下载:
下载: 
-
由于原发疾病、代谢改变或术后免疫力低下等原因，肝胆外科肿瘤患者常因病原菌侵袭发生感染。利奈唑胺是市售的第一种人工合成的新型恶唑烷酮类抗菌药，被用于治疗革兰阳性球菌引起的感染，对多种革兰阳性菌均有活性，且与其他抗菌药无交叉耐药现象[1]，常用于肝胆外科肿瘤患者的抗感染治疗。血液毒性是利奈唑胺最常见的临床不良反应，包括血小板减少、贫血与白细胞减少等，其中又以血小板减少的发生率最高[2]。回顾性研究提示，利奈唑胺引起的血小板减少与患者不良预后相关，可能会导致患者器官衰竭，病死率增高[3]。笔者选取本院2017年1月至2021年12月间应用利奈唑胺的肿瘤患者为样本，旨在分析给予患者使用利奈唑胺进行抗感染治疗时血小板减少的发生情况，并探索其影响因素，为临床治疗安全性提供依据。
-
选取本院2017年1月至2021年12月给予利奈唑胺进行抗感染治疗的肿瘤患者。入选标准[4]：①年龄≥18岁；②实验室检查为革兰阳性菌感染或经其他抗菌药物治疗后仍有炎症或发热，需用革兰阳性菌药物治疗的情况；③利奈唑胺用药时间≥3 d。排除标准[4]：①给予利奈唑胺前血小板异常（血小板计数<100×109/L）；②同时应用影响血小板生成的药物；③入院接受放射性治疗与化疗；④利奈唑胺应用前后未监测相关实验室指标；⑤合并其他血液系统疾病；⑥术后输血；⑦对利奈唑胺过敏。
-
收集患者一般资料，包括患者年龄、性别、体重、身高、基础疾病情况（有无高血压、糖尿病或冠心病）、感染部位、用药时长、住院天数、是否进行外科手术、术前是否感染、有无联合应用其他抗菌药、用药前实验室检查结果（血小板计数、血红蛋白、白蛋白、炎症指标、肝肾功能指标）、用药过程中及用药后实验室检查结果（血小板计数）。
-
利奈唑胺相关性血小板减少定义为[5]：用药前血小板计数≥100×109/L，用药后血小板计数<100×109/L且低于基础值的75%。根据给予利奈唑胺后患者是否出现血小板减少，将患者分为血小板减少组和未发生组。
-
比较两组患者一般资料，符合正态分布的连续变量采用“均值±标准差”（
$\bar x $ ±s）表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布的连续变量采用四分位数 [M(Q1, Q3)]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。分类变量采用百分率（％）表示，组间比较采用χ2检验或 Fisher’s 确切概率法。利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素采用二元logistic回归分析，以向后LR法进入回归分析模型，确定其优势比（OR）与95%置信区间（95%CI）。所有统计分析采用SPSS 26.0进行，以P<0.05为差异有统计学意义。 -
本研究共纳入有效病例104例，其中男性68例，女性36例；年龄26~82岁，平均年龄（60.93±11.53）岁；平均身高体重指数（BMI）（22.25±3.10）；住院时长11~105 d，中位住院时间43 d；利奈唑胺单次给药剂量为0.6 g，给药频率为每12 h一次，静脉滴注102例，口服给药2例，用药时长4~26 d，中位用药时间10 d。腹腔感染患者（胆道感染、肝脓肿等）71例，其他感染患者（血液、肺部感染等）20例，合并两种以上感染患者（腹腔、血液、泌尿系统等）13例。当次入院接收外科手术的患者84例，未接受外科手术（如治疗感染、其他外科随访治疗等）的患者20例。
-
应用利奈唑胺后，发生血小板减少的患者25人，未发生的患者79人，血小板减少发生率为24.0%。比较两组患者一般资料，BMI、基础疾病、是否进行外科手术、术前是否感染、住院天数，有无联用其他抗菌药物、血红蛋白、白蛋白等指标差异无统计学意义（P>0.05），性别、年龄、利奈唑胺使用时长、基础血小板计数、白细胞计数、ALT、AST、总胆红素、肌酐、估算肾小球滤过率等指标差异有统计学意义（P<0.05），结果见表1。
表 1 两组患者一般资料比较
临床指标 血小板减少组
(n=25)未发生组
(n=79)统计量 P值 性别[n(%)] 5.039 0.030 男 21(84.0) 47(59.5) 女 4(16.0) 32(40.5) 年龄（岁, $\bar x $±s） 65.7±7.7 59.4±12.1 −2.439 0.016 BMI(kg·m−2, $\bar x $±s) 22.1±3.1 22.3±3.1 0.333 0.739 基础疾病[n(%)] 10(40.0) 31(39.2) 0.005 1.000 高血压 9(36.0) 26(32.9) 0.081 0.811 糖尿病 5(20.0) 14(17.7) 0.066 0.773 冠心病 3(12.0) 4(5.1) − 0.355 是否进行外科手术[n(%)] 0.562 0.334 是 19(76.0) 65(82.3) 否 6(24.0) 14(17.7) 术前是否有感染1[n(%)] 0.313 0.220 是 5(26.3) 10(15.4) 否 14(73.7) 55(84.6) 利奈唑胺使用时长[n, M(Q1, Q3)] 12(9, 18) 10(7, 13) −2.144 0.032 住院天数[n, M(Q1, Q3)] 45(27, 64) 42(31, 56) −0.377 0.706 联用抗菌药[n(%)] 21(84.0) 72(91.1) 1.023 0.454 血小板计数[×109/L, M(Q1,Q3)] 135(121, 208) 228(172, 304) −3.671 <0.001 血红蛋白[g/L, M(Q1,Q3)] 94(86.5, 106) 99(91, 107) −1.172 0.241 白细胞计数[×109/L, M(Q1,Q3)] 13.91(9.2, 18.5) 9.37(7.2, 12.1) −2.906 0.004 白蛋白(g/L, $\bar x $±s) 35.2±4.7 35.8±4.6 0.572 0.569 ALT [U/L, M(Q1, Q3)] 85(32, 206) 36(20, 68) −3.413 0.001 AST [U/L, M(Q1, Q3)] 69(36.5, 69) 33(21, 41) −4.029 <0.001 总胆红素[μmol/L, M(Q1, Q3)] 49.1(23.9, 112.3) 27.3(17.5, 57.7) −2.267 0.023 肌酐[μmol/L, M(Q1, Q3)] 69(56, 132) 57(45, 75) −2.834 0.005 肾小球滤过率[ml/min, $\bar x $±s] 93.1±39.3 118.8±46.4 2.500 0.014 注1：比较两组接受外科手术的患者术前感染情况，血小板减少组(n=19)，未发生组(n=65)。 -
