下载:
下载:
-
肝癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国特别高发，全球HCC患者超过半数在中国。2022年我国HCC发病率达36.77/10万人，位于恶性肿瘤第4位；总体病死率达31.65/10万人，居恶性肿瘤第2位[1]。HCC已然成为我国一项社会公共卫生问题，严重危害国民健康，给国民经济和社会发展带来沉重负担[2-4]。目前手术及肝移植可以临床治愈早期HCC，但多数患者诊断时已是晚期[5]。尽管免疫检查点抑制剂和小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂联合治疗法为晚期HCC患者带来了希望，但患者的中位生存期仅提高至19.2个月[6]。中医药治疗晚期HCC有其独特的优势，可以增强化疗、靶向、免疫治疗疗效，减轻毒副作用，改善症状，延长患者总生存期。因此运用中医药探索晚期HCC患者的治疗方案，对阻止该疾病的进一步发展，延长患者生存期具有重要的意义。
八宝丹起源于明代，至今有近400年的应用历史，是原国家食品药品监督管理总局允许使用天然麝香的特效药之一。八宝丹成分包含天然牛黄、天然麝香、蛇胆、羚羊角、珍珠、三七等。既往研究已证实，八宝丹可用于急慢性肝炎、胆囊炎等肝胆系统疾病，具有清热利湿、祛黄解毒的功效[7-8]，并且八宝丹对HCC、胰腺癌、胆囊癌等消化系统肿瘤性疾病疾也有治疗效果[9-10]。本团队前期研究发现，八宝丹可以通过抑制慢性炎症介导的肝纤维化进而抑制HCC的发生，但八宝丹对于晚期HCC的治疗作用机制尚未明确[11]。因此探寻八宝丹对晚期HCC的作用机制可为中医药治疗HCC提供证据。
二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠模型是一个成熟的原发性HCC模型。DEN模型中HCC的发展过程与人类HCC相似，是一种非常合适研究HCC的生物工具[12]。本研究利用DEN大鼠观察八宝丹对HCC的影响，发现其能有效延缓HCC进展，但是作用机制尚不明确。由于八宝丹成分复杂多样，需要多组学分析技术探明八宝丹中有效药物成分与疾病的互作关系，因此本研究基于网络药理学和UPLC-MS方法，筛选八宝丹治疗HCC的有效化合物和潜在治疗靶点，构建“疾病－基因－药物”的多层次网络，揭示八宝丹调控疾病进展的潜在机制，为八宝丹的“老药新用”和HCC晚期患者的临床用药提供新思路。
-
八宝丹胶囊（批号Z10940006，厦门中药厂有限公司）、甲醇（A452-4，Fisher）、乙腈（A998-4，Fisher）、甲酸（A117-50，Fisher）；DEN（245437, Sigma-Aldrich）；高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC I-Class HF，Water）、色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Water）、PDA检测器（ACQUITY Premier PDA eλ，Water）；高分辨液质联用质谱仪（Thermo-Obritrap-QE，Thermo）。
-
将32只SD大鼠（6~8周龄，180~200 g，雄性，SPF级）随机分为 4 组，每组8只，分别为：对照组、八宝丹组、DEN 诱导组（DEN组）、DEN+八宝丹组。DEN组和DEN+八宝丹组连续饲喂12周DEN溶液（95 μg/ml）, 对照组和八宝丹组饲喂灭菌水。八宝丹组不进行DEN诱导，从第12周开始予以八宝丹给药。DEN 诱导组，DEN饮水喂养大鼠持续12周，诱导HCC的发生，然后使用生理盐水灌胃，1次/2 d ，持续4周。DEN+八宝丹组，DEN诱导HCC发生后，八宝丹按照0.5 g/kg的剂量对实验动物进行灌胃，1次/2 d，持续4周（图1A）。实验结束后处死部分大鼠获取肝脏组织标本，剩余部分停药后继续观察生存期。
图 1 八宝丹对HCC大鼠的影响
-
将八宝丹取出，用液氮研磨均匀后，称取约98.3 mg样本于1.5 ml离心管中；加入983 μl 甲醇-水溶液（V/V=3∶1，含混合内标，4 μg/ml），涡旋震荡1 min，加入钢珠；放入−40 ℃冰箱中预冷2 min后，在研磨机中研磨（60 Hz，2 min）；冰水浴超声提取60 min，−40 ℃下静置30 min；离心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取全部上清液过0.22 μm的有机相滤膜；4 ℃下静置过夜，离心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取上清液过0.22 μm的有机相滤膜置于内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析。本次实验的分析仪器为ACQUITY UPLC I-Class HF超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成的液质联用系统。色谱条件：色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；柱温：45 ℃；流动相：水（含0.1%甲酸）和乙腈，梯度洗脱信息详见表1；流速：0.35 ml/min；进样体积：5 μl；PDA扫描范围210~400 nm。质谱条件：离子源（HESI，样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式）；数据采集模式为DDA；扫描方式为Full MS/dd-MS2（TOP 8）；质谱参数详见表2。
表 1 八宝丹梯度洗脱信息
时间（t/min） 水（含0.1%甲酸）（%） 乙腈（%） 0 95 5 2 95 5 4 70 30 8 50 50 10 20 80 14 0 100 15 0 100 15.1 95 5 16 95 5 表 2 Thermo-Obritrap-QE质谱参数信息
