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我国乙肝患病率高,因此重视各类肝病研究和治疗极为重要[1]。肝纤维化作为各类肝脏疾病的前期症状，更应重点关注。肝纤维化是肝脏内弥漫性细胞外基质过度累积,导致肝内纤维结缔组织异常沉积的自我损伤修复反应[2]，是多数慢性肝脏疾病向肝硬化进展的必经过程[3],会引发腹水、肝性脑病等并发症，极大地危害了人类的生命健康。因此，在早期就重视肝纤维化，并采取积极有效的治疗措施对于阻止该疾病的进一步发展,甚至逆转肝纤维化具有重要的意义。目前已有大量中医药研究表明，药性以寒性、温性居多,药味以苦味、辛味为多,归经以肝经、脾经、胃经为主的中药对于抗肝纤维化有较为显著的作用[4]。
白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia tacti lora Pall）的干燥根，味苦酸甘，性微寒，归肝、脾经，兼具正治、旁治、反治三法而调肝[5]。有研究认为白芍为肝病治疗方面极为重要的一味药，白芍及其复方可用于肝纤维化疾病的治疗，并产生明显的改善作用[6-7]，但具体作用机制尚不明确。因此，本研究基于网络药理学“多成分、多靶点、多途径”的方法，分析白芍治疗肝纤维化过程中的活性成分、作用靶点及多种途径，为后续基础研究及临床实验研究提供数据支持及科学依据。
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在中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库Herb Name中输入“白芍”，设置ADME参数为：口服生物利用度（OB）>30%、类药性（DL）>0.18，筛选白芍的有效活性成分。进入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库查找与白芍有效活性成分相对应的Smiles表达式，导入Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）数据库，预测白芍有效活性成分对应的靶点。
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使用GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库、OMIM（https://omim.org/）数据库筛选肝纤维化对应靶点，以“liver fibrosis”为关键词进行筛选。
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通过Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平台绘制韦恩图，筛选白芍与肝纤维化疾病的共同靶点。将共同靶点的数据导入Cytoscape3.9.0软件，构建“白芍-活性成分-靶点-肝纤维化”网络图进行分析，根据Degree值区别节点大小，Degree值越大，表明该节点在网络中越重要。
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将上述白芍于肝纤维化疾病的共同靶点的数据导入String（https://cn.string-db.org/）数据库，物种（Organisms）选择人（Homo sapiens），设置为medium confidence（0.400），构建蛋白相互作用图，即PPI网络，并下载其TSV文件，导入Cytoscape3.9.0软件中进行拓扑参数分析，并根据Degree值区别节点的大小，Degree值越大，表明该节点在网络中越重要 。
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将白芍与肝纤维化共同的49个靶点信息输入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，设置物种为人，P<0.01，分别勾选GO分析中的生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）以及Pathway中的KEGG进行富集分析，提取结果后，应用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）平台绘制气泡图进行可视化分析，其中P值显示为各节点的颜色变化，基因数显示为气泡大小。
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在TCMSP数据库中发现85个白芍的化学成分，设置ADME参数为口服生物利用度（OB）<30%、类药性（DL）<0.18后即筛出13个白芍的有效活性成分。将活性成分导入PubChem数据库查找Smiles表达式，其中有4个活性成分（MOL001910、MOL001918、MOL001928、MOL001930）未查询到相应的Smiles表达式。将剩余9个有效活性成分导入Swiss Target Prediction数据库，预测白芍有效活性成分对应的靶点，其中有2个活性成分（MOL001921、MOL000492）无相关作用靶点。因此，共获得符合筛选条件的白芍活性成分6个，见表1。
表 1 白芍活性成分表
成分代码 成分名称 中文名称 OB% DL MOL001919 (3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-dihydroxy-4,4,8,10,
14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahydro-1H-cyclopenta
