆甾醇（stigmasterol） 43.83 0.76 MOL000622 甘露聚糖（magnograndiolide） 63.71 0.19 MOL000953 胆固醇(cholesterol) 37.87 0.68 MOL001323 谷固醇α1(sitosterol alpha1) 43.28 0.78 MOL001494 甘露醇 (mandenol) 42 0.19 MOL001495 亚油酸乙酯（ethyl linolenate） 46.1 0.2 MOL001510 24-表氨酯（24-epicampesterol） 37.58 0.71 MOL001558 芝麻素（sesamin） 56.55 0.83 MOL001645 乙酸亚油酯（linoleyl acetate） 42.1 0.2 MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL001792 甘草苷元（liquiritigenin） 32.76 0.18 MOL001979 羊毛甾醇（lanosterol） 42.12 0.75 -
通过 Genecards 数据库得到 RA 靶点4465，通过OMIN数据库得到RA相关靶点41个。通过交集去除重复靶点，共得到RA相关靶点4 494个。
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利用 Venn 图制作网站将昆仙胶囊活性成分对应的 228 个靶点与 RA 对应的4494 个靶点进行交集，获得162个共有靶点（图1）。将 162个共有靶点导入 Cytoscape 3.7.2 软件，构建“化合物-靶点”的网络图并进行可视化分析（图2）。网络图包含65个化合物节点、162个靶点节点（公共靶点）和227条边，用绿色表示枸杞子的活性成分，紫色代表淫羊藿的活性成分，红色表示昆明山海棠的活性成分，黄色代表公共活性成分，橘色代表菟丝子的活性成分，蓝色代表靶点。连接活性成分与靶点的边表示两者之间具有相互作用。依据网络拓扑学性质可知，节点较多的化合物或药物靶点在整个网络中可能起到关键的作用，因此本研究筛选节点度较大的节点进行分析。
图 1 昆仙胶囊活性成分靶点与RA疾病靶点的公共靶点
图 2 昆仙胶囊主要成分-靶点网络
排名前5位的活性成分分别为槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素，分别能与103个、44个、36个、32个、31个靶点蛋白发生作用。排名前5位的靶点分别为孕酮受体（PGR）、前列腺素过氧化物合酶2（PTGS2）、前列腺素过氧化物合酶1（PTGS1）、盐皮质激素受体基因（NR3C2）、雄激素受体（AR），分别能与34个、32个、19个、18个、13个化合物发生作用。
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应用STRING软件构建PPI网络(图3)，此网络图中通过162个公共靶点得出，共有边84条，同时得到网络中关键靶点的频次。根据“度值>均值”筛选出关键节点20个，包括：IL-6、IKBKB、FOS、EGFR、EGF、CXCL8、CHUK、CCNB1、MYC、IL4、IL1B、VEGFA、JUN、CCND1、BCL2L1、CDKN1A、CASP8、STAT3、IL10、AKT1。度值排名前5位的靶点分别是AKT1、IL10、STAT3、CASP8及CDKN1A，可能为昆仙胶囊治疗RA的关键靶点。
图 3 昆仙胶囊靶蛋白PPI网络图
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GO生物过程（图4）主要包括：活性氧代谢过程的调控、正调控血管生成、凋亡信号通路的负调控、细胞对化学应激的反应等；分子功能（图5）包括：激酶活性的调节、肽酶活性的调节、DNA结合转录因子活性的正调控、激酶调节活性等；细胞组成（图6）包括：囊腔、宿主细胞内部分、突触前膜固有成分等；KEGG富集分析（图7）主要包括：IL-17信号通路、乙型肝炎、催乳素信号通路、麻疹等，其中，IL-17信号通路的占比最高，其次为乙型肝炎。
图 4 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的生物过程（P<0.05）
图 5 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的分子功能 (P<0.05)
图 6 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的细胞组成(P<0.05)
图 7 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的KEGG富集分析（P<0.05)