参数 正离子 负离子 喷雾电压（U/V） 3 800 −3 000 毛细管温度（T/°C） 320 320 辅助气体加热器温度（T/ ℃） 350 350 鞘气流量（Arb） 35 35 辅助气体流速（Arb） 8 8 S透镜射频水平 50 50 质量范围（m/z） 100~1 200 100~1 200 全质谱分辨率 70 000 70 000 串联质谱分辨率 17 500 17 500 质谱仪二级碎裂能量 10，20，40 10，20，40 -
八宝丹 UPLC-MS数据由上海欧易生物医学科技有限公司提供，根据八宝丹化学成分在210 nm 和 254 nm波长下的紫外吸收图初步确定其结构类型。质谱数据经Progenesis QI v3.0 软件（Nonlinear Dynamics, Newcastle, 英国）处理（基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化）获得八宝丹的质谱峰表。
-
八宝丹的质谱峰表中化合的鉴定基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布，并结合TCM数据库（上海欧易生物医学科技有限公司，中国）进行鉴定。在本研究中，质谱峰表中对各鉴定物质进行评分，满分80分，其中，一级质谱精确分子量匹配，20分；二级质谱碎片匹配，20分；同位素分布匹配，20分；保留时间匹配，20分。将化合物相对峰面积的总含量定为100%，得到定性定量结果数据矩阵，并规定峰面积的比值大于1%，总分大于55，一级分子量误差在1.4×10−6以内的化合物作为八宝丹的有效成分进行后续分析。
-
根据前期筛选出的有效化学成分导入 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库查找与有效活性成分相对应的Smiles号，并将Smiles号导入 Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）和SuperPred（https://prediction.charite.de/subpages）数据库进行有效活性成分对应靶点的预测，保留结合可能性1%以上或文献报道过与化合物相关的作用靶点。根据各成分相关基因富集情况，利用R（version 3.6.1）构建各组分之间互作网络。
-
使用 GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库、OMIM（https://omim.org/）数据库和Therapeutic Target Database（https://db.idrblab.net/）筛选HCC对应靶点，以“Hepatocellular carcinoma”为关键词进行筛选。并根据文献比对，保留与HCC相关的靶点用于后续研究。
-
根据前期有效成分相关靶点筛选和HCC相关靶点的选择，取交集进行后续分析。将共同靶点的数据导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/）构建蛋白互作网络，再利用Cytoscape3.9.0软件，以介数中心数为参考，筛选出关键调控蛋白。
-
将有效成分和HCC之间的共有靶点导入 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，设置物种为人，P<0.01，分别勾选 GO 分析中的生物过程、细胞组成 、分子功能以及Pathway 中的 KEGG 进行富集分析，提取结果后，应用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）平台将富集分析结果可视化。
-
将有效成分和HCC之间的共有靶点依次导入GEPIA2 （http://gepia2.cancer-pku.cn/）中，以182例TCGA数据库中保留的临床HCC患者的RNA测序数据为基础，分析共有靶点与患者生存期的相关性。
-
大鼠被处死后，用磷酸盐缓冲盐水和 4% 多聚甲醛进行经心灌注。取肝脏组织进行病理评估。石蜡包埋后肝脏切成 5 µm 厚的切片。染色时将HCC组织石蜡切片，60 ℃烘烤固片30 min；脱蜡至水，并按照生产商的方案用苏木精-伊红染色，最后镜下观察各组织病理学情况。
-
使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行方差分析，每次实验的定量数据以平均值±标准差表示，组间差异采用t检验。Kaplan-Meier 分析用于进行生存期分析。采用对数秩检验比较各组存活时间。以P<0.05为差异有统计学意义。
-
在实验观察期间，对照组和八宝丹组的大鼠均存活，而DEN组平均生存期为17.1周，DEN+八宝丹组平均生存期为23周，是DEN组的1.35倍（图1B）。同时观察肝脏大体发现，对照组和八宝丹组肝脏组织未见异常；DEN 组肝脏组织中均出现大量肉眼可见肿瘤结节；而DEN+八宝丹组肝脏组织中虽然出现了部分肉眼可见的肿瘤结节，但大体形态上相较于DEN组损伤较轻（图1C）。通过对肿瘤结节的最大直径和数量测量统计发现DEN+八宝丹组肿瘤负荷和最大肿瘤直径显著小于DEN组（图1D）。同时，对各肝脏组织进行病理学评估和H&E染色结果发现，八宝丹组和正常肝脏组织组织排列紧密，未出现肝脏损伤，而DEN组出现明显的组织空泡化，组织间排列弥散，肝脏损伤严重。尽管DEN+八宝丹组大鼠肝脏组织相较于八宝丹组和正常对照大鼠出现了明显的炎症浸润和肝纤维化，但是，相较于DEN组的肝脏组织损伤较轻且组织排列较为紧密（图1E）。H&E染色结果表明，八宝丹对大鼠肝脏未发现实质性病理损伤，并且缓解了同期DEN大鼠的肝脏病理状态。上述结果表明，八宝丹能延缓DEN大鼠的生存期并减少肿瘤负荷，但是具体机制尚不明了。
-