[a]phenanthrene-15,16-dione(3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-二羟基-4,4,8,10,
14-五甲基-2,3,5,6,7,9-六氢 -1H-环戊
[a]菲 -15,16-二酮43.56 0.53 MOL001924 paeoniflorin 芍药苷 53.87 0.79 MOL000211 Mairin 白桦脂酸 55.38 0.78 MOL000358 beta-sitosterol β-谷甾醇 36.91 0.75 MOL000359 sitosterol 谷甾醇 36.91 0.75 MOL000422 kaempferol 山萘酚 41.88 0.24 -
通过检索GeneCards数据库，共获得7711个肝纤维化疾病靶点，设置“Relevance Score”>10，筛选出靶点773个，再检索OMIM数据库，共得到56个条目，去重后共得到155个靶点。将二数据库所得到的疾病靶点汇总并去重，共得到883个靶点。绘制韦恩图，见图1。通过二者交集部分可知白芍治疗肝纤维化的潜在靶点有49个。
图 1 白芍治疗肝纤维化潜在靶点的韦恩分析图
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利用Cytoscape3.9.0软件构建“白芍-有效成分-交集靶点-肝纤维化”网络图，见图2，根据Degree值区别节点大小，Degree值越大，颜色越深。因此，分析结果表明，白芍治疗肝纤维化的主要活性成分前四位为山奈酚、芍药苷、白桦脂酸及β-谷甾醇。
图 2 “白芍-有效成分-交集靶点-肝纤维化”网络图
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将药物白芍与疾病肝纤维化的共同作用靶点导入String数据库，物种（Organisms）选择人（Homo sapiens），设置为medium confidence（0.400），获得节点数（node）49，边数（edge）328，平均节点度（average node degree）13.4，平均局部聚类系数（avg. local clustering coefficient）0.633，PPI富集P<1×10−16，构建白芍与肝纤维化共同靶点蛋白PPI网络图，见图3。
图 3 白芍与肝纤维化共同靶点蛋白PPI网络图
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将白芍与肝纤维化共同作用靶点导入Cytoscape3.9.0软件进行网络分析（见图4）。Degree值越大，圆形的直径越大，颜色越红，说明在该网络中的关联度就越高，其中，Degree值排名前5的分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、肉瘤基因（SRC）、表皮生长因子受体（EGFR）和基质金属蛋白酶-9（MMP9），他们的Degree值分别为35、33、30、29和28。因此，推测这些靶点在白芍治疗肝纤维化过程中具有较为重要的作用。
图 4 白芍与肝纤维化共同靶点蛋白相互作用网络图
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运用DAVID数据库，将药物与疾病的共同靶点进行GO(BP、CC、MF）分析以及KEGG分析，取P值<0.01，所得富集分析数据导入微生信平台，通过气泡图显示前20个分析结果。BP富集分析结果见图5、CC富集分析结果见图6、MF富集分析结果见图7、KEGG通路富集分析结果见图8。
图 5 BP富集分析气泡图
图 6 CC富集分析气泡图
图 7 MF富集分析气泡图
图 8 KEGG通路富集分析气泡图
在GO富集分析中，分别对生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）的前20个条目制作气泡图进行可视化分析。其中，富集条目在纵坐标上表示，富集基因个数在横坐标上表示。图5显示的BP主要涉及血管平滑肌细胞增殖的正向调节、细胞应激反应、磷脂酰肌醇3-激酶信号的正向调节、基因表达的负调控等；图6显示的CC主要涉及细胞外基质、细胞外间隙、高分子复合物、受体复合体、质膜等部位；图7显示的MF主要涉及RNA聚合酶ⅱ转录因子活性、锌离子结合、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性等，表明白芍在多种途径上对肝纤维化均产生影响。
KEGG通路富集分析共67条路径，选取前20个条目制作气泡图进行可视化分析，根据图8可知，与肝纤维化相关的分别有癌症通路（21个靶点）、癌症中的蛋白聚糖（14个靶点）、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性（9个靶点）、膀胱癌（8个靶点）、前列腺癌（7个靶点）等。其中涉及到的靶点基因，出现频率较高的为AKT1、EGFR、SRC、VEGFA、MMP3及MMP9。
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肝纤维化的病理过程是由于肝细胞受损后,肝星状细胞（HSC）增殖活化，进一步分化成为肌成纤维（MFB），使细胞外基质（ECM）过度沉积的一种状态[8]。刘海成等[9]研究表明，中药对于肝纤维化的延缓及逆转是有效的。中药白芍味苦酸甘，性微寒，有敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效[5]，在肝纤维化治疗中疗效可靠。