以是否发生利奈唑胺相关性血小板减少为因变量（是=1；否=0）；依据纳入研究的104例样本均值或中位数，结合临床意义及DAI[2]等的研究，以性别（男=1；女=0）、年龄（≥60 岁=1；<60岁=0）、利奈唑胺使用时长（≥12 d=1；<12 d=0）、基础血小板计数（≤200×109/L=1；>200×109/L =0）、白细胞计数（≥11×109/L=1；<11×109/L=0）、ALT（≥50 U/L=1；<50 U/L =0）、AST（≥50 U/L=1；<50 U/L=0）、总胆红素（≥46 μmol/L=1；<46 μmol/L=1）、肌酐（≥90 μmol/L=1；<90 μmol/L=0）、估算肾小球滤过率（≤100 ml∙min−1∙L−1=1；<100 ml∙min−1∙L−1=0）为自变量进行多因素logistic回归分析。结果表明年龄≥60岁、利奈唑胺使用时长≥12 d、基础血小板计数≤200×109/L、基础AST≥50 U/L、基础白细胞计数≥11×109/L是利奈唑胺相关性血小板减少发生的危险因素（P<0.05），结果见表2。
表 2 利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素
变量 回归系数 标准误 统计量 OR P值 95%CI 年龄≥60岁 1.959 0.819 5.716 7.093 0.017 1.423~35.341 利奈唑胺使用时长≥12 d 1.481 0.703 4.437 4.399 0.035 1.108~17.455 血小板计数≤200×109/L 2.137 0.738 8.380 8.470 0.004 1.994~35.986 基础AST≥50 U/L 2.739 0.756 13.114 15.465 <0.001 3.513~68.085 基础白细胞计数≥11×109/L 2.437 0.755 10.420 11.436 0.001 2.605~50.217 -
利奈唑胺是临床上广泛应用的抗革兰阳性菌抗菌药，用于治疗革兰阳性菌引起的感染，包括由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的医院获得性肺炎（HAP）、社区获得性肺炎（CAP）、耐万古霉素肠球菌（VRE）感染及复杂性皮肤或皮肤软组织感染（SSTI）[1]。血液学毒性是利奈唑胺临床应用的主要关注点，不同研究报道了应用利奈唑胺治疗感染的患者血小板减少发生率在20%~50%之间[4, 6]，利奈唑胺相关性血小板减少会增加患者出血，甚至死亡风险[3]。本研究中，应用利奈唑胺治疗感染的肿瘤患者血小板减少发生率约24.0% ，处于现有报道的发生率区间，但高于利奈唑胺的Ⅲ期临床试验结果[7]，这可能是研究选择的人群不同、东西方人种差异、真实世界患者机体状况及治疗状况更为复杂等多种原因导致[8-9]。因此在实际临床应用过程中，临床医师应更加关注肿瘤患者利奈唑胺相关性血小板减少的发生。
利奈唑胺相关性血小板减少的发生机制尚无定论，目前已提出的机制包括抑制成熟巨核细胞释放血小板[10]、对血小板造成氧化损伤[11]、通过免疫介导过程破坏血小板生成与释放、破坏线粒体蛋白合成等[12-13]。
-
已有回顾性研究分析探讨重症患者、老年患者等人群给予利奈唑胺抗感染治疗发生血小板减少的影响因素，结果认为年龄、肾功能、基础血小板计数、利奈唑胺治疗时长等因素可能与血小板减少发生有关[3-5, 14, 15]，但还未有研究报道肿瘤患者应用利奈唑胺抗感染治疗的安全性问题。本研究选取给予利奈唑胺的肿瘤患者作为研究对象，研究结果提示，年龄≥60岁、利奈唑胺使用时长≥12 d、基础血小板计数≤200×109/L、基础AST≥50 U/L、基础白细胞计数≥11×109/L是肿瘤患者应用利奈唑胺相关性血小板减少发生的危险因素。
老年肿瘤患者因年龄、基础疾病等因素导致机体功能退化，药物的药动学特征常有所改变，利奈唑胺进入体内后，血药浓度会升高而消除速率降低，相同剂量下更容易引起药物蓄积，诱发不良反应。因此，结合既往研究和本研究结论，利奈唑胺治疗期间，年龄≥60岁的肿瘤患者更需要定期监测其血小板水平以预防血小板减少的发生[15]。
利奈唑胺治疗时长与血小板减少的发生率显著相关[6,16]。Choi等的研究[4]认为利奈唑胺治疗≥7 d的患者血小板减少的发生率明显增高，Sato等[17]的研究则认为接受利奈唑胺治疗超过14 d是血小板减少的危险因素，本研究结果提示接受利奈唑胺治疗超过12 d时患者更易出现血小板减少的情况。总之，随着利奈唑胺治疗时长的增加，临床医师应更加注意预防肿瘤患者血小板减少的发生。
研究结果表明，基础血小板计数≤200×109/L是利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素，这表明利奈唑胺的血液学毒性在基础血液学异常的患者中更为常见，这与Niwa等的研究结论相符合[18-19]：与能够耐受利奈唑胺治疗的患者相比，出现血小板减少的患者利奈唑胺的血药浓度显著升高，而血药浓度与不良反应的发生呈正相关。
以白细胞计数多少作为炎症指标，一定程度上反应机体的感染严重程度。本研究分析结果提示基础白细胞计数≥11×109/L是利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素，表明利奈唑胺治疗前机体的炎症指标较高可能会导致治疗过程中血小板减少，白细胞计数也是临床医师在抗感染治疗中需要重点关注的实验室指标之一。
此外，药物说明书中指出，轻中度肝功能不全患者无需调整利奈唑胺使用剂量，重度肝功能不全患者使用利奈唑胺数据不足。利奈唑胺非肾脏清除率占总清除率的65%[20]。LUQUE [21]等的研究发现，肝功能不全的患者给予常规剂量的利奈唑胺可能会导致血药浓度增加，使得患者不良反应发生的概率增加。本研究单因素分析中，两组患者肝功能指标ALT、AST、总胆红素等指标均有显著性差异，进一步进行logistic回归分析发现，基础AST高于50 U/L可能是引起利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素之一。
除了非肾脏清除，还有约30%利奈唑胺以原型的形式从尿液中排出，因此肾功能水平也能够影响利奈唑胺血药浓度，与药物不良反应密切相关[22]。本研究中，血小板减少组与未发生组的肌酐与肾小球滤过率有显著性差异，但logistic回归分析却排除了肾功能相关的危险因素，这与Esra[23]等得出的结论不一致，可能是由于本研究与上述研究纳入的人群差异、肿瘤患者的临床状况差以及研究对于血小板减少的定义不一致等原因导致的。