为进一步探索八宝丹对HCC的影响机制，本研究首先对八宝丹进行UPLC-MS中药化学成分检测。中药成分鉴定流程如图2A所示，将八宝丹颗粒进行溶解、研磨、过滤和提纯后上机检测。紫外吸收图谱发现，210 nm处皂苷类成分在该波长下有强吸收，254 nm处含有苯环、双键等结构的成分在该波长下有强吸收。然后通过基峰色谱图反应样品的整体信息，3次重复性检测结果可知该检测方法离子相应响度、保留时间重复性良好，由此说明本次实验仪器稳定、数据可靠。原始数据经Progenesis QI软件处理和TCM数据库进行定性后，共发现851个中药成分，保留9个主要活性成分供后续研究，分别是牛磺草胆酸盐、12-酮脱氧胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸、三七皂苷R1、环氧油酸和3α,7α-二羟基-12-羰基-5β-胆烷酸。将主要活性成分信息分别导入PubChem和Swiss Target Prediction数据库，共获得285个潜在作用靶点，并绘制出化合物之间的互作网络，发现八宝丹中主要化学成分之间关系密切，相互存在多个共有靶点（图2B）。在Therapeutic Target Database、GeneCards、OMIM数据库和文献中共筛选出与HCC相关的靶点637个，保留八宝丹与HCC共有相关性靶点16个（图2C）作为潜在调控分子。将潜在调控分子导入STRING数据库构建蛋白与蛋白间互作网络（图2D），再利用Cytoscape3.9.0软件，以介数中心数（网络中所有最短路径中经过该节点的路径的数目占最短路径数的比例）为参考，将潜在调控分子进行排序，介数中心数越大，圆形的直径越大，颜色越蓝，说明在该网络中的关联度就越高，反之圆形的直径越小，颜色越绿（图2E）。其中，潜在调控分子介数中心数排名前5的分别是：白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、过氧化酶增殖因子活化受体-γ（PPARG）和雌激素受体1（ESR1）。
图 2 八宝丹通过多化学成分和多靶点对原发HCC的影响
-
为探索八宝丹调控HCC的潜在作用机制，本研究基于DAVID数据库将上述16个共有相关靶点进行GO及KEGG富集分析。GO富集分析显示802个生物过程、11个细胞组成、43个分子功能，KEGG通路富集分析共90条通路，展示排名前10的富集条目。
图3A提示八宝丹在生物过程中通过沉默细胞中mRNA的转录，抑制上皮样细胞的增殖和转录因子的结合调控HCC；图3B提示八宝丹有效化学成分在细胞层面上通过结合各种细胞器或细胞膜受体发挥作用；图3C提示八宝丹有效化学成分能调控转录因子的结合、细胞因子的分泌及细胞核的状态。图3D提示八宝丹调控HCC是通过多通路、多靶点之间的相互作用。最后在TCGA数据库中查询了共有相关靶点与HCC患者的临床相关性，在182例临床样本的调查中发现，3个基因的高表达提示着患者的总生存期较短，分别为ESR1 （Logrank P=0.000 69）、PPARG（Logrank P=0.000 74）和COL18A1（Logrank P=0.006），详见图3E~G，P值由Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验确定。
图 3 富集分析发现八宝丹临床上可能是通过多途径影响HCC
-
HCC是一种典型的炎症相关癌症，近90%的HCC与病毒性肝炎、过度酒精摄入、非酒精性脂肪肝或酒精性脂肪肝引起的长期炎症相关。在HCC慢性炎症微环境中，先天免疫细胞和成纤维细胞被募集并激活至损伤部位分泌细胞因子和生长因子，有利于肿瘤细胞的增殖或抵消凋亡[6]。研究表明，NF-κB和JAK-STAT两条经典通路是促进HCC的关键炎症信号通路，抑制炎症通路的激活能有效抑制住HCC进一步进展[13]。八宝丹作为传统中药复方，临床上已发现对HCC、胰腺癌、胆囊癌等消化系统肿瘤性疾病疾也有着积极的治疗效果，但是具体机制尚不明了。本团队前期研究发现，八宝丹可以通过抑制炎症细胞因子分泌和减少肝前体细胞上TRL4的表达，从抑制肝前体细胞的肿瘤转化，进而抑制肿瘤发生[11]。因此本研究团队假设八宝丹减缓了原发性HCC的肿瘤进展。
在本研究中，通过观察八宝丹对DEN诱癌大鼠的影响，发现八宝丹可以延长DEN大鼠的生存期，并且缓解DEN导致的肝脏肿瘤负荷。但是，目前尚未有具体的机制阐明这一现象。为探索是八宝丹中何种中药成分发挥了作用，利用UPLC-MS技术检测出化学成分851个，鉴定出主要活性成分9个，其中大部分是人体胆汁酸中主要成分，也发现具有强抗炎作用的三七皂苷R1[14]，主要活性成分之间关系密切。共筛选出285个潜在作用靶点。在与HCC相关靶点取交集后，筛选出八宝丹调控HCC的16个潜在靶点。利用上述靶点构建了八宝丹“化学成分-潜在靶点”网络模型以及PPI网络，将潜在作用靶点进行排序，发现了HCC小鼠模型已验证能加速HCC的发展并影响肿瘤的侵袭性免疫信号IL-6和TNF[15]；HCC中的显性突变驱动因子TP53和RB1[16]；与HCC炎症相关的信号分子STAT3；与肿瘤细胞增殖相关的分子MTOR和AFP[17]。
GO富集分析结果提示，八宝丹调控HCC在生物过程上参与miRNA对基因的沉默负调控、转录后miRNA对基因的沉默负调控、RNA对基因的沉默负调控等；在细胞组分上富集到RNA聚合酶Ⅱ转录调节因子复合物、吞噬作用相关受体、细胞膜受体等词条；在分子功能上富集到与转录起始因子结合，激活核受体，与配体结合激活转录因子活性等。KEGG信号通路提示，八宝丹参与了癌症中的蛋白聚糖、乙型肝炎、HIF-1信号通路、化学致癌受体激活、EGFR络氨酸激酶抑制剂耐药等通路。TCGA数据库中发现，ESR1、PPARG和COL18A1高表达与HCC患者总生存期密切相关。据报道，PPARG高表达可激活WNT/CTNNB1信号通路，从而维持肿瘤细胞干性特征，促进癌症进展[18]。人类HCC临床样本调查和组织染色也证实，ESR1可通调控miR-141-3p /GSN信号影响原发性HCC进展[19]；肌成纤维细胞分泌的胶原α-1（ⅩⅤⅢ）链（COL18A1）可促进肿瘤转移，加速HCC进展[20]。因此TCGA结果提示，八宝丹可能是通过调控ESR1、PPARG和COL18A1来延长原发性HCC患者的生存期。