本研究通过TCMSP数据库筛选白芍有效活性成分6个，分别是(3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-二羟基-4,4,8,10,14-五甲基-2,3,5,6,7,9-六氢-1H-环戊[a]菲-15,16-二酮、芍药苷、白桦脂酸、β-谷甾醇、谷甾醇及山萘酚。通过PubChem和Swiss Target Prediction数据库筛选出213个白芍作用靶点。通过GeneCards数据库和OMIM数据库检索并去重，筛出883个肝纤维化相关靶点。通过venny平台，取白芍作用靶点与肝纤维化靶点的交集部分，获得49个共同靶点。构建“白芍-有效成分-交集靶点-肝纤维化”网络图，得到白芍治疗肝纤维化的主要活性成分前四位分别为山奈酚、芍药苷、白桦脂酸及β-谷甾醇。将上述共同靶点导入String数据库，获得白芍与肝纤维化共同靶点蛋白PPI网络图，根据Degree值的大小筛选出5个关键靶点，分别是AKT1、EGFR、SRC、VEGFA、MMP3及MMP9。GO富集分析中显示白芍在生物过程、细胞组成、分子功能等多个途径上对肝纤维疾病均产生影响。KEGG通路富集分析中显示，癌症、炎症、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性等通路是白芍与肝纤维化疾病共同靶点富集最多的通路。
通过构建“白芍-有效成分-交集靶点-肝纤维化”网络图，可知白芍治疗肝纤维化的主要活性成分前四位为山萘酚、芍药苷、白桦脂酸及β-谷甾醇。山萘酚属于黄酮类化合物，具有抗炎、抗癌、免疫调节等作用[10]，Taifu等 [11]研究发现，山萘酚可有效降低肝组织坏死程度，抑制胶原蛋白沉积和HSC活化。沈雨莎等[8]研究发现，芍药苷可通过抑制NOX、HIF-1α，激活Nrf2等的表达、抑制炎症因子的释放、在基因层面抑制NF-Kβ等多种途径抑制HSCs产生ECM发挥抗肝纤维化作用，从而形成抗炎保肝的作用[12]。白桦脂酸是三萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤等作用，通过增加MMP-13以及t-HSC/Cl-6细胞中P-STAT3的表达,发挥抗肝纤维化的作用[13]。Kripa等[14]研究发现，白术中的β-谷甾醇可有效降低佐剂诱导的关节炎大鼠血清和组织中的炎性指标含量，说明β-谷甾醇具有一定抗炎作用[15]。综上所述，白芍中的主要活性成分具有抗炎保肝等多种药理作用，这为治疗肝纤维化疾病提供支持，有一定的科学依据和研究价值。
GO富集分析显示269个生物过程、30个细胞组成、64个分子功能。根据此分析推测这些主要靶点主要集中在细胞外基质、细胞外间隙、高分子复合物、受体复合体、质膜等部位发挥作用，通过血管平滑肌细胞增殖的正向调节、细胞应激反应、磷脂酰肌醇3-激酶信号的正向调节、基因表达的负调控等生物过程，发挥RNA聚合酶ⅱ转录因子活性、锌离子结合、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析显示共67条通路，排名较前列的通路集中在癌症、炎症、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性等通路。其中，癌症通路所连接的靶点最多（21个靶点），表明如抑制该通路可阻滞肝纤维化向肝癌发展。Feng等[16]研究发现，EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路可通过抑制EGFR下游蛋白激酶B及其磷酸化，降低细胞周期蛋白B1的表达，从而抑制HSC增殖活化。
通过PPI网络的分析发现，Degree值较高的是AKT1、VEGFA、SRC、EGFR和MMP9，推测这些靶点在白芍治疗肝纤维化过程中具有较为重要的作用。AKT1是AKT激酶之一，AKT信号通路可通过抑制肝组织细胞EMT，发挥抗肝纤维化的作用[17]。VEGFA是促血管生成因子血管内皮生长因子A，肝细胞敲除VEGFA后可减轻血管内皮功能障碍,可抑制HSC活化增殖，进一步抑制肝纤维化[18]。SRC是肉瘤基因，可抑制HSC活化，从而抑制肝纤维化[19]。EGFR是表皮生长因子，可活化HSC，抑制其信号传导，可以起到延缓或逆转肝纤维化的作用[20]。MMP9 是基质金属蛋白酶-9，可直接或间接调控 ECM 的降解，研究表明其对肝纤维化的影响与炎症之间存在关联[21]。综上，这些靶点参与了肝纤维化的发展过程，主要涉及HSC的活化、炎症及ECM 的降解等，与当前研究相符，可作为药物的作用靶点。
本研究通过中药活性成分的筛选、靶点及有效活性成分的预测、蛋白相互作用网络图的构建等，利用网络药理学“多成分、多靶点、多途径”的分析方法，通过数据挖掘来阐述白芍治疗肝纤维化的作用机制，发现白芍多成分通过AKT1、VEGFA、SRC、EGFR和MMP9等多靶点，在HSC的活化、炎症及ECM的降解上抑制肝纤维化，并对肝纤维化的进程进行干预和调控。进而为开发治疗肝纤维化的中药新药提供有效的思路和方法。但是，本研究所得到的结果尚存一定局限性，因数据库数据有限会导致分析结果受限，获取靶点数量有限并不适用于新的作用靶点的发现，不能完全揭示药理作用。因此，为进一步明确白芍治疗肝纤维化的作用机制，仍需做相关动物实验进行深入验证，以准确揭示白芍抗肝纤维化的作用机制。
Mechanism of Radix Paeoniae Alba in the treatment of liver fibrosis based on network pharmacology
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摘要:
目的 基于网络药理学方法探讨白芍治疗肝纤维化的可能作用机制。 方法 使用TCMSP数据库筛选出白芍的活性成分。借助PubChem和Swiss Target Prediction数据库预测白芍有效成分的潜在作用靶点。运用GeneCards及OMIM数据库筛选肝纤维化对应靶点，利用Venn2.1.0获得白芍与肝纤维化疾病的共同靶点。使用Cytoscape3.9.0软件构建“白芍-有效成分-交集靶点-肝纤维化”网络图，预测主要活性部位，使用String数据库绘制PPI网络。利用DAVID数据库对有效作用靶点进行GO分析及Pathway中的KEGG进行富集分析。 结果 筛选得到白芍有效成分6个，作用靶点213个；肝纤维化靶点155个；白芍治疗肝纤维化的靶点49个；主要活性成分是山萘酚、芍药苷、白桦脂酸及β-谷甾醇。GO富集分析显示269个生物过程、30个细胞组成、64个分子功能，KEGG通路富集分析共67条通路。 结论 通过网络药理学方法初步研究白芍抗肝纤维化的作用机制，表明白芍具有多成分、多通路、多靶点等的作用特点，为进一步相关实验研究提供参考。 Abstract:Objective To explore the possible mechanism of Radix Paeoniae Alba on hepatic fibrosis based on network pharmacology. Methods Tcmsp database was used to screen the active components of Paeonia alba. With the help of PubChem and Swiss target prediction database, the potential action targets of the effective components of Paeonia Alba were predicted. GeneCards and OMIM databases were used to screen the corresponding targets of liver fibrosis, and venn2.1.0 was used to obtain the common targets of white peony and liver fibrosis. Cytoscape 3.9.0 software was used to build the network diagram of “white peony - active ingredients - intersection target - liver fibrosis” and to predict the main active sites. String database was used to draw the PPI network. Go analysis of effective targets and enrichment analysis of KEGG in pathway were performed by David database. Results Six effective components, 213 targets of Paeonia Alba and 155 hepatic fibrosis targets were screened. There were 49 targets of Radix Paeoniae Alba in the treatment of liver fibrosis. The main active ingredients are kaempferol, paeoniflorin, mairin and β-Sitosterol. Go enrichment analysis showed 269 biological processes, 30 cell compositions, 64 molecular functions, and 67 pathways in KEGG pathway enrichment analysis. Conclusion The mechanism of anti-hepatic fibrosis of Radix Paeoniae Alba has been preliminarily studied through network pharmacology, which shows that Radix Paeoniae Alba has multi-component, multi-target, and multi-channel effects, and provides reference for further experimental research. -
Key words:
- Radix Paeoniae Alba /
- Liver fibrosis /
- Mechanism of action /
- network pharmacology
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脂肪性肝病（脂肪肝）是由各种原因引起的以肝细胞弥漫性脂肪变为病理特征的一种临床综合征，多数患者伴有代谢性疾病、心血管疾病与胆道系统疾病。根据流行病学调查研究显示：全球25%的成人患有脂肪肝，我国脂肪肝的患病率高达27%且有逐渐年轻化的趋势[1]。脂肪肝可逐步发展为肝炎、肝硬化甚至肝癌，故而早期干预脂肪肝的发展是保障广大人民健康与减轻国家医疗负担的重要举措。现代医学主要通过调整生活方式、应用抗肝损伤及抗代谢紊乱的药物（如他汀类）进行治疗。目前，中西医结合治疗脂肪肝越来越被当代社会推崇。降脂护肝胶囊是原湖州福音医院中医科老中医赵文敏主任医师多年的经验用方，于20世纪90年代已在该院推广使用，并形成院内协定处方。其由山楂、姜黄、茵陈、葛根和决明子五味中药组成，具有平肝降脂、活血化瘀的作用，将其与西药配合应用对脂肪肝的治疗效果显著[2-3]，但其作用机制尚不明确。本文旨在应用网络药理学的方法对降脂护肝胶囊的作用机制进行探究，以期为日后的实验研究与临床应用提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 药物靶点的筛选