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RA致残率较高，是对健康危害较大的风湿病之一。昆仙胶囊由昆明山海棠、枸杞子、菟丝子及淫羊藿等中药组成，治疗RA疗效显著，但具体作用机制尚不十分明确。本研究借助网络药理学方法，获得昆仙胶囊治疗RA的主要活性分子及相关的靶点基因，进行GO 功能富集和 KEGG 功能分析，预测其治疗RA可能的物质基础和作用机制，为后续研究提供思路和依据。
从“化合物-靶点”的网络图可以看出，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素是昆仙胶囊中治疗RA的主要活性成分。槲皮素是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，临床研究提示，单用槲皮素治疗的RA患者晨僵、疼痛和活动后疼痛明显减轻，疾病活动评分（DAS）和健康评估问卷（HAQ）得分降低，有良好的治疗效果[9]。槲皮素能调节核转录因子κB（NF-κB）通路；抑制TNF-α、IL-1β、IL-17和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的水平；减少炎症细胞向关节部位募集来缓解RA的炎症[10]。槲皮素可降低基质金属蛋白酶 2（MMP-2）的表达和活性，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移[11]；促进RA成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡和抑制 FLS的迁移和侵袭来减轻 RA[12-13]。此外，调节破骨/成骨细胞和Th17/Treg平衡可能是槲皮素的另一种调节RA的机制[14]。木犀草素具有良好的抗炎活性，能明显降低胶原诱导性关节炎大鼠足跖的炎性肿胀程度，潜在抑制RA NLRP3炎性小体过表达、降低caspase-1、RANKL、VEGF和HIF-1α蛋白表达并增强OPG蛋白表达起到骨关节保护作用[15]。山奈酚拮抗bFGF / FGFR3 / RSK2轴可有效降低胶原诱导性关节炎小鼠的临床和组织学评分。山奈酚发挥抗关节炎作用的主要机制是抑制RA FLS增殖和迁移以及显著抑制Th17分化和破骨细胞生成[16]。β-谷甾醇是植物甾醇的重要组成成分，具有抗炎、调节人体甾体激素、抗氧化及抗肿瘤等作用[17]。研究显示，含有β-谷甾醇的白术醇提物具有显著的抗炎作用，可明显降低佐剂型关节炎大鼠血清和组织中的 TNF-α、C-反应蛋白和 IL-2 的含量[18]。研究证实，雷公藤甲素又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，具有较为显著的抗炎作用，RA病人用药后关节肿痛明显减轻，有很好的治疗效果。研究提示，雷公藤甲素可通过调节细胞因子、酶类、核转录因子 B 的表达，抑制炎症因子分泌，抑制血管的生成和诱导细胞的凋亡，保护软骨和基因调控等方面发挥抗 ＲA 药理作用[19]。
靶点PPI网络图提示，AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A等可能是昆仙胶囊治疗RA的关键靶点。现有研究提示，蛋白激酶B1(AKT1) 与RA滑膜成纤维细胞生成有关[20]，IL-10 在RA 患者血清中存在异常高表达，IL-10具有多种免疫功能，可以抑制炎症和细胞免疫反应，加强与适应性免疫和清除功能相关的耐受性，抑制由单核细胞和巨噬细胞产生的促炎因子[21]。STAT3 是一个关键性 RA致病因子，能够抑制成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡，促进 T 细胞存活及抗体产生，受促炎因子调控而失衡的 STAT3 信号可导致慢性滑膜炎的产生，抑制STAT3 的磷酸化对缓解关节炎症状、促进 FLS凋亡意义重大[22]。Caspase-8在滑膜抗原呈递细胞中发挥功能，通过控制RIPK3的作用来调节对炎症刺激的反应，这种微妙的平衡维持了关节内的稳态[23]。RA患者滑膜组织和成纤维样滑膜细胞（HFLS）中CDKN1A下调。若CDKN1A过表达可显著抑制HFLS的增殖和侵袭，并下调肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-6-的表达，上调了IL-10的表达[24]。