综上所述，本研究证实了八宝丹对治疗原发性HCC的积极影响，并且发现9种八宝丹的有效活性成分。还利用网络药理学的研究方法，分析揭示八宝丹可能是通过多靶点、多通路来调控原发HCC，并结合已有的研究进行分析验证，提出新的视角与思路，为后续的实验研究提供参考。
Potential mechanism of Babao Dan in the treatment of hepatocellular carcinoma based on network pharmacology
-
摘要:
目的 基于网络药理学探讨八宝丹对原发性肝癌（HCC）影响的潜在机制。 方法 首先利用二乙基亚硝胺诱导的原发性HCC大模型，观察八宝丹对HCC的影响；然后利用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS）检测八宝丹中的有效成分，再在Swiss Target Prediction数据库等预测八宝丹有效成分的潜在作用靶点。运用GeneCards、OMIM和Therapeutic Target Database筛选HCC对应靶点，取交集后获得八宝丹与HCC的共同靶点。使用Cytoscape软件和STRING数据库绘制蛋白与蛋白间互作网络，筛选出八宝丹调控HCC的关键分子。利用DAVID数据库对有效作用靶点进行GO及KEGG富集分析。最后在TCGA数据库验证关键分子与HCC患者的临床相关性。 结果 八宝丹可延缓HCC大鼠肿瘤进展。UPLC-MS检测出八宝丹中化学成分851个，主要活性成分9个，作用靶点285个；筛选出HCC靶点637个，八宝丹调控HCC的靶点16个。GO富集分析显示802个生物过程、11个细胞组成、43个分子功能，KEGG通路共90条。TCGA相关性分析发现3个关键分子与HCC患者生存期相关。 结论 通过HCC大鼠模型发现，八宝丹可显著延长HCC大鼠的生存周期并减少肿瘤负荷，通过UPLC-MS及网络药理学方法初步预测八宝丹调控HCC的作用机制，表明八宝丹具有多成分、多通路、多靶点作用原发性HCC的特点，为进一步相关实验研究提供参考。 -
关键词:
- 原发性肝癌 /
- 八宝丹 /
- 网络药理学 /
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 作用机制
Abstract:Objective To explore the potential mechanism of Babao Dan on primary liver cancer based on network pharmacology. Methods First, the diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma rat（HCC）model was used to observe the effects of Babao Dan. Then, the effective components in Babao Dan were detected by UPLC-MS, and the potential target sites of these effective components were predicted in the Swiss Target Prediction databases, etc. The corresponding target sites for HCC were screened using GeneCards, OMIM and Therapeutic Target Database, and the common target sites between Babao Dan and HCC were obtained after getting the intersection. The protein-protein interaction network was drawn by Cytoscape software and the STRING database, and the key molecules regulating HCC by Babao Dan were screened out. The effective target sites were subjected to GO analysis in the DAVID database and enrichment analysis in the Pathway’s KEGG. Finally, the clinical relevance of key molecules to liver cancer patients was verified by the TCGA database. Results Babao Dan could slow down the tumor development. 851 chemical components were detected in BaBao Dan by UPLC-MS , 9 major active components and 285 target sites were identified. 