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动脉粥样硬化（AS）作为一种慢性进行性疾病，能够引发脑卒中等一系列心脑血管疾病，从而对人类生命健康产生极大的威胁。AS发病机制复杂，目前认为主要与炎症反应、血管内皮细胞损伤、氧化应激、血小板活化等有关[1]。西药他汀类降脂药被广泛应用于治疗动脉粥样硬化，但其仍存在一定的局限性[2]。中药由于其具有多组分多靶点协同作用，在治疗慢性复杂疾病方面具有独特的优势因而受到更加广泛的应用[3]。
麝香保心丸（Shexiang Baoxin pill, SBP）源于宋朝《太平惠民合剂局方》中的苏合香丸[4]，收录于2020年版《中国药典》，是国家中药保密品种，上海和黄药业公司的独家生产品种。麝香保心丸由冰片、蟾酥、人工牛黄、人参提取物、肉桂、人工麝香和苏合香组成，具有芳香温通，益气强心之功效。主要用于气滞血瘀所致的胸痹和心肌缺血所致的心绞痛、心肌梗死[5]。麝香保心丸临床上不仅作为心绞痛急性发作的治疗药物，还可以用于冠心病的长期防治[6]。临床研究证实，长期（3个月以上）服用麝香保心丸可减轻并延缓心肌缺血的发生发展，减少心血管危险事件发生，并通过保护血管内皮细胞 、减少脂质浸润和抑制炎症等，阻遏AS的发展实现[7]。动物实验证实， 麝香保心丸具有减轻新西兰大耳兔和apoE-/-小鼠AS的作用[8-9]。
网络药理学是对复方中药进行研究的有效手段，能够发现药物作用靶点、筛选生物活性成分、评价药物毒性、研究作用机制和提高质量控制[10]等。本文利用网络药理学的手段研究麝香保心丸治疗AS的作用机制，为麝香保心丸得到临床长期应用提供理论依据。
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从TCMSP（
https://tcmspw.com/tcmsp.php ）[11]、TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/ ）、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/ ）[12]和BATMAN（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/ ）[13]等数据库中获取冰片、蟾酥、人工牛黄、人参提取物、肉桂、人工麝香、苏合香等七味药材所含化合物及其对应靶点。吸收、分布、代谢、排泄（ADME）指标是筛选活性化合物的重要指标，将全方所含化合物在TCMSP数据库中进行ADME筛选，将OB≥20%且DL≥0.1的化合物视为有效活性成分[14]，对不符合ADME筛选的化合物进行检视，将已被证明为生物活性成分的化合物进行回收，去除重复项，即得麝香保心丸全方有效成分及其潜在靶点。为了提高获取数据的可信度，将所获得的靶点信息进行进一步筛选，剔除BATMAN数据库中score低于48的靶点和TCMID中score低于400的靶点，并去除仅有一个成分作用的靶点，得到全方靶点信息。 -
从GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）[15]、OMIM（https://omim.org/ ）[16]、TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php ）、DrugBank（https://go.drugbank.com/ ）和DisGeNet（https://www.disgenet.org/search ）[17]等数据库中获取动脉粥样硬化疾病靶点。剔除DisGeNet中靶点分值低于0.02的靶点和GeneCards中分值低于1的靶点，合并各数据库靶点，得到AS相关的靶点蛋白。 -
将获取的麝香保心丸潜在靶点和AS相关靶点导入STRING（
https://string-db.org/ ）数据库，统一转换为基因ID。取两者交集，得到麝香保心丸治疗AS相关靶点及其对应的化合物，将获取的数据导入Cytoscape3.8.2软件中进行进一步分析，构建化合物-靶点网络，以便于分析网络中的关键节点。 -