本研究采用计算系统生物学实验室的中药系统药理学数据库和分析平台 (TCMSP；http://lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php) 与Traditional Chinese Medicines Integrated Database (TCMID；http://119.3.41.228:8000/tcmid/search/) 检索中药姜黄、茵陈、葛根和决明子的活性成分。因山楂在TCMSP数据库中未收录，笔者应用TCMID对山楂进行活性成分检索，利用TCMID对其余中药的活性成分进行补充。根据化合物口服生物利用度 (OB) 与类药性 (DL) 进行筛选，OB 阈值设为 OB≥30%，DL 阈值设为 DL≥0.18[4-5]。此外，由于齐墩果酸、熊果酸、葛根素、姜黄素和6,7-二甲氧基香豆素等化合物已被证实具有较好的降脂作用，而且在降脂护肝胶囊中的含量也较高，故将上述化合物也纳入活性成分范围内[6-8]，并通过TCMSP数据库获取成分靶点。
1.2 疾病靶点的收集
以 “fatty liver” “liver steatosis”等为关键词检索 GeneCard（https://www.genecards.org/）数据库与OMIM数据库（https://omim.org/），收集与脂肪肝相关的作用靶点[9]。
1.3 构建化合物-靶点网络
为明确疾病靶点与药物靶点之间的关系，将两部分靶点进行交集，输入 Cytoscape软件构建化合物-靶点网络。Cytoscape 软件的核心架构是网络，每个节点是基因或活性成分，节点与节点之间的连接代表这些生物分子之间的相互作用，节点的度值代表网络中节点与节点相连的数目，度值越大说明该活性成分或靶点处于越核心的位置。
1.4 构建蛋白相互作用网络
为更深层次探究靶点之间的相互作用关系，将交集所得的共同靶点上传至线上软件String10.5 (http://stringdb.org)，构建蛋白相互作用网络。物种选择为 Homosapiens，置信度设置为>0.9，其余参数保持默认设置，获取 PPI 网络。
1.5 生物过程与通路分析
利用 R Project 中的 org.Hs.eg.db 程序包（http://www.bioconductor.org/packages/ release /data /annotation/html/org.Hs.eg.db.html）将基因 symbols 转变为 Entrez IDs，进而利用 clusterProfiler 程序包（3.6 版）（http://bioconductor.org/packages http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html）对网络进行 GO 分析和 KEGG 通路分析。设定 P<0.05，并按照涉及的靶点数目多少进行排序，获取 GO 富集分析的前20个条目以及 KEGG 富集的前 20 条信号通路[10]。
2. 结果
2.1 潜在活性成分的筛选与对应靶点的收集
通过TCMSP数据库检索到决明子活性成分68个，姜黄活性成分52个，葛根活性成分18个，茵陈活性成分53个，通过TCMID数据库检索到山楂活性成分94个，茵陈活性成分58个，姜黄活性成分109个，葛根活性成分51个，决明子活性成分57个。根据OB≥30%与DL≥0.18，筛选出决明子活性成分14个，葛根活性成分4个，茵陈活性成分13个，姜黄活性成分3个，山楂活性成分3个。将山楂中的齐墩果酸、熊果酸、咖啡酸、金丝桃苷、表儿茶素，葛根中的葛根素、黄豆苷元，姜黄中的姜黄素、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、二氢姜黄素与茵陈中的滨蒿内酯，纳入活性成分范围。其中，MOL000358（β-谷甾醇）为茵陈和葛根的共有成分，MOL000953（胆甾烷醇）为姜黄和决明子的共有成分，MOL000449（豆甾醇）为决明子和姜黄的共有成分。按照类别计数符合标准的活性成分共计46个，部分化合物见表1。通过TCMSP数据库获取上述中药活性成分的靶点，除去重复靶点，共获得靶点133个。
表 1 降脂护肝胶囊部分活性成分化合物编号 化合物名称 口服生物利用度 类药性 MOL000953 胆甾烷醇 37.87 0.68 MOL000493 菜油甾醇 37.58 0.71 MOL005043 (3β,24R)-麦角甾-5-烯-3-醇 37.58 0.71 MOL000354 异鼠李素 49.60 0.31 MOL000358 β-谷甾醇 36.91 0.75 MOL004609 茵陈黄酮 48.96 0.41 MOL005573 芫花素 37.13 0.24 MOL007274 玄参黄酮 30.35 0.30 MOL008039 异茵陈黄酮 57.40 0.41 MOL008040 异泽兰素 46.11 0.33 MOL008041 泽兰素 42.55 0.37 MOL008043 茵陈色原酮 57.56 0.31 MOL008046 去甲氧基茵陈色原酮 52.33 0.25 MOL008047 阿特匹林A 68.32 0.24 MOL000098 槲皮素 46.43 0.28 MOL000392 芒柄花黄素 69.67 0.21 MOL006466 红镰玫素 45.55 0.24 MOL002959 3'-甲氧基大豆黄素 48.57 0.24 MOL003629 大豆苷元 47.27 0.67 MOL002268 大黄酸 47.07 0.28 MOL002281 决明内酯 46.46 0.24 MOL000449 豆甾醇 43.83 0.76 MOL000471 芦荟大黄素 83.38 0.24 2.2 疾病相关靶点的筛选