除上述因素外，本研究首次探讨了外科手术因素对肿瘤患者利奈唑胺相关性血小板减少发生的影响。出血是肝胆手术的主要关注点之一，尤其是对肝胆外科的肿瘤患者。Alkozai等[24]发现，术后血小板计数低是肝功能恢复延迟的独立预测指标，且与术后死亡风险增加有关。Wang等[25]的研究则表明，肝癌肝切除术后即刻血小板计数低是发生Ⅲ-Ⅴ级并发症、术后肝衰竭等的重要影响因素。而Nagasako等[26]的研究证实，肝部分切除术后的血小板会即刻减少，最低点发生在术后第2~3 d，5 d左右会恢复到术前水平。因此，肿瘤患者在应用利奈唑胺进行抗感染治疗过程中，接受外科手术是否会影响血小板计数也是需要探讨的问题。但本研究结果显示，两组患者是否接受外科手术、术前是否感染等无统计学差异(P>0.05)。表明患者在应用利奈唑胺时，是否进行外科手术治疗对血小板减少的发生并无影响。这可能是由于纳入研究的患者基础血小板计数高于100×109/L，且排除了有术后输血的人群导致研究结果有一定的局限性。
-
本研究对象为应用利奈唑胺进行抗感染治疗的肝胆外科肿瘤患者，但在临床治疗过程中，有部分患者未持续监测相关实验室指标，还有部分外科手术患者因基础状况较差或术中失血等原因有术后输血情况被排除，研究最终纳入了104例有效病例，样本量的限制可能使研究结果有所偏倚。此外，药代动力学研究证实血小板减少的发生与体内利奈唑胺药物浓度有直接相关性[27]，体内较高的利奈唑胺浓度可能与血小板减少呈正相关[28]，但本研究是回顾性研究，无法直接关注到治疗过程中血小板计数与利奈唑胺血药浓度之间的关联。因此，未来应采取扩大样本量，进行前瞻性血药浓度监测的方式，完善对利奈唑胺治疗过程中血小板减少发生情况的认识，为临床安全用药提供更充分的证据。
Risk factors of linezolid-related thrombocytopenia in patients in the department of hepatobiliary surgery
-
摘要:
目的 探讨肝胆外科肿瘤患者发生利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素，为患者临床安全用药提供依据。 方法 选取本院2017年1月至2021年12月间应用利奈唑胺进行抗感染治疗的肿瘤患者，根据给予利奈唑胺后是否出现血小板减少，将患者分为血小板减少组和未发生组。比较两组患者一般资料与实验室指标，采用多因素logistic回归分析筛选发生利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素。 结果 研究共纳入104例患者，其中接受外科手术患者84例，未接受外科手术患者20例。利奈唑胺相关性血小板减少发生率为24.0%。两组患者性别、年龄、利奈唑胺使用时长、血小板计数、白细胞计数、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素、肌酐、估算肾小球滤过率有显著性差异（P<0.05）；logistic回归分析结果提示，年龄≥60岁（OR=7.093；P=0.017）、利奈唑胺使用时长≥12 d（OR=4.399；P=0.035）、基础血小板计数≤200×109/L（OR=8.470；P=0.004）、基础AST≥50 U/L（OR=15.465；P<0.001）、基础白细胞计数≥11×109/L（OR=11.436；P=0.001）是肿瘤患者发生利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素。 结论 给肝胆外科肿瘤患者应用利奈唑胺时，医师需关注患者是否发生血小板减少的不良反应，尤其是年老、长疗程、基础血小板低、基础肝功能差及基础白细胞计数高的患者。 Abstract:Objective To provide the evidence for clinical medication safety by the investigation of the risk factors of linezolid-related thrombocytopenia in cancer patients in the department of hepatobiliary surgery. Methods Patients who received linezolid for anti-infective treatment from January 2017 to December 2021 were selected. The patients were divided into thrombocytopenia group and non-thrombocytopenia group according to whether thrombocytopenia occurred or not after administration of linezolid. The general data and laboratory indicators of the two groups were compared, and the risk factors of linezolid-related thrombocytopenia were screened by multivariate logistic regression analysis. Results A total of 104 patients were included in the study, including 84 patients who underwent surgery and 20 patients who did not. The incidence of linezolid-related thrombocytopenia was 24.0%. There were significant differences in gender, age, duration of linezolid use, platelet count, white blood cell count, alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), total bilirubin, creatinine, estimated glomerular filtration rate between the two groups (P<0.05); logistic regression analysis suggested that age ≥60 years (OR=7.093; P=0.017), duration of linezolid use ≥12 days (OR=4.399; P=0.035), baseline platelet count ≤200×109/L (OR=8.470; P=0.004), baseline AST≥50 U/L (OR=15.465; P<0.001), and