通过STRING数据库对麝香保心丸治疗AS的靶点进行分析，构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并将PPI网络导入CytoScape3.8.2软件进一步进行分析，探究麝香保心丸治疗AS靶点之间的相互作用关系。
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使用Metascape（
http://metascape.org ）[18]数据库对获取的麝香保心丸抗AS靶点蛋白进行GO富集分析和KEGG通路分析，设定P<0.01，取生物学过程（GOBP）、分子功能（GOMF）和细胞成分（GOCC）条目的前10项，取KEGG富集通路的前20项，分析麝香保心丸治疗AS的主要相关通路及其功能。 -
各个数据库中共检索到麝香保心丸中474个化合物，对应的潜在靶点共有6158个。经筛选后共得到麝香保心丸中化合物124个，对应的潜在靶点为452个。
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结合GeneCards、OMIM、TCMSP、DrugBank和DisGeNet等数据库，经过筛选，得到AS相关靶点1786个。
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取麝香保心丸潜在靶点与AS相关靶点绘制维恩图（图1），取二者交集，即得麝香保心丸治疗AS的175个靶点，相关成分114个。采用STRING数据库对获取的175个靶点进行分析，得到一个具有175个点和2303个边的PPI网络（图2），通过对该网络图进行分析，根据各靶点在网络中的度值判断该靶点在网络中的重要程度。在麝香保心丸治疗AS的过程中，ALB、INS、ACTB、AKT1、IL-6、TNF、IL-1B、PPARG、MAPK3、CREB1等靶点的度值排在前10位，表明这些靶点作为关键节点起到最主要的作用。
图 1 麝香保心丸与动脉粥样硬化靶点维恩图
图 2 麝香保心丸治疗动脉粥样硬化蛋白之间相互作用网络
用CytoScape3.8.2软件构建麝香保心丸治疗AS的化合物及其对应的靶点网络（图3），得到具有289个节点和1166条边的复合网络，图中化合物节点为红色，靶点节点为绿色。依据PPI网络中各靶点度值对各化合物进行评分，每个化合物分值为其潜在作用靶点的度值之和，以分值高低为依据评判麝香保心丸治疗AS过程中的贡献度，筛选出关键的20个化合物（表1）。鹅去氧胆酸、人参皂苷Rb1、肉桂醛、胆酸、熊去氧胆酸等化合物作为关键化合物，分值为1486、925、827、809和805，分别作用63、17、42、49和31个靶点，体现了中药的多成分、多靶点协同作用特点。
图 3 化合物-靶点网络
表 1 麝香保心丸治疗AS过程中的关键化合物
化合物 分值 度值 来源 鹅去氧胆酸 1486 63 牛黄 人参皂苷Rb1 925 17 人参 肉桂醛 827 42 肉桂、苏合香 胆酸 809 49 牛黄 熊去氧胆酸 805 31 牛黄 人参皂苷Rh2 688 15 人参 油酸 674 16 肉桂 人参皂苷Rd 627 12 人参 肉桂酸 614 36 肉桂、苏合香 人参皂苷Rh1 607 13 人参 3-表齐墩果酸 603 25 苏合香 人参皂苷Rg1 583 13 人参 5-顺式-环十五烷-1-酮 547 23 麝香 5-顺式-环十四烷-1-酮 547 23 麝香 人参皂苷F1 546 12 人参 人参皂苷Rh4 546 12 人参 人参皂苷Rs1 546 12 人参 丙二酰基人参皂苷Rb2 546 12 人参 西洋参皂苷R1 546 12 人参 20-葡萄糖-人参皂苷Rf 528 11 人参 -
对GO富集条目进行分析（图4），麝香保心丸调控的靶点在质膜外侧、细胞质囊泡腔、内质网内腔、细胞顶端部分等区域富集，影响核受体活性、氧化还原酶活性、蛋白质结构域特异性结合、一氧化氮合酶调节活性等分子功能，调节血液循环、细胞对脂质的反应、细胞对激素刺激的反应、对脂多糖的反应等生物过程。KEGG通路富集显示（图5），麝香保心丸主要调节流体剪切应力与动脉粥样硬化、神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、胆汁分泌等通路，实现对AS的治疗效果。
图 4 GO富集分析
图 5 KEGG通路富集
