-
肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一,尤其在我国特别高发,全球HCC患者超过半数在中国。2022年我国HCC发病率达36.77/10万人,位于恶性肿瘤第4位;总体病死率达31.65/10万人,居恶性肿瘤第2位[1]。HCC已然成为我国一项社会公共卫生问题,严重危害国民健康,给国民经济和社会发展带来沉重负担[2-4]。目前手术及肝移植可以临床治愈早期HCC,但多数患者诊断时已是晚期[5]。尽管免疫检查点抑制剂和小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂联合治疗法为晚期HCC患者带来了希望,但患者的中位生存期仅提高至19.2个月[6]。中医药治疗晚期HCC有其独特的优势,可以增强化疗、靶向、免疫治疗疗效,减轻毒副作用,改善症状,延长患者总生存期。因此运用中医药探索晚期HCC患者的治疗方案,对阻止该疾病的进一步发展,延长患者生存期具有重要的意义。
八宝丹起源于明代,至今有近400年的应用历史,是原国家食品药品监督管理总局允许使用天然麝香的特效药之一。八宝丹成分包含天然牛黄、天然麝香、蛇胆、羚羊角、珍珠、三七等。既往研究已证实,八宝丹可用于急慢性肝炎、胆囊炎等肝胆系统疾病,具有清热利湿、祛黄解毒的功效[7-8],并且八宝丹对HCC、胰腺癌、胆囊癌等消化系统肿瘤性疾病疾也有治疗效果[9-10]。本团队前期研究发现,八宝丹可以通过抑制慢性炎症介导的肝纤维化进而抑制HCC的发生,但八宝丹对于晚期HCC的治疗作用机制尚未明确[11]。因此探寻八宝丹对晚期HCC的作用机制可为中医药治疗HCC提供证据。
二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠模型是一个成熟的原发性HCC模型。DEN模型中HCC的发展过程与人类HCC相似,是一种非常合适研究HCC的生物工具[12]。本研究利用DEN大鼠观察八宝丹对HCC的影响,发现其能有效延缓HCC进展,但是作用机制尚不明确。由于八宝丹成分复杂多样,需要多组学分析技术探明八宝丹中有效药物成分与疾病的互作关系,因此本研究基于网络药理学和UPLC-MS方法,筛选八宝丹治疗HCC的有效化合物和潜在治疗靶点,构建“疾病-基因-药物”的多层次网络,揭示八宝丹调控疾病进展的潜在机制,为八宝丹的“老药新用”和HCC晚期患者的临床用药提供新思路。
-
八宝丹胶囊(批号Z10940006,厦门中药厂有限公司)、甲醇(A452-4,Fisher)、乙腈(A998-4,Fisher)、甲酸(A117-50,Fisher);DEN(245437, Sigma-Aldrich);高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC I-Class HF,Water)、色谱柱(ACQUITY UPLC HSS T3,100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Water)、PDA检测器(ACQUITY Premier PDA eλ,Water);高分辨液质联用质谱仪(Thermo-Obritrap-QE,Thermo)。
-
将32只SD大鼠(6~8周龄,180~200 g,雄性,SPF级)随机分为 4 组,每组8只,分别为:对照组、八宝丹组、DEN 诱导组(DEN组)、DEN+八宝丹组。DEN组和DEN+八宝丹组连续饲喂12周DEN溶液(95 μg/ml), 对照组和八宝丹组饲喂灭菌水。八宝丹组不进行DEN诱导,从第12周开始予以八宝丹给药。DEN 诱导组,DEN饮水喂养大鼠持续12周,诱导HCC的发生,然后使用生理盐水灌胃,1次/2 d ,持续4周。DEN+八宝丹组,DEN诱导HCC发生后,八宝丹按照0.5 g/kg的剂量对实验动物进行灌胃,1次/2 d,持续4周(图1A)。实验结束后处死部分大鼠获取肝脏组织标本,剩余部分停药后继续观察生存期。
-
将八宝丹取出,用液氮研磨均匀后,称取约98.3 mg样本于1.5 ml离心管中;加入983 μl 甲醇-水溶液(V/V=3∶1,含混合内标,4 μg/ml),涡旋震荡1 min,加入钢珠;放入−40 ℃冰箱中预冷2 min后,在研磨机中研磨(60 Hz,2 min);冰水浴超声提取60 min,−40 ℃下静置30 min;离心10 min(12 000 r/min,4 ℃),取全部上清液过0.22 μm的有机相滤膜;4 ℃下静置过夜,离心10 min(12 000 r/min,4 ℃),取上清液过0.22 μm的有机相滤膜置于内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析。本次实验的分析仪器为ACQUITY UPLC I-Class HF超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成的液质联用系统。色谱条件:色谱柱(ACQUITY UPLC HSS T3,100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱温:45 ℃;流动相:水(含0.1%甲酸)和乙腈,梯度洗脱信息详见表1;流速:0.35 ml/min;进样体积:5 μl;PDA扫描范围210~400 nm。质谱条件:离子源(HESI,样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式);数据采集模式为DDA;扫描方式为Full MS/dd-MS2(TOP 8);质谱参数详见表2。
表 1 八宝丹梯度洗脱信息
时间(t/min) 水(含0.1%甲酸)(%) 乙腈(%) 0 95 5 2 95 5 4 70 30 8 50 50 10 20 80 14 0 100 15 0 100 15.1 95 5 16 95 5 表 2 Thermo-Obritrap-QE质谱参数信息
参数 正离子 负离子 喷雾电压(U/V) 3 800 −3 000 毛细管温度(T/°C) 320 320 辅助气体加热器温度(T/ ℃) 350 350 鞘气流量(Arb) 35 35 辅助气体流速(Arb) 8 8 S透镜射频水平 50 50 质量范围(m/z) 100~1 200 100~1 200 全质谱分辨率 70 000 70 000 串联质谱分辨率 17 500 17 500 质谱仪二级碎裂能量 10,20,40 10,20,40 -