通路富集分析结果表明，昆仙胶囊治疗 RA的作用可能主要与干预IL-17、乙型肝炎及催乳素等信号通路有关，尤其是IL-17信号通路占比最大，达到57.89%。IL-17信号通路是细胞外信号引起细胞核内反应的通道之一，ACT1作为IL-17信号通路的衔接蛋白，与其关键底物TRAF6结合，激活下游NF-κＢ、JNK等核内基因信号通路，诱导炎性细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，继而促进RA滑膜细胞增殖和活化，参与并加重RA病情[25]。RA和牙周炎是影响全世界人群的两种常见的慢性炎症性疾病。两种条件之间的关联一直是许多研究的重点，试图探索这种关联的潜在机制。催乳激素除了促乳作用外，在免疫和炎症中具有多种作用。一些数据表明，滑膜和牙周组织中的催乳素水平显著增加，并且这种增加与疾病活动和组织破坏有关。干预催乳素相关的通路，可能给RA的治疗带来新的机遇[26]。
综上所述，昆仙胶囊可能是通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素等主要成分，作用于AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A等多个靶点，调节IL-17信号通路、乙型肝炎及催乳素等信号通路，从而抑制炎症反应、调节免疫功能、促进FLS凋亡和抑制FLS迁移和侵袭等以治疗 RA。本研究提示，昆仙胶囊治疗 RA 呈现出多成分、多靶点、多通路协同作用优势，为后续的实验研究和临床应用提供了依据。
致谢 感谢海军军医大学中医系博士研究生蔡孟成在网络药理学方面给予的技术支持及靶点筛选方面的意见与建议。
Mechanism of Kunxian capsule in the treatment of rheumatoid arthritis based on network pharmacology
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摘要:
目的 采用网络药理学方法，探讨昆仙胶囊治疗类风湿关节炎（RA）的分子靶点及可能的作用机制。 方法 利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）结合本草组鉴（HERB）检索昆仙胶囊所含中药的化学成分，并依据 TCMSP 数据库的口服生物利用度（OB）和类药性指数（DL）筛选出主要有效活性成分，并获取其对应的靶点。通过 Genecards数据库与OMIM数据库筛选出 RA 的靶点，利用 Venn图制作网站获取药物与疾病的共同靶点，运用Cytoscape构建“活性成分-靶点”网络；使用 String 数据库绘制靶蛋白相互作用（PPI）网络，利用Cytoscape软件中的ClueGo功能对公共靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析。 结果 该研究共筛选出昆仙胶囊的有效活性成分81个，作用靶点913个，去除重复得到228个。从GeneCard数据库与OMIM数据库中获得RA的靶点4494个，通过交集获得公共靶点162个。揭示了槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇及雷公藤甲素等5种成分是昆仙胶囊中的主要活性成分，AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A可能是该药治疗RA的关键靶点。GO及KEGG富集分析结果显示，昆仙胶囊干预RA的作用机制主要与活性氧代谢过程的调控、激酶活性的调节、IL-17信号通路等有关，涉及感染、炎症及免疫的重要生物过程和信号通路。 结论 本研究从网络药理学角度，初步探讨了昆仙胶囊治疗RA的物质基础和作用机制，提示了其多成分、多靶点、多途径的整体调节特点，为后续分子生物学实验研究提供了思路与依据。 Abstract:Objective To explore the molecular targets and associated potential pathways of Kunxian capsule in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) based on network pharmacology. Methods The constituents of Kunxian capsule were searched by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database, Analysis Platform (TCMSP) and a high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine（HERB）.The potential active ingredients and targets were retrieved based on TCMSP database. RA related gene targets were retrieved through GeneCards database and OMIM database. Venn online software was used to obtain the common target of drugs and diseases. The “compound-target” network diagram was constructed with Cytoscape software. String database was used to draw the protein interaction (PPI) network. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis of the intersection network were conducted by Bioconductor Database. Results 81 active ingredients and 913 targets were identified. 228 targets were obtained after removing the duplicates. 4494 target genes directly related to RA were obtained from the GeneCards databases and OMIM databases. 162 genes were obtained from the intersection of component-target and disease-target. It was revealed that five ingredients including quercetin, luteolin, kaempferol, β-sitosterol and triptolide are the main active ingredients in Kunxian capsule. AKT1, IL-10, STAT3, CASP8 and CDKN1A may be the main therapeutical targets. The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that the mechanism of Kunxian capsule is mainly related to the regulation of reactive oxygen metabolism, the regulation of kinase activity, and IL-17 signaling pathway. The important biological processes and signaling pathways include infection, inflammation and immunity. Conclusion This research preliminarily explored the mechanism of Kunxian capsule in the treatment of RA by network pharmacology and suggested that the overall regulation is characterized by multi-components, multi-targets, and multi-channels. It provided some ideas for further molecular biology experiments. -
Key words:
- Kunxian capsule /
- rheumatoid arthritis /
- network pharmacology
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高海拔地区最大的环境特征是大气压降低，从而使机体从空气中摄取的氧气含量减少。大脑是最耗氧的器官之一，对缺氧异常敏感，这种生理反应使机体处于缺氧环境中可能导致严重的脑损伤，如学习和记忆障碍[1-3]。近年来，治疗或改善低压低氧引起的中枢神经系统(CNS)损伤在高原医学领域引起了越来越多的关注[4-5]。有研究表明，急性暴露在缺氧环境中会加速活性氧(ROS)的积累，并在海马和皮层区域引发氧化应激，而氧化应激是高原学习记忆障碍的主要诱因[6-8]，随着进入高海拔地区学习、工作和旅游的人群日益增加，寻找能够改善高原缺氧记忆损伤的药物成为高原缺氧损伤防治研究的重点。