baseline white blood cell count ≥11×109/L (OR=11.436; P=0.001) were the risk factors for linezolid-related thrombocytopenia in cancer patients. Conclusion During the treatment of linezolid in cancer patients, attention should be paid to the adverse reactions of thrombocytopenia in the patients, especially those with old age, long-term treatment, low baseline platelets, poor baseline liver function, and high baseline white blood cell counts. -
Key words:
- hepatobiliary surgery /
- cancer patients /
- linezolid /
- thrombocytopenia /
- risk factors
-
脑血管疾病是仅次于心脑血管疾病和癌症的第三大病症，其中脑缺血是常见的脑血管疾病之一。脑缺血的患病率和死亡率仍处于上升趋势，严重影响人们的健康。目前，西医对于脑缺血的主要治疗方式是溶栓和取栓，但有严格的溶栓时间窗和较大的取栓风险，并且缺血后造成神经功能的损伤没有有效的药物治疗[1]。中医药在脑缺血的预防和治疗中具有潜在作用，以气虚为本、血瘀为标作为主要病因[2]。查阅近几年文献发现，益气活血化瘀方药在防治脑缺血中表现出多方面和整体调节的优势。
参麻颈复方是临床名老中医经验方，临床应用发现具有活血通络，益气养血，宁神安脑，健筋壮骨之效。该方由首乌藤、丹参、山茱萸（制）、天麻、当归、川芎等组成，临床应用广泛。首乌藤有养血安神、祛风通络之效[3]，丹参有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神之效[4]，当归有补血调经、活血散寒、消肿止痛生肌、润肠通便之效[5]，川芎、陈皮的补气之效辅佐以上药物活血功效运行，而且川芎具有活血化瘀之效，是传统中医防治中风选择最多的配方之一[6]。本研究评估参麻颈复方对小鼠脑缺血损伤的改善作用，并进一步探讨其对骨髓来源内皮祖细胞干预发挥防治脑缺血损伤的机制，为中药方剂治疗脑缺血提供新的思路、寻找新的靶点。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器及试剂
细胞培养箱（Thermo公司）；倒置荧光显微镜（Leica 公司）；Odssey红外荧光显像（Li-Cor公司）；酶标仪（芬兰 Labsystens Dragon 公司）；涡旋混合器（江苏天翎仪器有限公司）；超净台（苏州净化设备有限公司）；电子天平JA2003（上海天平仪器厂）。 参麻颈复方颗粒（岳阳医院自制制剂，批准文号：沪药制字Z05050324）；尼莫地平片（天津市中央药业有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京西浓科技有限公司）；VEGF抗体（abcam公司）；BDNF抗体（abcam公司）；GAPDH内参抗体（abcam公司）；Tubulin内参抗体（abcam公司）；内皮细胞培养基（EGM-2 Single Quots，Lonza公司)；波连蛋白（vitronection，BD公司）。
1.2 实验动物及分组
实验动物为SPF级C57BL/6雄性小鼠30只（上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证：SCXK（沪）2017-0012），体重为18-20 g，6-7周龄。适应性饲养1周后，将30只小鼠随机分为模型对照组（Control组）、参麻颈组（SMJ组）、尼莫地平组（NMDP组），10只/组。实验过程中对于实验小鼠的所有处理均符合伦理学规定。
1.3 实验方法
1.3.1 制备动物模型
采用电凝法制备局灶性脑缺血模型[7]，用浓度为12%的水合氯醛对小鼠进行腹腔注射，剂量控制在350 mg/kg。小鼠麻醉后，仰卧位固定在手术台。借助显微镜，用显微镊沿颞肌纤维束的方向钝性分离肌肉，直到颧骨及麟骨暴露，显微镊夹住颧骨固定小鼠头部，用牙科钻重点打磨颧骨和麟骨的交叉部位，骨壳变薄并有裂缝时，停止打磨，用撬棒沿已暴露的动脉血管剥离骨片，直至小鼠左侧大脑中动脉与伴行的迷走神经分叉暴露；在显微镜下，找准纹状体外侧动脉近心端，用双极电凝器凝断左侧大脑中动脉后，将电凝器缓慢移出，显微镜下再次确认是否凝断。最后用显微镊将皮肤和肌肉归置原位，以便于缝合。小鼠完全苏醒后，观察精神状态，若出现站立不稳、左侧肢体偏瘫、提尾向一侧转圈等神经功能损害症状，即为造模成功。
参麻颈组在手术前通过灌胃方式给予6.88 g∙kg−1的参麻颈复颗粒；尼莫地平组给予2.16 mg/kg溶液灌胃；模型对照组给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，共14 d。
1.3.2 神经行为学功能评分
术后第3 d，由观察者在不知分组情况下记录神经行为学表现，并采用参考文献[7]评分方法，如提尾悬空试验等[8]，评估神经行为学功能评分。
提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠重复提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠测20次，并且每次测定的时间间隔不少于1 min，以保证小鼠得到充足的休息。小鼠的偏转率计算按以下公式：摆动频率（%）=（T−10）/10×100%。
T为实验小鼠头部向手术对侧偏转的次数。
平衡木试验：记录小鼠由木棍一端顺利通过平衡木80%长度所用的时间。在正式试验前对小鼠进行3次训练，正式试验时每只小鼠重复测定3次，对每只小鼠均间隔5 min后进行下一次实验。
1.3.3 脑组织TTC染色
行为学评分测完后，小鼠脱颈处死，取脑组织，放1×PBS中清洗干净，将脑组织放在脑片模具中，共切7片，每片2 mm，放2%的TTC溶液中，并在37 ℃水浴锅中染色10 min，染色结束后放4%多聚甲醛固定6 h，按照脑片大小顺序排好拍照，脑片使用Image J统计软件测定小鼠的脑梗死体积。
1.3.4 细胞功能测定
取脑组织的同时，提取小鼠骨髓来源内皮祖细胞，培养至第7d时，收集和处理细胞，对细胞黏附、迁移及形成小管能力进行测定。
细胞黏附实验：用胰酶消化细胞,按照3×105个/ml细胞接种于预先包被人纤维粘连蛋白的96孔板中，在细胞培养箱中培养5 h后弃掉未黏附细胞，再用4%多聚甲醛固定，以Hochest 33258染料染色后于倒置显微镜下拍照。