八宝丹 UPLC-MS数据由上海欧易生物医学科技有限公司提供,根据八宝丹化学成分在210 nm 和 254 nm波长下的紫外吸收图初步确定其结构类型。质谱数据经Progenesis QI v3.0 软件(Nonlinear Dynamics, Newcastle, 英国)处理(基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化)获得八宝丹的质谱峰表。
-
八宝丹的质谱峰表中化合的鉴定基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布,并结合TCM数据库(上海欧易生物医学科技有限公司,中国)进行鉴定。在本研究中,质谱峰表中对各鉴定物质进行评分,满分80分,其中,一级质谱精确分子量匹配,20分;二级质谱碎片匹配,20分;同位素分布匹配,20分;保留时间匹配,20分。将化合物相对峰面积的总含量定为100%,得到定性定量结果数据矩阵,并规定峰面积的比值大于1%,总分大于55,一级分子量误差在1.4×10−6以内的化合物作为八宝丹的有效成分进行后续分析。
-
根据前期筛选出的有效化学成分导入 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库查找与有效活性成分相对应的Smiles号,并将Smiles号导入 Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)和SuperPred(https://prediction.charite.de/subpages)数据库进行有效活性成分对应靶点的预测,保留结合可能性1%以上或文献报道过与化合物相关的作用靶点。根据各成分相关基因富集情况,利用R(version 3.6.1)构建各组分之间互作网络。
-
使用 GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库、OMIM(https://omim.org/)数据库和Therapeutic Target Database(https://db.idrblab.net/)筛选HCC对应靶点,以“Hepatocellular carcinoma”为关键词进行筛选。并根据文献比对,保留与HCC相关的靶点用于后续研究。
-
根据前期有效成分相关靶点筛选和HCC相关靶点的选择,取交集进行后续分析。将共同靶点的数据导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)构建蛋白互作网络,再利用Cytoscape3.9.0软件,以介数中心数为参考,筛选出关键调控蛋白。
-
将有效成分和HCC之间的共有靶点导入 DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库,设置物种为人,P<0.01,分别勾选 GO 分析中的生物过程、细胞组成 、分子功能以及Pathway 中的 KEGG 进行富集分析,提取结果后,应用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平台将富集分析结果可视化。
-
将有效成分和HCC之间的共有靶点依次导入GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/)中,以182例TCGA数据库中保留的临床HCC患者的RNA测序数据为基础,分析共有靶点与患者生存期的相关性。
-
大鼠被处死后,用磷酸盐缓冲盐水和 4% 多聚甲醛进行经心灌注。取肝脏组织进行病理评估。石蜡包埋后肝脏切成 5 µm 厚的切片。染色时将HCC组织石蜡切片,60 ℃烘烤固片30 min;脱蜡至水,并按照生产商的方案用苏木精-伊红染色,最后镜下观察各组织病理学情况。
-
使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行方差分析,每次实验的定量数据以平均值±标准差表示,组间差异采用t检验。Kaplan-Meier 分析用于进行生存期分析。采用对数秩检验比较各组存活时间。以P<0.05为差异有统计学意义。
Potential mechanism of Babao Dan in the treatment of hepatocellular carcinoma based on network pharmacology
-
摘要:
目的 基于网络药理学探讨八宝丹对原发性肝癌(HCC)影响的潜在机制。 方法 首先利用二乙基亚硝胺诱导的原发性HCC大模型,观察八宝丹对HCC的影响;然后利用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS)检测八宝丹中的有效成分,再在Swiss Target Prediction数据库等预测八宝丹有效成分的潜在作用靶点。运用GeneCards、OMIM和Therapeutic Target Database筛选HCC对应靶点,取交集后获得八宝丹与HCC的共同靶点。使用Cytoscape软件和STRING数据库绘制蛋白与蛋白间互作网络,筛选出八宝丹调控HCC的关键分子。利用DAVID数据库对有效作用靶点进行GO及KEGG富集分析。最后在TCGA数据库验证关键分子与HCC患者的临床相关性。 结果 八宝丹可延缓HCC大鼠肿瘤进展。UPLC-MS检测出八宝丹中化学成分851个,主要活性成分9个,作用靶点285个;筛选出HCC靶点637个,八宝丹调控HCC的靶点16个。GO富集分析显示802个生物过程、11个细胞组成、43个分子功能,KEGG通路共90条。TCGA相关性分析发现3个关键分子与HCC患者生存期相关。 结论 通过HCC大鼠模型发现,八宝丹可显著延长HCC大鼠的生存周期并减少肿瘤负荷,通过UPLC-MS及网络药理学方法初步预测八宝丹调控HCC的作用机制,表明八宝丹具有多成分、多通路、多靶点作用原发性HCC的特点,为进一步相关实验研究提供参考。 -
关键词:
- 原发性肝癌 /
- 八宝丹 /
- 网络药理学 /
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 作用机制