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本研究基于网络药理学的方法探讨麝香保心丸治疗AS相关化合物及其潜在靶点和通路。本研究发现鹅去氧胆酸、人参皂苷Rb1、肉桂醛、胆酸、熊去氧胆酸可能在治疗AS时起到关键的作用。鹅去氧胆酸能够降低机体炎症反应、提高机体的抗氧化能力和缓解细胞自噬[19]。熊去氧胆酸能够促进AS模型ApoE(-/-)小鼠的胆固醇流出，降低炎症反应水平，减少AS斑块面积[20]。人参皂苷Rb1能够减轻炎症反应和氧化应激，并通过抑制细胞凋亡和促进自噬达到抑制ApoE(-/-)小鼠的早期AS的发展[21]。肉桂醛[22]能够调节IκB/NF-κB通路从而抑制炎症和氧化达到对AS的治疗效果。同时，这些关键成分也是麝香保心丸的入血成分，从侧面验证了网络药理学分析麝香保心丸治疗AS机制的可靠性[23]。
对麝香保心丸治疗AS的261个靶点进行分析，得到最主要的10个靶点。有研究证实，ALB与AS的严重程度具有显著的相关性[24]。AKT1参与代谢、细胞生长与存活、血管新生等多个过程进而防治AS[25]。INS是调节机体能量代谢的关键蛋白，胰岛素抵抗是导致AS的关键危险因素之一[26]。TNF能够调控细胞生长与凋亡[27]，且TNF能与IL-6和IL-1B协同作用诱导VEGF的生成，促进血管新生[28]。PPARG是降血脂药的关键受体之一，能够调节脂质代谢和抑制炎症[29]，对AS的防治起到重要的作用。这些关键靶点从各方面对AS进行治疗，且相互之间存在协调作用，达到了更好的治疗效果。
麝香保心丸治疗AS的靶点主要通过调节内分泌系统和信号转导系统，对炎症、免疫和氧化应激等过程进行调控，最终达到对AS的治疗作用。血管内皮剪切应力是心血管系统中的关键调控因子，低血管内皮剪切应力会诱发炎症并且使内皮细胞更容易被低密度脂蛋白和高血糖等危险因素影响，促进AS的发展[30]。钙离子作为第二信使在体内发挥重要作用，能够介导信号转导并调节生理功能，且钙离子能够促进AS斑块的形成，研究证实AS斑块中的钙离子浓度显著增加[31]。胆汁酸代谢是调节机体胆固醇水平的关键途径，且胆固醇还能通过与核受体协同作用进一步调节免疫和炎症反应，在AS的发生发展过程中发挥重要作用[32]。对这些通路进行分析发现麝香保心丸可能通过调节内分泌，调控炎症、免疫、脂质代谢，保护血管内皮细胞等作用达到对AS的治疗效果。
本研究通过网络药理学的方法全方面、多角度对麝香保心丸治疗动脉粥样硬化整体协同作用机制进行研究，发现了治疗过程中可能发挥主要作用的化合物、靶点和通路。本研究为麝香保心丸抗AS的机制研究提供了思路，为临床长期应用提供理论依据。
Mechanism of Shexiang Baoxin pill in the treatment of atherosclerosis based on network pharmacology
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摘要:
目的 研究麝香保心丸治疗动脉粥样硬化的作用机制，为临床长期应用提供理论依据。 方法 利用TCMSP、TCMID、ETCM和BATMAN数据库对麝香保心丸有效成分及靶点进行收集与筛选；利用GeneCards、OMIM、TCMSP、DrugBank和DisGeNet对动脉粥样硬化相关靶点进行收集与筛选；构建药物-化合物-靶点网络和靶点相互作用网络；通过MetaScape平台对麝香保心丸治疗动脉粥样硬化相关靶点进行GO和KEGG富集分析。 结果 筛选出麝香保心丸对动脉粥样硬化潜在治疗成分114个，对应175个靶点。网络分析结果表明，麝香保心丸主要活性成分为鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、肉桂醛和人参皂苷Rb1等入血成分。通路富集结果显示，麝香保心丸抗动脉粥样硬化的作用机制与调节免疫、炎症和代谢相关。 结论 麝香保心丸的活性成分可作用于ALB、INS、AKT1、ACTB、TNF、IL-6等靶点，调节多条通路实现对动脉粥样硬化的治疗作用。 