利舒康胶囊为国药准字（Z20025932）药品，其主要成分为红景天、手掌参、甘青青兰、烈香杜鹃四味藏药辅以黄柏、甘草，经提取加工而制成，具有抗缺氧、抗疲劳、增强体力等作用，主要用于防治各种急、慢性高原病。临床实践表明，该药还可用于慢性缺血缺氧症侯群、脑梗死伴眩晕症、血管性痴呆、非痴呆性血管性认知功能障碍等缺血缺氧性相关疾病的治疗，其作用机制可能与抑制脂质过氧化，清除自由基减轻氧化应激有关[9]。本研究利用大型低压氧舱模拟高原海拔7500 m缺氧72 h，从行为学、组织形态学和Keap1/Nrf2/HO-1信号通路等方面，探讨利舒康胶囊对高原学习记忆损伤的干预作用，以期进一步阐明其可能的作用机制，为扩大利舒康胶囊的药理作用和临床适用范围提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
本研究符合《实验动物福利伦理指南》的规定，并取得中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院伦理委员会的认可(审批编号：2021KYLL205)。实验动物选取体重质量为18～22 g的SPF级Balb/C雄性小鼠60只，购于兰州大学动物科，饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院动物实验科[合格证号：SCXK（京）2016-0006]。
1.2 主要材料和仪器
Anti-Keap1抗体、Anti-Nrf2抗体、Anti-HO-1抗体、Anti-Caspase-3抗体、Anti-Bcl-2抗体、Anti-Bax抗体（abcam公司）；β-Actin单克隆抗体（中杉金桥公司）；RM-200八臂迷宫分析测试系统(成都泰盟科技有限公司)；DYC-1703070大型低压氧舱(贵州风雷航空军械有限公司)；Tissuelyser-24多样品组织研磨机（上海净信实业发展有限公司）；免疫印迹分析仪( BIO-RAD公司)。
1.3 方法
1.3.1 八臂迷宫实验检测高原缺氧小鼠的学习记忆能力
海马体对空间工作记忆和参考记忆都是至关重要的，Xu等[10]研究发现八臂迷宫以食物作为诱饵，并在食物臂上贴上信号图，使实验动物可以在参考记忆任务中优先进入下一个选择的手臂的轨迹，在工作记忆任务中优先进入先前访问过的手臂的轨迹。Li和Du等[11-12]研究表明，八臂迷宫模型能很好地反映高原缺氧环境下小鼠的空间工作记忆情况和参考记忆情况。本实验将60只Balb/C雄性小鼠（体重18～22 g）进行适应性训练3 d（将小鼠置于迷宫中，八个臂均放入饵料自由进食5 min），适应性训练结束后，称重，将小鼠随机分为正常对照组、缺氧模型组、红景天胶囊组[400 mg/kg]，利舒康胶囊低剂量组[400 mg/kg]、中剂量组[600 mg/kg]、高剂量组[800 mg/kg]，每组10只，在之后的饲养中给予小鼠少许食物，第4 d开始正式实验，训练时，在1、3、4、7（食臂末端有信号图）食臂中放入饵料，将一只小鼠置于迷宫中央用塑料罩罩住，30 s后打开使其自由进食，训练总时间为5 min，5 min内吃完则系统自动停止，5 min内仍未吃完则实验终止。测试指标为：①工作记忆错误（WME），即在同一个训练中小鼠再次进入已经放置饵料的臂；②参考记忆错误（RME），即小鼠进入没有放置饵料的臂；③小鼠探究总时间（TT），即小鼠吃完所有饵料所花的时间；④错误总次数（TE）。小鼠训练成功的标准为：WME=0；RME≤1。每次训练结束后清理小鼠排泄物，立即用75%酒精擦拭八臂迷宫内部祛除气味干扰。连续训练30 d。
1.3.2 低压低氧实验
在小鼠训练30 d后，第31 d开始对所有实验小鼠进行灌胃给药，每天一次。正常对照组和缺氧模型组给予等体积的生理盐水，连续给药7 d（舱外给药4 d＋舱内给药3 d），期间所有小鼠正常在当地海拔进行八臂迷宫训练。在灌胃给药第4 d后停止八臂迷宫训练，除正常对照组外，将其余各组小鼠放入大型低压低氧动物实验舱内，借助实验舱可以模拟不同海拔高度。小鼠以极快的速度（10 m/s）从当地海拔上升到海拔7500 m高度。之后每天上午实验员进入实验舱内（舱内海拔由7500 m降至3500 m，下降速度为20 m/s），在模拟海拔3 500 m处对小鼠进行灌胃给药，连续3 d。每天给药完毕后，将海拔上升至预定海拔7500 m处，小鼠在舱内自由进食和摄水，正常对照组小鼠同时饲养于动物实验科（当地海拔1500 m）。缺氧结束后将舱内海拔降至3500 m，实验人员进入舱内，检测高原损伤后小鼠的学习记忆能力，评价利舒康胶囊对高原学习记忆损伤的干预作用。实验流程如图1。实验结束后麻醉小鼠，取出海马组织，按照测定要求对其进行处理。
1.3.3 HE染色观察高原缺氧小鼠脑组织形态学变化
各组取2只小鼠，取脑组织，经生理盐水漂洗后放入10%甲醛溶液中浸泡，1周后，将样品送至联勤保障部队第940医院病理科，进行石蜡包埋，组织切片，染色以及光镜观察。
1.3.4 Western blot法检测高原缺氧小鼠海马中Nrf2途径蛋白含量及凋亡相关蛋白含量