Abstract:Objective To explore the potential mechanism of Babao Dan on primary liver cancer based on network pharmacology. Methods First, the diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma rat(HCC)model was used to observe the effects of Babao Dan. Then, the effective components in Babao Dan were detected by UPLC-MS, and the potential target sites of these effective components were predicted in the Swiss Target Prediction databases, etc. The corresponding target sites for HCC were screened using GeneCards, OMIM and Therapeutic Target Database, and the common target sites between Babao Dan and HCC were obtained after getting the intersection. The protein-protein interaction network was drawn by Cytoscape software and the STRING database, and the key molecules regulating HCC by Babao Dan were screened out. The effective target sites were subjected to GO analysis in the DAVID database and enrichment analysis in the Pathway’s KEGG. Finally, the clinical relevance of key molecules to liver cancer patients was verified by the TCGA database. Results Babao Dan could slow down the tumor development. 851 chemical components were detected in BaBao Dan by UPLC-MS , 9 major active components and 285 target sites were identified. 637 hepatocellular carcinoma-related targets were screened out, and 16 targets of Babao Dan regulating HCC were identified. GO enrichment analysis showed 802 biological processes, 11 cell compositions, and 43 molecular functions, while KEGG pathway enrichment analysis identified a total of 90 pathways. Correlation analysis of TCGA identified three key molecules associated with the survival of liver cancer patients. Conclusion In the primary rat liver cancer model, Babao Dan was found to significantly prolong the survival of cancer-induced rats and reduce tumor burden. The initial prediction of the mechanism by which Babao Dan regulating liver cancer was made through UPLC-MS analysis and network pharmacology methods, indicating that Babao Dan has the characteristics of multi-component, multi-pathway, and multi-target regulation of primary liver cancer, which could provide a reference for further relevant experimental research. -
Key words:
- hepatocellular carcinoma /
- Babao Dan /
- network pharmacology /
- UPLC-MS /
- mechanism of action
-
表 1 八宝丹梯度洗脱信息
时间(t/min) 水(含0.1%甲酸)(%) 乙腈(%) 0 95 5 2 95 5 4 70 30 8 50 50 10 20 80 14 0 100 15 0 100 15.1 95 5 16 95 5 表 2 Thermo-Obritrap-QE质谱参数信息
参数 正离子 负离子 喷雾电压(U/V) 3 800 −3 000 毛细管温度(T/°C) 320 320 辅助气体加热器温度(T/ ℃) 350 350 鞘气流量(Arb) 35 35 辅助气体流速(Arb) 8 8 S透镜射频水平 50 50 质量范围(m/z) 100~1 200 100~1 200 全质谱分辨率 70 000 70 000 串联质谱分辨率 17 500 17 500 质谱仪二级碎裂能量 10,20,40 10,20,40 -