Abstract:Objective To study the mechanism of Shexiang Baoxin pill in the treatment of atherosclerosis, and to provide a theoretical basis for long-term clinical application. Methods The chemical components and targets of Shexiang Baoxin pill were collected and screened by TCMSP, TCMID, ETCM and BATMAN databases. The targets related to atherosclerosis were collected and screened by DisGeNet, OMIM, TCMSP, DrugBank and DisGeNet. Drug-compound target network and protein-protein interaction network were constructed. Go and KEGG enrichment analysis of Shexiang Baoxin pill in the treatment of atherosclerosis were carried out on MetaScape platform. Results 114 potential therapeutic components of Shexiang Baoxin pill on atherosclerosis were selected, corresponding to 175 targets. The results of network analysis showed that the main active components of Shexiang Baoxin pill were chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, cinnamaldehyde and ginsenoside Rb1. The results of pathway enrichment showed that the anti-atherosclerotic mechanism of Shexiang Baoxin pill was related to the regulation of immunity, inflammation, and metabolism. Conclusion The active components of Shexiang Baoxin pill could act on ALB, INS, AKT1, ACTB, TNF, IL-6 and other targets, regulating multiple pathways to achieve the therapeutic effect on atherosclerosis. -
Key words:
- Shexiang Baoxin pill /
- network pharmacology /
- atherosclerosis /
- mechanism
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转录因子ZNF24(也称KOX17或ZNF191 )是类Krüppel锌指转录因子家族的成员，N端有一SCAN结构域(也称LeR结构域)，该区域不仅含有亮氨酸[1]，还有选择性的异型或同型寡聚物[2]；C端有四个连续的锌指模体且都是典型的类Krüppel样[2]。我们通过小鼠胚胎干细胞基因打靶，获得了ZF-12+/-（又称Zfp191，与ZNF24同源）ES细胞，并将细胞注射入小鼠的囊胚腔，得到了正常发育的ZF-12+/-小鼠，然而得到的ZF-12 −/-小鼠胚胎发育缓慢且在7.5 d左右胚胎致死[2]。最近研究表明，ZNF24通过调控微血管内皮细胞的增殖、迁移和侵袭，在内皮细胞的血管生成中起重要作用[3]。我们前期研究发现ZNF24作为一个因子拥有多种功能，比如参与激酶转录活性调控、血管增殖、大脑发育以及DNA损伤应答等[4]。