将实验小鼠大脑取出，剖出海马体后，用BCA法测定其蛋白浓度，之后加入缓冲液，100 ℃水浴5 min，流水冷却后重复水浴5 min使其充分变性。以β-action为内参，配制10% SDS聚丙烯酰氨凝胶进行电泳、转膜和抗体孵育。次日使用ECL液进行显影，Image J图像分析软件对条带进行分析。其中一抗稀释比例为：β-action（1: 2000）、Keap1（1∶1000）、Nrf2（1∶2 000）、HO-1（1∶2 000）、Caspase-3（1∶2 000）、Bax（1∶1000）、BCL-2（1∶1000）。
1.4 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件分析结果，符合正态分布的实验数据以
$ \bar x \pm s $ 表示。多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。2. 结果
2.1 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠学习记忆的干预作用
与正常对照组相比，缺氧模型组小鼠WME、RWE、TE、TT均显著升高（P<0.01）；与缺氧模型组相比，利舒康胶囊三个剂量组小鼠四项指标均有不同程度降低，其中利舒康胶囊高剂量组800 mg/（kg·d）具有显著性差异（P<0.05或P<0.01），表明高原低氧缺氧能导致小鼠空间记忆障碍，而利舒康胶囊高剂量组能够增强高原缺氧小鼠的短期记忆和长期记忆能力，改善大鼠认知，有望对高原缺氧导致的学习记忆损伤患者提供预防和治疗。结果见表1和图2。
表 1 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠空间记忆的影响（$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 剂量（mg/kg） WME(次) RME(次) TT（秒） TE（次） 正常对照组 − 0.43±0.35 0.50±0.41 63.47±9.64 1.50±0.17 缺氧模型组 − 3.00±1.58## 2.70±1.52## 119.99±43.00## 3.10±0.48## 红景天胶囊组 400 0.57±0.35** 0.79±0.49* 81.78±28.20 1.83±0.29#** 利舒康胶囊低剂量组 400 2.43±0.89#▲ 1.36±0.56 99.45±25.27## 3.06±0.58##▲▲ 利舒康胶囊中剂量组 600 2.14±1.14#▲ 1.43±1.10 98.75±30.51 3.04±0.52##▲▲ 利舒康胶囊高剂量组 800 1.07±0.61* 0.71±0.49** 69.38±31.69* 1.73±0.37** # P<0.05, ## P<0.01, 与正常对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01，与缺氧组比较 ;▲P<0.05, ▲▲P<0.01，与红景天胶囊组比较 
图 2 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠空间记忆的影响（$ \bar x \pm s $ ，n=10）# P<0.05, ## P<0.01, 与正常对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01，与缺氧组比较 ;▲P<0.05, ▲▲P<0.01，与红景天胶囊组比较2.2 利舒康胶囊对缺氧小鼠脑组织形态学的影响
海马体在学习和记忆中发挥关键作用，尤其容易受到缺氧损伤。在本研究中，小鼠脑组织病理学切片结果显示（见图3），正常对照组小鼠海马神经元密集，细胞核大而圆，神经元呈层状有序分布，各层细胞形态饱满而数量多，细胞排列整齐且致密；缺氧模型组小鼠海马神经元细胞分布受到破坏，细胞形态不规则，部分细胞缺失或有空泡(黑色箭头)，出现明显核固缩（蓝色箭头），细胞排列紊乱，CA1区有较多不规则形状的深染细胞（绿色箭头），表明脑组织出现神经元死亡；经过红景天胶囊和利舒康胶囊药物干预后，缺氧模型组脑组织损伤有所改善；神经元细胞排列整齐，核固缩现象减轻（蓝色箭头），深染细胞数量减少（绿色箭头），少有细胞缺失或空泡（黑色箭头），细胞形态较好，排列整齐，且利舒康胶囊高剂量组脑组织形态趋于正常。
图 3 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠脑组织海马HE染色结果（×400）A. 正常对照组；B. 缺氧模型组；C. 红景天胶囊组；D. 利舒康胶囊低剂量组；E. 利舒康胶囊中剂量组；F. 利舒康胶囊高剂量组2.3 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠海马组织中Keap1/Nrf2/HO-1信号通路蛋白水平的影响