[1] ZHENG R S, CHEN R, HAN B F, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2024, 46(3):221-231. [2] RUMGAY H, ARNOLD M, FERLAY J, et al. Global burden of primary liver cancer in 2020 and predictions to 2040[J]. J Hepatol, 2022, 77(6):1598-1606. [3] TORRE L A, BRAY F, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA A Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108. doi: 10.3322/caac.21262 [4] SIEGEL R L, MILLER K D, WAGLE N S, et al. Cancer statistics, 2023[J]. CA A Cancer J Clin, 2023, 73(1):17-48. [5] BROWN Z J, TSILIMIGRAS D I, RUFF S M, et al. Management of hepatocellular carcinoma: a review[J]. JAMA Surg, 2023, 158(4):410-420. [6] GILLES H, GARBUTT T, LANDRUM J. Hepatocellular carcinoma[J]. Crit Care Nurs Clin N Am, 2022, 34(3):289-301. doi: 10.1016/j.cnc.2022.04.004 [7] 张虎平, 马艳品. 八宝丹胶囊联合替诺福韦治疗乙型病毒性肝炎的临床研究[J]. 临床医学工程, 2021, 28(9):1221-1222. doi: 10.3969/j.issn.1674-4659.2021.09.1221 [8] 任军帮, 沈有秀, 张永刚, 等. 八宝丹胶囊治疗急性胆囊炎患者的临床研究[J]. 中国临床药理学杂志, 2023, 39(12):1689-1693. [9] 胡玮晔, 高司成, 朱小涵, 等. 八宝丹治疗肝脏疾病的临床与基础研究[J]. 中西医结合肝病杂志, 2023, 33(3):281-283. doi: 10.3969/j.issn.1005-0264.2023.003.024 [10] 徐意, 李伟, 楼妙姿, 等. 八宝丹胶囊治疗原发性肝癌化疗栓塞术后综合征临床研究[J]. 新中医, 2020, 52(16):104-106. [11] LIANG L, YANG X, YU Y, et al. Babao Dan attenuates hepatic fibrosis by inhibiting hepatic stellate cells activation and proli-feration via TLR4 signaling pathway[J]. Oncotarget, 2016, 7(50):82554-82566. [12] SCHULIEN I, HASSELBLATT P. Diethylnitrosamine-induced liver tumorigenesis in mice[J]. Methods Cell Biol, 2021, 163:137-152. [13] HOU J J, ZHANG H Y, SUN B C, et al. The immunobiology of hepatocellular carcinoma in humans and mice: basic concepts and therapeutic implications[J]. J Hepatol, 2020, 72(1):167-182. doi: 10.1016/j.jhep.2019.08.014 [14] HU K R, LI C J, YU T J, et al. Global analysis of qualitative and quantitative metabolism of Notoginsenoside R1 in rat liver-brain-gut axis based on LC-IT-TOF/MS combing mMDF strategy[J]. Phytomedicine, 2022, 104:154261. doi: 10.1016/j.phymed.2022.154261 [15] SEEHAWER M, HEINZMANN F, D’ARTISTA L, et al. Necroptosis microenvironment directs lineage commitment in liver cancer[J]. Nature, 2018, 562(7725):69-75. [16] ZUCMAN-ROSSI J, VILLANUEVA A, NAULT J C, et al. Genetic landscape and biomarkers of hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2015, 149(5): 1226-1239. [17] LEONE V, ALI A, WEBER A, et al. Liver inflammation and hepatobiliary cancers[J]. Trends Cancer, 2021, 7(7):606-623. doi: 10.1016/j.trecan.2021.01.012 [18] TO J C, CHIU A P, TSCHIDA B R, et al. ZBTB20 regulates WNT/CTNNB1 signalling pathway by suppressing PPARG during hepatocellular carcinoma tumourigenesis[J]. JHEP Rep, 2021, 3(2):100223. [19] XIAO Y, LIU G D, SUN Y, et al. Targeting the estrogen receptor alpha(ERα)-mediated circ-SMG1.72/miR-141-3p/Gelsolin signaling to better suppress the HCC cell invasion[J]. Oncogene, 2020, 39:2493-2508. doi: 10.1038/s41388-019-1150-6 [20] Qu C, He L, Yao N, et al. Myofibroblast-specific Msi2 knockout inhibits HCC progression in a mouse model[J]. Hepatology, 2021, 74(1):458-473. doi: 10.1002/hep.31754