细胞迁移实验：调整细胞浓度3×105个/ml，Transwell小室置于24孔板，按分组下室加600 μl配好的下室溶液，细胞悬液接种于上室各100 μl,置培养箱内培养24 h，用PBS清洗2次，弃上清液，在2%多聚甲醛固定15 min。弃上清，PBS清洗2次，上室转移至含600 μl Hochest 33258染料的孔中，避光染色15 min。弃上清，PBS浸泡5 min,弃上清，光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组迁移细胞数。
小管形成实验：调整各组细胞至3×105个/ml，每孔100 μl的细胞悬液加到铺有基质胶的孔中，最后将96孔板移至培养箱孵育6 h，在光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组小管形成数量。
1.3.5 Western blot检测
细胞样本同“1.3.4”项中相同来源，六孔板放在冰枕上，用预冷PBS润洗细胞两次，弃上清液；向板内加入60 μl已配置好的细胞裂解液，在冰枕上裂解15 min，收集细胞液转移至1.5 ml EP管中，使用高速离心机在12 000 r/min，4 ℃离心15 min，将离心后的上清液收集到新的离心管中并放到−80 ℃冰箱保存。应用紫外分光光度计测量蛋白浓度后，进行蛋白定量，95 ℃ 5 min蛋白灭活后，−20 ℃保存待用。SDS-PAGE凝胶电泳：初始电压调为50 V，电泳至Marker中红色条带分离出，将电压调为 120 V，直至Marker显示跑到胶的底部时停止电泳。转膜：恒流200 mA转膜，不同目的蛋白按其分子量大小设置转膜时间。封闭：用5%脱脂牛奶封闭1 h。封闭之后用1%牛奶配置的一抗4 ℃孵育过夜。第2天，用1%牛奶配制的二抗室温孵育1 h，NC膜放到Odyssey扫膜仪上进行扫描，保存扫描照片，使用Quantity One软件统计蛋白的灰度值。
1.4 统计学处理
使用Graphpad prism 5.0分析数据。实验数据均以（
$ \bar x $ ±s）表示，两组之间的差异采用非配对T检验进行分析，多组数据间的差异采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05表示差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 各组小鼠神经功能学评分
小鼠造模成功后出现明显的神经功能障碍，表现为站立不稳、左前肢屈曲内收，肌张力下降。与对照组比较，尼莫地平组小鼠的神经功能有明显改（P<0.01）；与对照组比较，参麻颈组小鼠的爬杆时间（P<0.05）和对侧偏转率（P<0.01）均有显著降低，表明小鼠给予参麻颈复方后，能有效保护缺血后神经功能的缺损（图1）。
2.2 各组小鼠脑梗体积变化
用TTC染色后结果显示：对照组小鼠术后脑组织出现明显的梗死灶。与对照组比较，给参麻颈组小鼠脑缺血后脑梗体积显著减少（P<0.01）；给予尼莫地平的小鼠与参麻颈组相比，其脑梗体积虽有减少，但无统计学差异（图2）。 2.3 各组小鼠内皮祖细胞黏附功能比较
细胞黏附实验结果显示：对照组相比于另外两组，黏附细胞数目减少。预先给予参麻颈的小鼠，在发生脑缺血后，小鼠骨髓来源内皮祖细胞黏附于96孔板中细胞数目，明显高于对照组（P<0.01）；给予尼莫地平组，其细胞数目也比对照组增多（P<0.01）；而尼莫地平组和参麻颈组两组的差异无统计学意义（图3）。 2.4 各组小鼠内皮祖细胞迁移功能比较
迁移实验结果显示：与参麻颈组和尼莫地平组比较，模型对照组细胞迁移至Transwell板上室下面的数目可见减少。与对照组比较，给予参麻颈复颗粒后的脑缺血小鼠，其骨髓来源内皮祖细胞迁移数显著增加（P<0.05）；给予尼莫地平的小鼠与对照组比较，其迁移细胞数目增加（P<0.01）；参麻颈组和尼莫地平组，两组结果有差异但无统计意义（图4）。 2.5 各组小鼠内皮祖细胞形成小管能力比较
从图中可看出，对照组小鼠内皮祖细胞形成小管的数目减少。与对照组比较，参麻颈组内皮祖细胞形成小管数目有明显增加（P<0.05），尼莫地平组小管形成数目更为突出（P<0.01）；尼莫地平组形成的小管状态也优于参麻颈组（图5）。
2.6 各组小鼠内皮祖细胞中相关蛋白的表达水平
Western blot检测结果显示：与对照组比较，参麻颈组（P<0.01）和尼莫地平组（P<0.01）小鼠内皮祖细胞内BDNF蛋白表达增加，而参麻颈组和尼莫地平组之间结果差异无统计学意义（图6）。
3. 讨论
缺血性中风是一种以动脉粥样硬化为基础的中枢系统不可逆损伤；它是由阻塞颈内动脉、椎动脉或者脑血管的血栓形成引起的，这一过程减少了血液供应，导致细胞代谢紊乱和衰老，并进一步导致血管内皮损伤[9-10]。脑缺血后导致严重的脑损伤，并造成神经功能障碍，包括偏瘫、肢体痉挛和认知障碍等，从而降低患者的生活质量[11]。目前，西医临床治疗存在局限性，使得该疾病的残疾率仍然很高，以及带来的社会经济负担也在继续增加。中医药博大精深，很多研究者一直都在致力于寻找改善脑缺血所致神经功能障碍的中医疗法。
中医典籍《伤寒杂病论》早就将活血化瘀中药或中药复方用于缺血性疾病的治疗。活血化瘀中药复方通过多靶点、多途径的作用方式发挥整体性作用。现代研究方法——代谢组学、基因组学、蛋白质组学等为中药复方作用机制的阐述提供强有力的支持。前期相关研究显示，在传统中药中，发现许多成分可以促进血管的生成，如丹参酮，川芎嗪，三七总皂苷等[12-14]，这些是方剂中常用的中药，也是活血化瘀类草药的代表。而参麻颈复方中，大部分的中药具有活血化瘀作用，是否能够改善骨髓来源内皮祖细胞功能，又能否促进脑缺血损伤后的新血管的生成，需要进一步验证。
本研究中，参麻颈复方颗粒预处理后，小鼠脑缺血所致的神经行为学功能评分显著改善；TTC染色梗死体积也显著减少（P<0.01）。证明参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤具有保护作用，可改善神经功能和减小缺血梗死体积。
越来越多的临床前研究表明[15]，无论是缺血性脑卒中急性期还是慢性期，均会导致炎症和脑组织不可逆转的损伤。因此，为了减轻缺血组织的病理损伤，修复内皮功能障碍引起的血管损伤成为缺血性脑卒中治疗的主要方向。骨髓来源内皮祖细胞是内皮愈合和血管生成的关键效应因子。内皮祖细数量减少、内皮功能障碍与心血管事件风险增加息息相关[16]，这与内皮祖细胞介导的血管修复受损致使血管疾病进展是一致的[17]。为了响应缺血信号和血管损伤,骨髓来源的内皮祖细胞被动员到循环中并募集到内皮损伤部位，从而形成新生血管，这也是一种自然的防御机制[18]。