ZNF24基因最初由上海交通大学医学院的陈竺院士科研团队与复旦大学的余龙教授科研团队合作从造血细胞中克隆获得，定位于18q12.1[5]。该区域的缺失与人类多种肿瘤相关，如浸润性乳腺癌[6]、结直肠癌[7]等。余龙教授科研团队报道了ZNF24在肝癌中的不同作用：其在肝癌组织中表达上调，可通过与β-连环蛋白基因的启动子结合，激活β-连环蛋白基因转录，进而激活其下游靶基因如细胞周期蛋白 D1 (cyclin D1)基因，促进肝癌细胞的增殖[8]；也可直接与DNA甲基转移酶1（DNMT1）启动子结合，激活DNMT1基因转录，引起肝癌细胞DNA甲基化改变，进而激活PI3K-AKT途径促进肝癌细胞增殖[9]，提示ZNF24在肝癌中是癌基因。而在转移肝癌组织中ZNF24表达下调，ZNF24通过与DGL1（Discs Large 1） 启动子结合，激活DGL1基因转录，通过Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)信号通路抑制肝癌细胞的转移，提示ZNF24在肝癌转移中是抑癌基因[10]。此外，前列腺癌中ZNF24表达上调，通过调控Twist1促进肿瘤细胞上皮间质转换（EMT）、增殖、侵袭和转移，提示ZNF24在前列腺癌中是癌基因[11]。但是，ZNF24在甲状腺癌中表达下调，通过竞争性结合β-连环蛋白，抑制它与辅助因子LEF1/TCF1形成功能性复合物，从而抑制Wnt信号通路，进而抑制肿瘤增生与转移[12]，提示ZNF24在甲状腺癌中是抑癌基因。令人感兴趣的是，研究miRNA-940（microRNA-940）在肿瘤中的作用，发现ZNF24是其调控的靶基因，在三阴乳腺癌（TNBC）中miRNA-940靶向下调ZNF24，抑制三阴乳腺癌（TNBC）细胞的增殖和转移[13]，提示ZNF24促进TNBC细胞的增殖和转移是癌基因。但是，在人胃癌组织中miRNA-940 通过靶向抑制 ZNF24 表达，促进癌细胞的侵袭和转移[14]，提示ZNF24抑制胃癌细胞的侵袭和转移是抑癌基因。这些结果表明，ZNF24通过调控不同的靶基因，在多种不同肿瘤的发生发展、侵袭和转移中起着重要复杂的两面性作用（促进或抑制）。
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，在我国拥有较高的发病率和较低的生存率[15]。目前，结直肠癌与ZNF24的关系仍不明确。因此，我们构建ZNF24基因过表达的慢病毒载体，包装成病毒并转染结直肠癌细胞HCT116，获得了ZNF24基因过表达的HCT116细胞株，为后续研究的开展提供物质基础。
1. 实验材料
1.1 细胞及载体
293T细胞、人结直肠癌HCT116细胞、大肠杆菌感受态DH5α均来自本实验室，质粒pMT406、包装质粒pCMV-dR8.9、pCMV-VSV-G均购自上海Sangon Biotech公司。
1.2 主要试剂
限制性内切酶BamHI（R6021）、限制性内切酶XhoI（RK21100）、DNA胶回收试剂盒（AK1001）、逆转录试剂盒（RR037A）、荧光定量PCR试剂盒（RR420L）（Takara公司，日本）；质粒小提试剂盒（PD1211，Promega公司，美国）；无缝克隆试剂盒（C5891）、 AxyPrep 总RNA小量提取试剂盒（AP-MN-MS-RNA-250G）、兔抗ZNF24多克隆抗体（D324009）、兔抗GAPDH多克隆抗体（D110016）、山羊抗兔IgG（D111018）（Sangon Biotech公司，中国）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012A）、胰酶（C0202）（碧云天生物科技公司，中国）；DMEM细胞培养基（SH30022，赛默飞世尔生物科技公司，美国）；胎牛血清（6170-078， Ausbian公司，澳大利亚）。
2. 实验方法
2.1 ZNF24基因过表达慢病毒载体的构建
2.1.1 目的片段获取
ZNF24基因、3FLAG和相关引物均由上海Sangon Biotech公司合成。Primer 1和Primer 2用于PCR扩增ZNF24，产物大小为1 128 bp；Primer 3和Primer 4用于PCR扩增3FLAG，产物大小为111 bp； Primer 5和Primer 6用于菌落PCR鉴定，阳性产物大小为1 438 bp。引物序列见表1。
表 1 ZNF24基因、3FLAG的特异性引物序列以及相关引物序列片段名称 序列 Primer 1 TGGCAAAGAATTGGATCCGCC