637 hepatocellular carcinoma-related targets were screened out, and 16 targets of Babao Dan regulating HCC were identified. GO enrichment analysis showed 802 biological processes, 11 cell compositions, and 43 molecular functions, while KEGG pathway enrichment analysis identified a total of 90 pathways. Correlation analysis of TCGA identified three key molecules associated with the survival of liver cancer patients. Conclusion In the primary rat liver cancer model, Babao Dan was found to significantly prolong the survival of cancer-induced rats and reduce tumor burden. The initial prediction of the mechanism by which Babao Dan regulating liver cancer was made through UPLC-MS analysis and network pharmacology methods, indicating that Babao Dan has the characteristics of multi-component, multi-pathway, and multi-target regulation of primary liver cancer, which could provide a reference for further relevant experimental research. -
Key words:
- hepatocellular carcinoma /
- Babao Dan /
- network pharmacology /
- UPLC-MS /
- mechanism of action
-
河豚毒素（TTX）是一种强效生物毒素，是目前已知毒性最强的生物毒素之一，主要存在于河豚鱼和部分海洋生物中。据报道，河豚毒素能与电压门控钠离子通道1∶1结合，阻断钠离子内流，从而发挥抑制兴奋的作用[1]。基于其对钠离子通道不同亚型的阻断，河豚毒素在一定剂量范围可以起到镇痛、局麻等多种药用效果[2-6]。其中镇痛效用为当前主要研究领域，相较于临床常用的阿片类药物，河豚毒素发挥镇痛作用无成瘾性，副作用小，肝肾功能损害小，但其治疗剂量极低，且治疗窗口狭窄，低剂量往往带来频繁的给药次数，要想良好的发挥镇痛作用，就需要选取合适的剂型来更好的发挥其作用。微球作为长缓释制剂的优良载体，经常包载治疗窗狭窄、半衰期较短的药物以发挥长周期药效的作用，为测定微球中TTX含量等数据，需要一套适用的检测方法。
目前针对河豚毒素定量检测的方法多为生物样本检测，应用于动物体内河豚毒素检测和人河豚毒素中毒血液检测，针对河豚毒素的体外测定方法较少，药用制剂的检测方法更是稀少。本方法的建立适用于河豚毒素药用制剂中的含量检测，为河豚毒素药用开发的含量测定提供了新选择。主流的河豚毒素含量测定方法包括小鼠生物法[7-8]、免疫测定法[9-11]、高效液相色谱法（HPLC）[12-13]、液相色谱-质谱联用法[14-16]、气相色谱-质谱联用法[17]等。高效液相色谱法因其适用性广、稳定性好及灵敏度良好而备受欢迎。但由于河豚毒素不溶于任何有机溶剂，仅溶于弱酸水溶液，常见的方法难以较好地保留河豚毒素。本研究使用庚烷磺酸钠作为离子对试剂，通过河豚毒素与离子对试剂结合形成复合分子，提高其在色谱柱上的保留能力，从而更好地分离河豚毒素与其他物质 [18-19]。
根据河豚毒素的作用功效和缓释长效镇痛目标，本研究制备了河豚毒素缓释微球。为考察微球中河豚毒素的含量，需要建立相应的含量测定方法。因此，本研究采用HPLC方法建立针对河豚毒素缓释微球的含量分析方法，以期为河豚毒素微球中的含量测定提供依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；电子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；数显pH计（sartorius，德国），紫外可见分光光度计[安捷伦科技（中国）有限公司]；循环水式真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；SECURA125-1CN型十万分之一电子天平（赛多利斯，德国）；Arium@ mini超纯水机（赛多利斯，德国）。
1.2 药品与试剂
河豚毒素标准品（98%，中洋生物科技股份有限公司）；PBS缓冲液（武汉普诺赛生物科技有限公司）；聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA, RG 503H，sigma-Aldrich Company）；甲酸（色谱纯，国药集团）；三氟乙酸（色谱纯，sigma-Aldrich Company）；氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；泊洛沙姆-188（sigma-Aldrich Company）；叠氮钠（Sigma-Aldrich Company）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙腈（色谱纯，sigma-Aldrich Company）；二氯甲烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；河豚毒素-PLGA微球、空白PLGA微球（海军军医大学药剂学教研室提供）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：8 mmol/L庚烷磺酸钠（0.005%TFA，1 mol/L NaOH调节pH4.0）水溶液∶乙腈=95∶5；检测波长：200 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；分析时间：12 min；进样量：20 μl。