第二部分实验研究了参麻颈复方颗粒对脑缺血损伤小鼠内皮祖细胞的保护作用。结果显示，小鼠脑缺血损伤后，来自骨髓的内皮祖细胞黏附在96孔板和迁移至Transwell板下室的数目有显著减少，给予参麻颈复方颗粒预处理后，黏附细胞数目（P<0.01）和迁移细胞数目（P<0.05）均有明显增加。另外，脑缺血损伤可影响血管新生的速度和质量，表现为内皮祖细胞形成小管的能力，包括形成小管的数量和小管长度。本研究的结果中，参麻颈复方颗粒显著增加脑缺血损伤小鼠的内皮祖细胞形成小管的数量和长度（P<0.05）。
神经营养因子是一组对神经系统的发育、生长、存活和分化至关重要的蛋白质[19]。脑源性神经营养因子（BDNF）是神经系统中含量最丰富、分布最广的神经营养因子。血管内皮细胞合成并分泌BDNF，并通过刺激其原肌球蛋白受体激酶B促进神经系统中的细胞分化、细胞生长、突触形成和神经发生[20-21]。重要的是，BDNF在缺血性和创伤性脑损伤后表现出许多神经保护特性[22]。BDNF通过促进新生血管、调节内皮一氧化氮生成和抑制凋亡来改善内皮细胞功能障碍[23]。
第三部分实验深入探讨了参麻颈复方颗粒保护小鼠脑缺血损伤的作用，结果显示，小鼠脑缺血后，大脑受到损伤，内皮祖细胞中BDNF蛋白表达显著降低，内皮祖细胞功能受损；参麻颈复方颗粒干预后，BDNF蛋白表达水平显著增加（P<0.01），细胞功能得以改善。这与二甲双胍上调人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中BDNF的表达逆转高糖状态下的细胞损伤相同[23]。由于BDNF蛋白表达的增加，脑缺血小鼠的神经功能得到改善，脑梗死体积减小。
综上所述，参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤有保护作用，这一作用可能与促进内皮祖细胞中脑源性神经因子BDNF蛋白表达，改善内皮祖细胞功能有关。我们这一研究为参麻颈复方颗粒在心血管疾病的治疗提供了新视角，并进一步验证了在心脑血管疾病治疗领域的应用，这可能减缓疾病的进展和改善预后。
-
表 1 两组患者一般资料比较
临床指标 血小板减少组
(n=25)未发生组
(n=79)统计量 P值 性别[n(%)] 5.039 0.030 男 21(84.0) 47(59.5) 女 4(16.0) 32(40.5) 年龄（岁, $\bar x $ ±s）65.7±7.7 59.4±12.1 −2.439 0.016 BMI(kg·m−2, $\bar x $ ±s)22.1±3.1 22.3±3.1 0.333 0.739 基础疾病[n(%)] 10(40.0) 31(39.2) 0.005 1.000 高血压 9(36.0) 26(32.9) 0.081 0.811 糖尿病 5(20.0) 14(17.7) 0.066 0.773 冠心病 3(12.0) 4(5.1) − 0.355 是否进行外科手术[n(%)] 0.562 0.334 是 19(76.0) 65(82.3) 否 6(24.0) 14(17.7) 术前是否有感染1[n(%)] 0.313 0.220 是 5(26.3) 10(15.4) 否 14(73.7) 55(84.6) 利奈唑胺使用时长[n, M(Q1, Q3)] 12(9, 18) 10(7, 13) −2.144 0.032 住院天数[n, M(Q1, Q3)] 45(27, 64) 42(31, 56) −0.377 0.706 联用抗菌药[n(%)] 21(84.0) 72(91.1) 1.023 0.454 血小板计数[×109/L, M(Q1,Q3)] 135(121, 208) 228(172, 304) −3.671 <0.001 血红蛋白[g/L, M(Q1,Q3)] 94(86.5, 106) 99(91, 107) −1.172 0.241 白细胞计数[×109/L, M(Q1,Q3)] 13.91(9.2, 18.5) 9.37(7.2, 12.1) −2.906 0.004 白蛋白(g/L, $\bar x $ ±s)35.2±4.7 35.8±4.6 0.572 0.569 ALT [U/L, M(Q1, Q3)] 85(32, 206) 36(20, 68) −3.413 0.001 AST [U/L, M(Q1, Q3)] 69(36.5, 69) 33(21, 41) −4.029 <0.001 总胆红素[μmol/L, M(Q1, Q3)] 49.1(23.9, 112.3) 27.3(17.5, 57.7) −2.267 0.023 肌酐[μmol/L, M(Q1, Q3)] 69(56, 132) 57(45, 75) −2.834 0.005 肾小球滤过率[ml/min, $\bar x $ ±s]93.1±39.3 118.8±46.4 2.500 0.014 注1：比较两组接受外科手术的患者术前感染情况，血小板减少组(n=19)，未发生组(n=65)。 
下载: 导出CSV
表 2 利奈唑胺相关性血小板减少的危险因素
变量 回归系数 标准误 统计量 OR P值 95%CI 年龄≥60岁 1.959 0.819 5.716 7.093 0.017 1.423~35.341 利奈唑胺使用时长≥12 d 1.481 0.703 4.437 4.399 0.035 1.108~17.455 血小板计数≤200×109/L 2.137 0.738 8.380 8.470 0.004 1.994~35.986 基础AST≥50 U/L 2.739 0.756 13.114 15.465 <0.001 3.513~68.085 基础白细胞计数≥11×109/L 2.437 0.755 10.420 11.436 0.001 2.605~50.217
下载: 导出CSV
-
[1] RAO G G, KONICKI R, CATTANEO D, et al. Therapeutic drug monitoring can improve linezolid dosing regimens in current clinical practice: a review of linezolid pharmacokinetics and pharmacodynamics[J]. Ther Drug Monit, 2020, 42(1):83-92. doi: 10.1097/FTD.0000000000000710 [2] DAI Y, JIANG S Y, CHEN X O, et al. Analysis of the risk factors of linezolid-related haematological toxicity in Chinese patients[J]. J Clin Pharm Ther, 2021, 46(3):807-813. doi: 10.1111/jcpt.13359 [3] KIM H S, LEE E, CHO Y