ACCATGTCTGCACAGTCAGTGGAAGPrimer 2 AACTTTCACAACATTCAGAAGTTTT Primer 3 CTGAATGTTGTGAAAGTTGACTACAAGGATGA Primer 4 CATAATACTAGTCTCGAGTTATTTGTCGTCATCATC Primer 5 CGGCTCTAGAGCCTCTGCTA Primer 6 CGTGAGTCAAACCGCTATCCAC ZNF24（或3FLAG）的PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min（或10 s），共 30个循环；72 ℃延伸10 min。
2.1.2 载体线性化、重组质粒的构建与鉴定
用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切pMT406，胶回收线性化载体（大小约8 537 bp）。线性化的载体、PCR扩增的ZNF24与3FLAG产物，通过同源重组（无缝克隆）反应，将10 μl反应产物转化至DH5α。平皿培养过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定, 阳性克隆产物预期为1 438 bp。PCR阳性的克隆进一步测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pMT-ZNF24。
2.2 慢病毒载体包装、滴度测定
转染前24 h，胰酶消化并重悬293T细胞，取10个10 cm的培养皿，以1×107个/皿的细胞密度铺板。细胞贴壁后将原有培养基更换为Opti-MEM®培养基，体积为9 ml。取100 μg pMT-ZNF24(或pMT406)、65 μg pCMV-dR8.9、35 μg pCMV-VSV-G和适量Opti-MEM®培养基加入至15 ml无菌离心管中混匀，总体积为5 ml。再取500 μl细胞转染液和4.5 ml Opti-MEM®培养基混匀后滴加至上述离心管中，轻柔摇晃至均匀，室温孵育20 min。孵育完成后，将混合液分装到293T细胞中，每皿1 ml，轻轻摇晃混匀后放回培养箱。细胞培养6 h后弃上清液，加入10 ml DMEM培养基继续培养，2 d后收集细胞上清液。用60 ml 0.22 μm PVDF过滤装置过滤上清液, 4 ℃，25 000 r/min离心2 h，然后分装保存于−80 ℃冰箱。采用孔稀释法测定病毒滴度：准备5个EP管，各加入90 μl含10%FBS的高糖DMEM。EP管1中添加10 μl的待测病毒原液，EP管2中添加EP管1混合液10 μl，依次操作至EP管5。293T细胞接种到96孔板的 5个孔中，每孔约5×104个细胞，待细胞贴壁后去掉原液，依次加入EP管中的病毒液继续培养，24 h后换液，观察并记录3 d后稀释率最大孔中的荧光细胞数量。病毒滴度=荧光细胞数/病毒原液量。
2.3 慢病毒转染HCT116细胞
胰酶消化HCT116细胞，重悬后接种于24孔板中，每孔细胞约为3×105个，待细胞融合达30％时以细胞感染指数（MOI）=10计算病毒浓缩液体积并转染细胞。将HCT116细胞分为3组：空白对照组（HCT116细胞不转染病毒）、阴性对照组（HCT116细胞转染不含ZNF24的空载体慢病毒）和ZNF24组（HCT116细胞转染ZNF24过表达慢病毒）。转染72 h后，在ZNF24组和阴性对照组中加入 4 μg / ml嘌呤霉素，继续培养72 h后得到稳定表达细胞株。
2.4 实时荧光定量PCR检测ZNF24 mRNA的表达
慢病毒转染HCT116细胞，TRIzol法裂解细胞并提取RNA，mRNA反转录成cDNA后扩增ZNF24。ZNF24引物序列上游为CATTCCCTAAGGCACTGTGAT，下游为TTGAGGAACACCCATACTGAGA；GAPDH引物序列上游为TGACTTCAACAGCGACACCCA，下游为CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。2−ΔΔCt法分析ZNF24 mRNA的表达量。
2.5 蛋白印迹法检测ZNF24蛋白的表达
慢病毒转染HCT116细胞，裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞，提取总蛋白并测定浓度。SDS-PAGE电泳后转模，脱脂牛奶封闭1 h，室温一抗孵育3 h，室温荧光素标记二抗孵育2 h，Odyssey双色红外激光成像系统检测荧光信号。