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取叠氮钠、泊洛沙姆-188适量，加入磷酸盐缓冲液配制成含0.02%NaN3、0.02%F-68的释放介质，取10 mg河豚毒素标准品，用6 ml 0.1%甲酸溶液溶解，以PBS介质（0.02%NaN3、0.02%F-68）定容得100 μg/ml的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密称取20.00 mg河豚毒素冻干微球，加入1 ml二氯甲烷（DCM）超声使完全溶解，加入经甲酸调节pH至4.0的释放介质，超声后充分振摇，取上层水相溶液过0.22 μm水系滤膜作为供试品溶液。
2.3 色谱系统适应性考察
配制以下样品，考察方法专属性：① 1ml PBS释放介质加入50 μl 1%甲酸，为空白释放介质；② 甲酸调节pH的PBS介质稀释得的10 μg/ml TTX标准品溶液；③ 精密称取10 mg空白微球于5 ml EP管，加入1 ml二氯甲烷超声2 min使完全溶解，加入1 ml PBS介质及50 μl 1%甲酸，充分振摇后超声10 min，取上层水相过0.22 μm水系膜，为空白微球样品；④ 精密称取10 mg 空白微球于5 ml EP管，准确加入10 μg/ml TTX标准液1ml，加入1 ml二氯甲烷超声2 min使完全溶解，甲酸调节pH的PBS溶液提取，过膜处理后为河豚毒素微球样品。按照“2.1”项下方法进样检测，图谱如图1。实验结果表明，该方法专属性良好，河豚毒素得到了较好的分离。
2.4 标准曲线的绘制
精密量取对照品溶液于10 ml量瓶，加入PBS介质，分别稀释得20、15、12、10、5、2、1 μg/ml的系列浓度标准液。按照“2.1”项下方法进样检测，记录TTX峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，河豚毒素的浓度（Xr μg/ml）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=22 216X+591.8，r=0.999 9，证明本方法在1~20 μg/ml浓度范围内线性良好。
2.5 精密度试验
由对照品溶液配制低、中、高三个浓度的河豚毒素标准液，分别为2、10、20 μg/ml，进行日内精密度及日间精密度测定。日内精密度测定方法为样品测定5次，计算日内相对偏差；日间精密度测定法为3个浓度样品连续测定5 d，计算日间相对偏差。3个浓度由低到高的日内精密度RSD值分别为0.81%、0.43%、0.58%，日间精密度RSD值分别为1.32%、1.10%、0.68%，均小于2.0%，符合精密度要求。
2.6 重复性试验
按照“2.2.2”项下方法，平行制备5份河豚毒素供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示，RSD值为1.49%，表明该方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验
选取低、中、高3个浓度标准溶液，分别为2、10、20 μg/ml，称取10 mg空白微球于5 ml EP管，加入1 ml 二氯甲烷超声溶解和1 ml 标准溶液及50 μl 1%甲酸，充分振摇后超声10 min，超声后取上层水相过膜进样检测，计算回收率，结果见表1。
表 1 河豚毒素加样回收率试验结果（n=3）加入量（μg/ml） 测得量（μg/ml） 回收率（%） RSD（%） 2 1.96 1.98 1.99 98.88±0.82 0.83 10 10.04 9.96 10.00 100.00±0.43 0.43 20 20.04 20.18 20.08 100.49±0.37 0.37 试验结果表明，低、中、高3个浓度的回收率均在98.0%~102.0%之间，3组不同浓度的RSD均小于2%，符合方法学要求。
2.8 微球中药物含量测定
为了考察该方法能否测定微球中还未释放的河豚毒素含量，本实验进行微球中药物含量测定。精密称取河豚毒素-PLGA微球20 mg，加入0.5 ml DCM超声溶解，再加入1%甲酸调节pH至4的PBS溶液2.5 ml，充分振摇后超声10 min，取上清液过膜后进样检测。测定河豚毒素浓度为2.52 μg/ml，换算后计算微球包封率（EE）及载药量（DL），计算方法如下：
$$ \begin{split} &\text{包封率}({\%})=\frac{\text{微球内药物量}}{\text{投入总药物量}}\times 100\\&{\text{载药量}}({\%})=\frac{\text{微球中包含药物量}}{\text{微球总重量}}\times 100 \end{split}$$ 换算可得微球包封率为60.77%，载药量为0.024%。因此，通过此方法可以计算微球的载药量和包封率，为下一步微球释放情况考察时通过测定微球中未释放含量从而间接测定微球的释放量提供依据。
2.9 TTX在释放介质（pH=7.4）中的稳定性
由于河豚毒素溶液受温度影响较大，温度越高，河豚毒素降解越快，在微球长期释放过程中，已释放的河豚毒素发生降解会影响体外释放的测定，故对河豚毒素标准品溶液进行4、25、37 ℃条件下释放介质中的稳定性考察，样品pH均为7.4。4 ℃和25 ℃样品分别在第1、3、5、7、 14、 21、28天取样检测；37 ℃样品在第1周每天取样，其后隔天取样。取12 μg/ml TTX标准品溶液分别置于4、25、37 ℃，100 r/min条件下考察，用于测定TTX在体外释放条件下稳定性，结果见图2。