从GeneCard 与OMIM数据库去除重复基因后，获得与脂肪肝相关的靶点7406个。
2.3 化合物-靶点网络构建
将“2.1”中的133个降脂护肝胶囊活性成分靶点与“2.2”中的7406个脂肪肝靶点，输入Venny2.1软件绘制韦恩图，两者进行交集后，获得疾病-药物成分共同靶点118个，见图1。采用Cytoscape软件构建的活性成分-靶点网络，该网络共包含157个节点(39个化合物节点，118个靶点节点)和327条边，其中，红色节点表示化合物，绿色节点表示药物靶点，连接化合物与靶点的边表示它们之间有作用关系，见图2。表2列出了化合物-靶点网络中的关键节点、类别及其度值。活性成分度值排名前5位的是槲皮素（quercetin）、黄豆苷元（daidzein）、熊果酸（ursolic acid）、葛根素（puerarin）和异鼠李素（isorhamnetin），这5种化合物的节点数分别是71、37、27、25和16。靶点度值排名前5位的是前列腺素过氧化物合酶1（PTGS1）、核受体共激活因子2（NCOA2）、丝氨酸蛋白酶1（PRSS1）、雌激素受体2（ESR2）和雄激素受体（AR），分别能与26、17、13、11和11个化合物发生相互作用，体现了中药多成分、多靶点的特性。
表 2 化合物-靶点网络的关键节点及其度值名称 类别 度值 名称 类别 度值 槲皮素 化合物 71 芦荟大黄素 化合物 12 黄豆苷元 化合物 37 β-谷甾醇 化合物 12 熊果酸 化合物 27 芒柄花黄素 化合物 11 PTGS1 基因 26 ESR2 基因 11 葛根素 化合物 25 AR 基因 11 NCOA2 基因 17 ESR1 基因 11 异鼠李素 化合物 16 GSK3B 基因 10 PRSS1 基因 13 PPARG 基因 10 2.4 PPI 网络的构建与分析
应用String软件构建PPI网络(图3)，在此网络图中包含103个节点、474条边，同时得到网络中关键靶点的频次 (图4)。根据“度值>均值”筛选出关键节点38个，包括：CCND1、ESR1、EGFR、RELA、FOS、NCOA1、MAPK8、APOB、IL6、NCOA2、PRKCA、RB1、AR、ATF2、RHOA、CASP3、CASP8、CCNB1、ERBB2、PCNA、VEGFA、CYP1A1、GSK3B、MYC、PPARG、CDKN1B、CTSD、HIF1A、P4HB、PSMD3、BARD1、BCL2、CHRM2、ESR2、IGFBP3、NOS3、PGR、PTPN6。度值最高的是CCND1，度值为17；其次为ESR1，度值为16；EGFR、RELA的度值为15，FOS、NCOA1度值为14。度值大的靶点提示在网络调控中起关键作用，且很可能是降脂护肝胶囊治疗脂肪肝的关键靶点。
2.5 GO与KEGG富集分析
GO富集条目（图5）主要包括：DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活转录因子活性、DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、DNA结合转录激活活性、类固醇激素受体、类固醇结合、整合素结合、核受体结合等。KEGG富集信号通路（图6）主要包括：PI3K-Akt信号通路、人巨细胞病毒感染、癌症中的微小RNA、乙型肝炎、EB病毒感染等。其中，PI3K-Akt信号通路的靶点主要包括：GF、RTK、CK、CKR、GPCR、PKC、NOS、Raf、GSK3、Myc、CCND1、p27、Cyclin、p27Kip1、Bcl-2、CASP9、CREB、Mcl-1、NF-ĸB。乙型肝炎的靶点主要包括：Fas、JNK、c-Myc、SAPK、NF-ĸB、IĸB、Bcl2、CASP8、CASP3、CASP9、pRb、PKC、Survivin、ATF2、CREB、PCNA、Raf、AP-1、ELK-1、IL6（图7、图8）。
3. 讨论
中医学认为脂肪肝病位在肝，病因主要与过食肥甘厚腻、嗜酒无度有关，疾病早期多为脾失健运，痰湿内生，湿郁化热；疾病后期多见热灼营阴，炼液成痰，痰瘀互结，故而脂肪肝在早期应以清利湿热为主，在后期当在清利湿热的基础上佐以活血化瘀。临床上脂肪肝患者早期无特征性症状，故而容易被患者忽视，当疾病进展到一定程度，患者才来到医院寻求治疗。降脂护肝胶囊以清利湿热、祛瘀活血为治疗原则，对脂肪肝后期具有良好的治疗作用。方中山楂消食化积、行气活血、降脂化浊，茵陈清利湿热、疏肝护肝，两者针对痰瘀互结之病机根本，共为君药；葛根通经活络，解酒毒降脂为臣药；决明子清肝通便泄浊，姜黄活血行气为佐使药。现代药学研究表明，山楂的主要化学成分主要有槲皮素等黄酮类化学成分，以及熊果酸等三萜酸及绿原酸、柠檬酸等有机酸等。研究表明，其中总黄酮及三萜酸等化学成分是山楂降脂作用的主要活性成分，可以抑制低密度脂蛋白的氧化修饰，减少脂质过氧化物的形成，发挥降血脂的作用[11-13]。茵陈的化学成分主要有6,7-二甲氧基香豆素类、绿原酸、对羟基苯乙酮和挥发油等化学成分，这些成分也是茵陈的降脂和保肝的主要活性成分[14-16]。葛根的化学成分主要有葛根素等异黄酮化合物，这类化合物具有降脂和保肝作用，是葛根降脂作用的主要活性成分[17-19]。决明子的主要化学成分为蒽醌类物质，研究表明决明子蒽醌能减少肠道对胆固醇的吸收，增加排泄，能抑制血清胆固醇升高和主动脉粥样硬化斑点形成，能明显增加血清 HDL-C含量及提高HDL-C/TCM 比值，通过反馈调节 LDL代谢，降低血清胆固醇水平，延缓和抑制动脉粥样硬化斑块的形成，改善体内胆固醇的分布[20-21]。姜黄的主要化学成分为姜黄素类不饱和二酮类物质，研究表明姜黄素具有降低高脂血症大鼠血清TC及LDL-C的作用，对家兔的动脉粥样硬化形成也有抑制作用[22-23]。此外，姜黄还可以增强阿伐他汀的降血脂作用[24]。综上，降脂护肝胶囊具有明确的中医学理论指导与物质基础，本文旨在通过网络药理学探究降脂护肝胶囊的作用机制，以期推广其临床应用。