2.6 统计学分析
实验数据以3个独立试验的（
$\bar{x} \text{±} s$ ）表示，采用 GraphPad Prism 5.0软件中单因素方差分析或t检验进行分析。3. 结果
3.1 PCR扩增及电泳结果
电泳结果显示，分别获得了大小约1 128 bp的ZNF24扩增产物与大小约111 bp的3FLAG扩增产物（图1）。
3.2 载体pMT406线性化
电泳结果显示，得到大小约8 537 bp线性化载体条带（图2）。
3.3 重组慢病毒载体pMT-ZNF24菌落PCR与测序鉴定
重组质粒经PCR扩增，电泳结果显示，获得约1 438 bp大小的阳性克隆PCR产物条带（图3）。对PCR产物进行测序比对分析，结果与目标序列完全一致。
3.4 病毒滴度检测结果及荧光显微镜下绿色荧光表达
ZNF24过表达慢病毒的滴度为3.25×109 TU/ml，ZNF24-NC慢病毒的滴度为6.19×109 TU/ml。以MOI=10计算病毒体积并转染HCT116细胞，4 μg /ml 嘌吟霉素筛选,荧光显微镜下约85%的细胞呈现绿色荧光蛋白（GFP）表达（图4）。
3.5 HCT116细胞中ZNF24 mRNA相对表达量比较
qRT-PCR结果表明，转染ZNF24过表达慢病毒的细胞组中ZNF24的mRNA表达显著高于阴性对照组和空白对照组（图5)。
3.6 HCT116细胞中ZNF24蛋白相对表达量比较
蛋白印迹检测结果显示，转染ZNF24过表达慢病毒的细胞组中ZNF24表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组 (图6)。
4. 讨论
结直肠癌是癌症致死的一个主要原因[16]，致死的关键要素是其高水平的复发和转移[17]。结肠癌的发病机制十分复杂，涉及多种癌基因、抑癌基因的异常表达。因此，研究结直肠癌的发病机制，特别是结直肠癌复发转移的机制极其重要。研究表明，多种转录因子在结直肠癌等肿瘤中异常表达，参与结直肠癌的发病、转移和侵袭，如在肿瘤微环境参与VEGF表达调控的 STAT3转录因子已成为新的抗肿瘤药物的作用靶点[18]。
体外与乳腺癌细胞肿瘤动物模型的研究表明，ZNF24通过与血管内皮生长因子（VEGF）启动子上游序列（−144/−134, 非（TCAT） n重复序列）直接结合抑制VEGF基因转录，从而抑制血管增生达到抑制肿瘤生长[19]。然而，敲减人微血管内皮细胞中的ZNF24导致细胞迁移，侵袭和增殖减弱，暗示ZNF24具有促进人微血管内皮细胞的血管生成潜力[3]。多项研究表明ZNF24通过调控不同靶基因（如Twist1[11]、β-连环蛋白[8]和DGL1[10]等）的转录表达以及竞争性结合蛋白因子[8]，在多种不同肿瘤的发生发展、侵袭和转移中起着重要复杂的两面性作用（促进或抑制）。
本研究成功构建了ZNF24过表达慢病毒载体，获得相应的病毒。转染HCT116细胞，获得稳定过表达ZNF24的HCT116细胞株，为开展后续研究提供了物质基础。
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表 1 麝香保心丸治疗AS过程中的关键化合物
化合物 分值 度值 来源 鹅去氧胆酸 1486 63 牛黄 人参皂苷Rb1 925 17 人参 肉桂醛 827 42 肉桂、苏合香 胆酸 809 49 牛黄 熊去氧胆酸 805 31 牛黄 人参皂苷Rh2 688 15 人参 油酸 674 16 肉桂 人参皂苷Rd 627 12 人参 肉桂酸 614 36 肉桂、苏合香 人参皂苷Rh1 607 13 人参 3-表齐墩果酸 603 25 苏合香 人参皂苷Rg1 583 13 人参 5-顺式-环十五烷-1-酮 547 23 麝香 5-顺式-环十四烷-1-酮 547 23 麝香 人参皂苷F1 546 12 人参 人参皂苷Rh4 546 12 人参 人参皂苷Rs1 546 12 人参 丙二酰基人参皂苷Rb2 546 12 人参 西洋参皂苷R1 546 12 人参 20-葡萄糖-人参皂苷Rf 528 11 人参 
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