J, et al. Linezolid-induced thrombocytopenia increases mortality risk in intensive care unit patients, a 10 year retrospective study[J]. J Clin Pharm Ther, 2019, 44(1):84-90. doi: 10.1111/jcpt.12762 [4] CHOI G W, LEE J Y, CHANG M J, et al. Risk factors for linezolid-induced thrombocytopenia in patients without haemato-oncologic diseases[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2019, 124(2):228-234. doi: 10.1111/bcpt.13123 [5] HAN X N, WANG J P, ZAN X, et al. Risk factors for linezolid-induced thrombocytopenia in adult inpatients[J]. Int J Clin Pharm, 2022, 44(2):330-338. doi: 10.1007/s11096-021-01342-y [6] HANAI Y, MATSUO K, OGAWA M, et al. A retrospective study of the risk factors for linezolid-induced thrombocytopenia and anemia[J]. J Infect Chemother, 2016, 22(8):536-542. doi: 10.1016/j.jiac.2016.05.003 [7] RUBINSTEIN E, ISTURIZ R, STANDIFORD H C, et al. Worldwide assessment of linezolid’s clinical safety and tolerability: comparator-controlled phase III studies[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(6):1824-1831. doi: 10.1128/AAC.47.6.1824-1831.2003 [8] CATTANEO D, FUSI M, COZZI V, et al. Supra-therapeutic linezolid trough concentrations in elderly patients: a call for action?[J]. Clin Pharmacokinet, 2021, 60(5):603-609. doi: 10.1007/s40262-020-00964-1 [9] DONG H Y, XIE J, CHEN L H, et al. Therapeutic drug monitoring and receiver operating characteristic curve prediction may reduce the development of linezolid-associated thrombocytopenia in critically ill patients[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33(6):1029-1035. doi: 10.1007/s10096-013-2041-3 [10] TAJIMA M, KATO Y, MATSUMOTO J, et al. Linezolid-induced thrombocytopenia is caused by suppression of platelet production via phosphorylation of myosin light chain 2[J]. Biol Pharm Bull, 2016, 39(11):1846-1851. doi: 10.1248/bpb.b16-00427 [11] WANG T L, GUO D H, BAI Y, et al. Thrombocytopenia in patients receiving prolonged linezolid may be caused by oxidative stress[J]. Clin Drug Investig, 2016, 36(1):67-75. doi: 10.1007/s40261-015-0352-0 [12] PASCOALINHO D, VILAS M J, COELHO L, et al. Linezolid-related immune-mediated severe thrombocytopenia[J]. Int J Antimicrob Agents, 2011, 37(1):88-89. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2010.10.001 [13] Bernstein W B, Trotta R F, Rector J T, et al. Mechanisms for Linezolid-Induced Anemia and Thrombocytopenia[J]. Ann Pharmacother, 2003, 37(4):517-20. doi: 10.1345/aph.1C361 [14] CAZAVET J, BOUNES F V, RUIZ S, et al. Risk factor analysis for linezolid-associated thrombocytopenia in critically ill patients[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2020, 39(3):527-538. doi: 10.1007/s10096-019-03754-1 [15] QIN Y, CHEN Z, GAO S A, et al. Development and validation of a risk prediction model for linezolid-induced thrombocytopenia in elderly patients[J]. Eur J Hosp Pharm, 2022: ejhpharm-2022-003258. [16] ICHIE T, SUZUKI D, YASUI K, et al. The