与正常对照组比较，缺氧模型组小鼠海马组织中Keap1蛋白含量显著升高（P<0.01），Nrf2、HO-1蛋白含量显著降低（P<0.01）；与缺氧模型组相比，利舒康胶囊组Keap1蛋白含量降低（P<0.01），Nrf2、HO-1蛋白含量显著升高（P<0.01），其中以利舒康胶囊高剂量组蛋白水平变化最为显著，且效果优于阳性药红景天胶囊组。结果见图4和表2。
图 4 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响1. 正常对照组；2. 缺氧模型组；3. 红景天胶囊组；4. 利舒康胶囊低剂量组；5. 利舒康胶囊中剂量组；6. 利舒康胶囊高剂量组表 2 各组小鼠脑组织蛋白表达比较（$ \bar x \pm s $ ，n=3）分组 剂量
（mg/kg）Keap1 Nrf2 HO-1 Caspase-3 Bax BCL-2 正常对照组 − 0.36±0.08 0.76±0.08 1.03±0.14 0.03±0.01 0.09±0.02 0.79±0.09 缺氧模型组 − 0.91±0.15## 0.45±0.03## 0.31±0.05## 0.95±0.12## 0.99±0.08## 0.31±0.02## 红景天胶囊组 400 0.44±0.03** 0.92±0.15** 0.86±0.03 0.75±0.16## 0.73±0.11##** 0.65±0.02#** 利舒康胶囊低剂量组 400 0.42±0.03** 0.77±0.09** 0.67±0.02## 0.86±0.17## 0.81±0.05##** 0.62±0.02##** 利舒康胶囊中剂量组 600 0.41±0.04** 0.83±0.09** 0.98±0.13 0.64±0.06## 0.79±0.06##** 0.73±0.09** 利舒康胶囊高剂量组 800 0.33±0.02**▲▲ 1.21±0.11##**▲▲ 1.23±0.08**▲▲ 0.46±0.01##**▲▲ 0.52±0.05##**▲ 0.76±0.11** # P<0.05, ## P<0.01, 与正常对照组比较；* P<0.05, ** P<0.01，与缺氧组比较；▲P<0.05, ▲▲P<0.01，与红景天胶囊组比较 2.4 利舒康胶囊对缺氧小鼠海马细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的影响
与正常对照组相比，缺氧模型组小鼠海马组织中Caspase-3和Bax的表达显著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.01）；与缺氧模型组相比，利舒康胶囊组Caspase-3和Bax蛋白表达显著降低（P<0.01），BCL-2蛋白表达显著升高（P<0.01），其中利舒康胶囊高剂量组蛋白水平变化尤为显著，且效果优于阳性药红景天胶囊组。结果见图5和表2。
图 5 利舒康胶囊对高原缺氧小鼠凋亡相关蛋白的影响1. 正常对照组；2. 缺氧模型组；3. 红景天胶囊组；4. 利舒康胶囊低剂量组；5. 利舒康胶囊中剂量组；6. 利舒康胶囊高剂量组3. 讨论
缺氧会引起机体组织细胞形态结构、功能和代谢的异常变化[13]。大脑对缺氧刺激异常敏感，短期暴露于高海拔地区的急性低压低氧会导致认知能力下降，尤其是空间学习、短期记忆和工作记忆能力下降。高原脑缺氧可引起中枢神经系统氧化性损伤，大量证据表明，氧化应激和细胞凋亡是神经元变性和死亡的主要诱因，进而造成机体认知功能损伤，且这种损伤为不可逆缺陷[14]。在本研究中，采用八臂迷宫实验方法检测高原缺氧环境下小鼠的空间记忆能力。通过利舒康胶囊高剂量组干预治疗后，WME、RME、TE和TT与缺氧模型组相比显著减少（P<0.05或P<0.01），表明利舒康胶囊能明显提高高原缺氧环境下小鼠的空间记忆能力。海马体是大脑中对缺氧最敏感的区域之一，也是形成空间记忆的关键区域[15]。HE染色结果显示，与正常对照组相比，缺氧模型组小鼠海马神经元细胞形态不规则，部分细胞缺失或有空泡；经利舒康胶囊干预后，细胞形态较好，排列整齐，少有细胞缺失或空泡。提示进行利舒康胶囊药物干预可以修复高原低压低氧造成的海马组织神经元损伤，防止了小鼠因暴露在高海拔环境中而导致的空间记忆障碍。