本研究运用网络药理学研究方法共筛选出降脂护肝胶囊中的活性成分39个，作用靶点118个，体现了中药多成分、多靶点联合作用的整体性和关联性的特点。根据“活性成分-靶点”网络结果，进一步得到排名前5的关键化合物为槲皮素、黄豆苷元、熊果酸、葛根素和异鼠李素。现代研究表明，槲皮素主要通过抗氧化应激与抑制炎症小体激活改善胰岛素抵抗，从而减少脂质堆积并调节脂质代谢[25-27]；黄豆苷元在通过抗氧化改善脂代谢紊乱的同时可以调节能量代谢，其机制可能与棕色脂肪组织中解偶联蛋白1的表达增加有关[28-30]；熊果酸与葛根素主要通过抑制炎症反应发挥减少脂肪堆积的作用，其作用机制主要与上调AMPK和PPARa的表达,及下调SREBP-lc和ACC的表达有关[31-33]；现代研究表明，50 mg/kg剂量口服异鼠李素可以抑制小鼠肝内三酰甘油的含量，同时肝损伤标记物也得到相应改善，但其作用机制有待探究[34]。综上，降脂护肝胶囊可能是通过槲皮素、黄豆苷元、熊果酸、葛根素和异鼠李素等活性成分发挥抗氧化应激与抑制炎症反应干预脂肪肝的。
根据PPI网络分析结果和“活性成分-靶点”网络结果，降脂护肝胶囊干预脂肪肝的主要作用靶点有周期蛋白D1（CCND1）、雌激素受体1（ESR1）、表皮生长因子受体（EGFR）等，其中，CCND1与炎症反应和能量代谢有关；ESR1与EGFR除了与炎症反应相关外，还与血管生成有关，脂肪肝患者多伴有胰岛素抵抗，其并发症如肥胖症、高血压、糖尿病等可能会诱发新生血管疾病，如视网膜病变。GO功能富集分析结果发现，降脂护肝胶囊活性成分主要涉及氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、激素抵抗等生物学过程；KEGG通路富集主要涉及PI3K-Akt信号通路、人巨细胞病毒感染、癌症中的微小RNA、乙型肝炎、EB病毒感染等信号通路，高相关度的通路主要包括炎症通路、病毒感染与癌症通路通路。PI3K-Akt可以调控各种不同细胞的功能，如代谢、生长、增殖、存活等；乙型肝炎通路主要与乙肝病毒感染的炎症反应相关。现代研究表明，脂肪肝与代谢以及炎症反应高度相关，在代谢紊乱的基础上，乙肝病毒感染使得炎症反应进一步加剧，可逐渐转变为不同类型的肝炎，若不及时干预可进一步发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌。
综上所述，降脂护肝胶囊可能是通过槲皮素、黄豆苷元、熊果酸、葛根素和异鼠李素等活性成分通过抑制炎症反应、抗氧化应激两条途径改善脂代谢，降低脂肪堆积，并防止脂肪肝进一步向肝癌方向转化，体现了一定的保肝作用。网络药理学分析是中医药基础研究的重要手段，但是基于中医药理论药材配伍的特点，还应当考虑中药活性成分的含量以及成分与成分之间的协同作用关系，这需要通过后续对海量数据处理算法的研发，此外，还需要通过实验验证网络药理学得出的结果以增强说服力。但无论如何，网络药理学的结果对临床应用与实验研究都具有一定的指导意义。
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表 1 白芍活性成分表
成分代码 成分名称 中文名称 OB% DL MOL001919 (3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-dihydroxy-4,4,8,10,
14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahydro-1H-cyclopenta
[a]phenanthrene-15,16-dione(3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-二羟基-4,4,8,10,
14-五甲基-2,3,5,6,7,9-六氢 -1H-环戊
[a]菲 -15,16-二酮43.56 0.53 MOL001924 paeoniflorin 芍药苷 53.87 0.79 MOL000211 Mairin 白桦脂酸 55.38 0.78 MOL000358 beta-sitosterol β-谷甾醇 36.91 0.75 MOL000359 sitosterol 谷甾醇 36.91 0.75 MOL000422 kaempferol 山萘酚 41.88 0.24 
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[1] 周怡驰. 柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 北京:北京中医药大学, 2021. [2] 张美军, 杨胜辉. 中医药治疗肝纤维化研究进展[J]. 湖南中医杂志, 2019, 35(10): 173-176. doi: 10.16808/j.cnki.issn1003-7705.2019.10.068 [3] 吴晓明, 何强, 尤圣杰, 等. 中药复方抗肝纤维化作用机制研究概述[J]. 北京中医药, 2021, 40(6): 675-680. doi: 10.16025/j.1674-1307.2021.06.031 [4] 罗茂权, 黄菊芳, 黎敏航, 等. 中药治疗肝纤维化的用药规律研究[J]. 广西医学, 2021, 43(1): 52-55, 136. [5] 王继萱, 艾宗雄, 谢晶日. 