association between risk factors and time of onset for thrombocytopenia in Japanese patients receiving linezolid therapy: a retrospective analysis[J]. J Clin Pharm Ther, 2015, 40(3):279-284. doi: 10.1111/jcpt.12260 [17] YOSHITAKA S, MITSUTAKA I, YOSHIAKI K, et al. Number of concomitant drugs with thrombocytopenic adverse effects and the extent inflammatory response resolution are risk factors for thrombocytopenia in patients treated with linezolid for more than 14 days[J]. NAGOYA J Med SCIENCE, 2020, 82(3):407-414. [18] NIWA T, SUZUKI A, SAKAKIBARA S, et al. Retrospective cohort chart review study of factors associated with the development of thrombocytopenia in adult Japanese patients who received intravenous linezolid therapy[J]. Clin Ther, 2009, 31(10):2126-2133. doi: 10.1016/j.clinthera.2009.10.017 [19] CHEN C, GUO D H, CAO X T, et al. Risk factors for thrombocytopenia in adult Chinese patients receiving linezolid therapy[J]. Curr Ther Res, 2012, 73(6):195-206. doi: 10.1016/j.curtheres.2012.07.002 [20] QIN Y, LIU Y X, CHEN Z, et al. A risk factor-based predictive model for linezolid-induced anaemia: a 7-year retrospective study[J]. J Clin Pharm Ther, 2021, 46(6):1591-1599. doi: 10.1111/jcpt.13495 [21] LUQUE S, MUNOZ-BERMUDEZ R, ECHEVERRIA-ESNAL D, et al. Linezolid dosing in patients with liver cirrhosis: standard dosing risk toxicity[J]. Ther Drug Monit. 2019, 41(6): 732-739. [22] SHI C C, XIA J B, YE J, et al. Effect of renal function on the risk of thrombocytopaenia in patients receiving linezolid therapy: a systematic review and meta-analysis[J]. Br J Clin Pharmacol, 2022, 88(2):464-475. doi: 10.1111/bcp.14965 [23] KAYA KıLıÇ E, BULUT C, SÖNMEZER M Ç, et al. Risk factors for linezolid-associated thrombocytopenia and negative effect of carbapenem combination[J]. J Infect Dev Ctries, 2019, 13(10):886-891. doi: 10.3855/jidc.10859 [24] ALKOZAI E M, NIJSTEN M W, DE JONG K P, et al. Immediate postoperative low platelet count is associated with delayed liver function recovery after partial liver resection[J]. Ann Surg, 2010, 251(2):300-306. [25] WANG H Q. Low immediate postoperative platelet count is associated with hepatic insufficiency after hepatectomy[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(33):11871. [26] NAGASAKO Y, JIN M B, MIYAZAKI H, et al. Thrombopoietin in postoperative thrombocytopenia following living donor hepatectomy[J]. Liver Transplant, 2006, 12(3):435-439. doi: 10.1002/lt.20608 [27] CATTANEO D, ORLANDO G, COZZI V, et al. Linezolid plasma concentrations and occurrence of drug-related haematological toxicity in patients with Gram-positive infections[J]. Int J Antimicrob Agents, 2013, 41(6):586-589. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2013.02.020 [28] HIRAKI Y, TSUJI Y, HIRAIKE M, et al. Correlation between serum linezolid concentration and the development of thrombocytopenia[J]. Scand J Infect Dis, 2012, 44(1):60-64. doi: 10.3109/00365548.2011.608712 -