Keap1/Nrf2/HO-1信号通路是机体内保持细胞稳态的防御系统，在预防由氧化应激引起的细胞损伤中起重要作用，Nrf2是一种具有细胞保护和抗氧化活性的诱导蛋白，可被视为氧化应激反应的主调控因子[16-18]，HO-1可以催化血红素的分解，从而抑制中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞介导的炎性反应。在正常条件下，Keap1形成E3泛素连接酶的一部分，紧密调控Nrf2的活性，这时的Nrf2活性处在相对较低水平。在氧化应激条件下，Nrf2通过与细胞质中含有半胱氨酸残基的阻遏蛋白Keap-1分离而被激活，进而激活其相关的抗氧化酶HO-1表达，达到抵抗氧化应激的作用[19]。本文研究结果显示，与正常对照组相比，缺氧模型组海马细胞中Keap1蛋白表达升高（P<0.01）、Nrf2和HO-1蛋白表达下降（P<0.01），表明机体在缺氧环境中，ROS积累导致氧化还原状态失衡。经利舒康胶囊干预后，与缺氧模型组相比，Keap1蛋白表达下降，且具有显著性差异（P<0.01），Nrf2和HO-1蛋白表达均显著升高（P<0.01）,且利舒康胶囊高剂量组治疗效果最好，本课题组前期对利舒康胶囊对高原脑损伤防治的研究结果显示[20]，机体暴露在高原环境下，活性氧（ROS)大量累积导致氧化性损伤，利舒康胶囊能降低脑组织内MDA含量，提高SOD的活力，具有良好的抗氧化应激的作用。因此我们推测，利舒康胶囊可以通过调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路，发挥抗氧化作用。
氧化应激和炎症在脑损伤中起关键作用，导致细胞凋亡。细胞凋亡是器官生长、发育和维持正常体内平衡的重要过程，也是脑缺氧后神经元死亡的主要形式[21]。海马锥体神经元的凋亡可导致学习和记忆障碍[22]。Caspase-3作为凋亡激活剂是重要的凋亡调节因子，是缺氧诱导的脑细胞凋亡的重要标志，抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax可能参与病理性凋亡和坏死细胞死亡途径[23-25]。在本研究中，与正常对照组相比，缺氧模型组Caspase-3蛋白含量和Bax/Bcl-2比值表达显著增加（P<0.01），说明缺氧可引起脑组织细胞凋亡。而利舒康胶囊可通过降低Caspase-3蛋白表达和Bax/Bcl-2比值来逆转这些变化，抑制了氧化应激引起的脑细胞凋亡和炎症引发的脑损伤，且利舒康胶囊高剂量组优于阳性药红景天胶囊组。
综上所述，利舒康胶囊可以改善高原缺氧小鼠脑损伤，提高小鼠在高原缺氧环境下的抗氧化能力，其机制可能是通过调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路发挥抗氧化应激作用，减轻缺氧引起的ROS积累；同时通过抗氧化和抗凋亡机制在低压低氧暴露期间为海马神经元提供神经保护作用，从而改善缺氧诱导的小鼠空间记忆损伤。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突。
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表 1 昆仙胶囊部分活性成分
成分代码 化合物名称 OB(%) DL MOL000006 木犀草素（luteolin） 36.16 0.25 MOL000098 槲皮素（quercetin） 46.43 0.28 MOL000211 迈林（mairin） 55.38 0.78 MOL000296 赫达拉汀（hederagenin） 36.91 0.75 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 49.6 0.31 MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol） 36.91 0.75 MOL000359 谷甾醇（sitosterol） 36.91 0.75 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 41.88 0.24 MOL000449 豆甾醇（stigmasterol） 43.83 0.76 MOL000622 甘露聚糖（magnograndiolide） 63.71 0.19 MOL000953 胆固醇(cholesterol) 37.87 0.68 MOL001323 谷固醇α1(sitosterol alpha1) 43.28 0.78 MOL001494 甘露醇 (mandenol) 42 0.19 MOL001495 亚油酸乙酯（ethyl linolenate） 46.1 0.2 MOL001510 24-表氨酯（24-epicampesterol） 37.58 0.71 MOL001558 芝麻素（sesamin） 56.55 0.83 MOL001645 乙酸亚油酯（linoleyl acetate） 42.1 0.2 MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL001792 甘草苷元（liquiritigenin） 32.76 0.18 MOL001979 羊毛甾醇（lanosterol） 42.12 0.75 
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