结果表明，河豚毒素在水溶液中稳定性受温度影响比较大。28 d考察中，河豚毒素在4 ℃放置降解约1.53%，25 ℃放置降解约32.67%，37 ℃放置降解约74.96%。所以，在河豚毒素微球释放测定时不能直接测定释放介质中的河豚毒素含量，而应测定微球中还未释放的河豚毒素含量，从而间接测定微球的释放。
3. 讨论
目前针对河豚毒素定量检测的方法多为生物样本检测，应用于动物体内河豚毒素检测和人河豚毒素中毒血液检测，针对河豚毒素的体外测定方法较少，药用制剂的检测方法更是稀少。本方法的建立适用于河豚毒素药用制剂中的含量检测，为河豚毒素药用开发的含量测定提供了借鉴。
针对河豚毒素微球的含量测定，我们尝试了许多方法，发现常规的反相色谱法对这类物质分离度不高，而反相离子对色谱法分离效果好。为了取得更佳的分离效果，分别考察了Agilent Zorbax SB-C8柱（4.6mm×150mm, 5μm）、shim-pack GIST C18-AQ（4.6mm×250mm, 5μm）、Agilent Zorbax SB C18柱（4.6mm×150mm, 5μm）等不同色谱柱对河豚毒素的分离效能及峰型的影响。结果显示，当色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱时，河豚毒素的分离效果及峰形最佳。
在离子对色谱法中，河豚毒素的分离及峰型等受到多种因素影响，在该方法建立过程中，我们考察了流动相pH、流动相比例等条件对河豚毒素分离效果的影响。流动相pH：我们考察了流动相中pH3.0、4.0、4.5和5.0，不同pH对其峰型有一定的影响，对比筛选后，我们确定了pH4.0时为最佳峰型。流动相比例：流动相比例对TTX出峰时间存在较大的影响，我们考察了90∶10、92∶8、94∶6、95∶5、98∶2等比例，保留时间在4~25 min不等，在保证出峰完整的情况下，调整进样时间至适宜，最终确定比例为95∶5。
微球中的河豚毒素提取我们尝试了不同的有机溶剂破乳，其中包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈等有机溶剂，最终选用速度最快、溶解最完全的二氯甲烷溶剂破乳提取。
结果证明选用本方法测定缓释微球中的河豚毒素在一定浓度范围内线性良好，专属性强，精密度和回收率均符合方法学要求，可以作为TTX微球含量、释放量的测定方法。
-
图 1 八宝丹对HCC大鼠的影响
A. 动物模型的构建与八宝丹干预策略机制图；B. Kaplan-Meier总生存曲线；C. 各组间代表性肝脏大体观，黄色箭头指示肿瘤结节；D. 定量分析DEN组和DEN+八宝丹组大鼠肝组织肿瘤结节数和最大肿瘤结节直径（mean±SD，n=3，**P<0.01，与DEN组比较）；E. H&E染色各组间代表性肝脏组织切片
图 2 八宝丹通过多化学成分和多靶点对原发HCC的影响
A. 八宝丹检测流程示意图及基峰色谱图（红、蓝、绿色表示三针技术重复）；B. 八宝丹中有效中药成分相互作用玹图；C. 韦恩图显示八宝丹与HCC共有相关性靶点；D. 基于STRING数据库绘制的蛋白与蛋白间互作网络；E. 基于介数中心数为参考绘制的蛋白与蛋白间互作网络
图 3 富集分析发现八宝丹临床上可能是通过多途径影响HCC
A. 生物过程富集分析柱状图；B. 细胞组分富集分析柱状图；C. 分子功能富集分析气泡图；D. KEGG富集分析花瓣图；E. ESR1与HCC患者总生存期的关系图；F. PPARG与HCC患者总生存期的关系图；G. COL18A1与HCC患者总生存期的关系图
表 1 八宝丹梯度洗脱信息
时间（t/min） 水（含0.1%甲酸）（%） 乙腈（%） 0 95 5 2 95 5 4 70 30 8 50 50 10 20 80 14 0 100 15 0 100 15.1 95 5 16 95 5 
下载: 导出CSV
表 2 Thermo-Obritrap-QE质谱参数信息
参数 正离子 负离子 喷雾电压（U/V） 3 800 −3 000 毛细管温度（T/°C） 320 320 辅助气体加热器温度（T/ ℃） 350 350 鞘气流量（Arb） 35 35 辅助气体流速（Arb） 8 8 S透镜射频水平 50 50 质量范围（m/z） 100~1 200 100~1 200 全质谱分辨率 70 000 70 000 串联质谱分辨率 17 500 17 500 质谱仪二级碎裂能量 10，20，40 10，20，40
下载: 导出CSV
-
[1] ZHENG R S, CHEN R, HAN B F, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2024, 46(3):221-231. [2] RUMGAY H, ARNOLD M, FERLAY J, et al. Global burden of primary liver cancer in 2020 and predictions to 2040[J]. J Hepatol, 2022, 77(6):1598-1606. [3] TORRE L A, BRAY F, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA A Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108. doi: 10.3322/caac.21262 [4] SIEGEL R L, MILLER K D, WAGLE N S, et al. Cancer statistics, 2023[J]. CA A Cancer J Clin, 2023, 73(1):17-48. [5] BROWN Z J, TSILIMIGRAS D I, RUFF S M, et al. Management of hepatocellular carcinoma: a review[J]. JAMA Surg, 2023, 158(4):410-420. [6] GILLES H, GARBUTT T, LANDRUM J. Hepatocellular carcinoma[J]. Crit Care Nurs Clin N Am, 2022, 34(3):289-301. doi: 10.1016/j.cnc.2022.04.004 [7] 张虎平, 马艳品. 