土鳖虫、姜黄、鳖甲、白芍治疗肝纤维化经验[J]. 北京环球中医药, 2021, 14(2): 306-308. [6] 穆晓红, 张双明. 白芍总甙对大鼠肝纤维化形成中肝窦内皮细胞的作用及血清TNF-α的表达研究[J]. 光明中医, 2009, 24(4): 745-746. doi: 10.3969/j.issn.1003-8914.2009.04.101 [7] 马丽, 李作孝. 白芍总苷的免疫调节功能及其临床应用[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(17): 244-246. doi: 10.3969/j.issn.1005-9903.2010.17.071 [8] 沈雨莎, 胡边, 潘小平. 芍药苷抗肝纤维化的分子机制研究进展[J]. 内蒙古中医药, 2019, 38(5): 162-163. doi: 10.16040/j.cnki.cn15-1101.2019.05.106 [9] 刘成海, 赵志敏, 吕靖. 中医对肝纤维化逆转的认识与治疗[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(4): 728-733. doi: 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.04.006 [10] 于玲, 王知斌, 王秋红, 等. 黄芪中黄酮类化合物药理作用研究进展[J]. 中医药信息, 2018, 35(2): 104-108. doi: 10.19656/j.cnki.1002-2406.180065 [11] XU T, HUANG S, HUANG Q, et al. Kaempferol attenuates liver fibrosis by inhibiting activin receptor-like kinase 5[J]. J Cell Mol Med, 2019, 23(9): 6403-6410. doi: 10.1111/jcmm.14528 [12] 韩超, 郑琳颖, 吕俊华, 等. 白芍总苷对非酒精性脂肪性肝病大鼠脂质浸润及纤维化的抑制作用[J]. 医药导报, 2014, 33(10): 1294-1299. doi: 10.3870/yydb.2014.10.010 [13] 李欣. 白桦脂酸基于调节STAT3信号通路改善[D]. 延吉: 延边大学, 2015. [14] KRIPA K G, CHAMUNDEESWARI D, THANKA J, et al. Modulation of inflammatory markers by the ethanolic extract of Leucas aspera in adjuvant arthritis[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 134(3): 1024-1027. doi: 10.1016/j.jep.2011.01.010 [15] 任建敏. 食物中植物甾醇生理活性及药理作用研究进展[J]. 食品工业科技, 2015, 36(22): 389-393, 399. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.072 [16] FENG Y, YING H Y, QU Y, et al. Novel matrine derivative MD-1 attenuates hepatic fibrosis by inhibiting EGFR activation of hepatic stellate cells[J]. Protein Cell, 2016, 7(9): 662-672. doi: 10.1007/s13238-016-0285-2 [17] 陈鑫栋, 仲威龙, 闫佩瑶, 等. 芹菜素通过PDK1/AKT信号通路抑制小鼠肝纤维化[J]. 中国药理学通报, 2022, 38(7): 1010-1016. [18] 沈皓. VEGFA在肝再生及非酒精性脂肪性肝病中的功能及机制研究[D]. 上海: 中国人民解放军海军军医大学, 2021. [19] 管文婕. 咖啡因经腺苷A2A受体介导的cAMP/PKA/Src/ERKI/2/p38MAPK信号转导通路抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化的作用研究[D]. 合肥: 安徽医科大学, 2012. [20] SCHEVING LA, ZHANG XQ, THREADGILL DW, et al. Hepatocyte ERBB3 and EGFR are required for maximal CCl4-induced liver fibrosis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2016, 311(5): G807-G816. doi: 10.1152/ajpgi.00423.2015 [21] 黄倩, 杨燕, 曾锐, 等. 基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶水解酶对肝纤维化的调控及相关治疗药物研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2022, 38(6): 1420-1425. doi: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.06.042 -
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