八宝丹胶囊联合替诺福韦治疗乙型病毒性肝炎的临床研究[J]. 临床医学工程, 2021, 28(9):1221-1222. doi: 10.3969/j.issn.1674-4659.2021.09.1221 [8] 任军帮, 沈有秀, 张永刚, 等. 八宝丹胶囊治疗急性胆囊炎患者的临床研究[J]. 中国临床药理学杂志, 2023, 39(12):1689-1693. [9] 胡玮晔, 高司成, 朱小涵, 等. 八宝丹治疗肝脏疾病的临床与基础研究[J]. 中西医结合肝病杂志, 2023, 33(3):281-283. doi: 10.3969/j.issn.1005-0264.2023.003.024 [10] 徐意, 李伟, 楼妙姿, 等. 八宝丹胶囊治疗原发性肝癌化疗栓塞术后综合征临床研究[J]. 新中医, 2020, 52(16):104-106. [11] LIANG L, YANG X, YU Y, et al. Babao Dan attenuates hepatic fibrosis by inhibiting hepatic stellate cells activation and proli-feration via TLR4 signaling pathway[J]. Oncotarget, 2016, 7(50):82554-82566. [12] SCHULIEN I, HASSELBLATT P. Diethylnitrosamine-induced liver tumorigenesis in mice[J]. Methods Cell Biol, 2021, 163:137-152. [13] HOU J J, ZHANG H Y, SUN B C, et al. The immunobiology of hepatocellular carcinoma in humans and mice: basic concepts and therapeutic implications[J]. J Hepatol, 2020, 72(1):167-182. doi: 10.1016/j.jhep.2019.08.014 [14] HU K R, LI C J, YU T J, et al. Global analysis of qualitative and quantitative metabolism of Notoginsenoside R1 in rat liver-brain-gut axis based on LC-IT-TOF/MS combing mMDF strategy[J]. Phytomedicine, 2022, 104:154261. doi: 10.1016/j.phymed.2022.154261 [15] SEEHAWER M, HEINZMANN F, D’ARTISTA L, et al. Necroptosis microenvironment directs lineage commitment in liver cancer[J]. Nature, 2018, 562(7725):69-75. [16] ZUCMAN-ROSSI J, VILLANUEVA A, NAULT J C, et al. Genetic landscape and biomarkers of hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2015, 149(5): 1226-1239. [17] LEONE V, ALI A, WEBER A, et al. Liver inflammation and hepatobiliary cancers[J]. Trends Cancer, 2021, 7(7):606-623. doi: 10.1016/j.trecan.2021.01.012 [18] TO J C, CHIU A P, TSCHIDA B R, et al. ZBTB20 regulates WNT/CTNNB1 signalling pathway by suppressing PPARG during hepatocellular carcinoma tumourigenesis[J]. JHEP Rep, 2021, 3(2):100223. [19] XIAO Y, LIU G D, SUN Y, et al. Targeting the estrogen receptor alpha(ERα)-mediated circ-SMG1.72/miR-141-3p/Gelsolin signaling to better suppress the HCC cell invasion[J]. Oncogene, 2020, 39:2493-2508. doi: 10.1038/s41388-019-1150-6 [20] Qu C, He L, Yao N, et al. Myofibroblast-specific Msi2 knockout inhibits HCC progression in a mouse model[J]. Hepatology, 2021, 74(1):458-473. doi: 10.1002/hep.31754 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 2944
- HTML全文浏览量: 1616
- PDF下载量: 25
- 被引次数: 0
