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脓毒症（sepsis）是由于宿主对细菌、真菌、病毒等感染的反应失调而引起的多器官功能障碍，具有很高的致死率，是感染致死的首要原因[1]。近年来，虽然人类在重症监护领域已经取得了长足的进步，但是严重脓毒症的总死亡率仍高达26.7%[2]。针对脓毒症的治疗，目前绝大多数仍是采用支持性疗法，临床可用的干预措施只有非常有限的几种，如液体复苏、应用抗生素和类固醇药物等。然而，这些措施往往收效甚微。因此，研发抗脓毒症新药, 改善患者预后，降低脓毒症死亡率，是目前亟待解决的问题。本文对近年来脓毒症治疗相关的研究进行综述，以期为今后抗脓毒症的研究提供思路。
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在过去的40多年里，医药工作者针对脓毒症的抗生素治疗开展了深入的研究。在确诊脓毒症或脓毒症休克后，尽快给予患者有效的抗生素已获得医疗工作者广泛的认可。2021年，拯救脓毒症运动（SSC）指南建议，对于可能发生脓毒症休克或高度可能发生脓毒症的成年人，应在确诊后1 h内立即使用抗生素。与此同时，人们也越来越关注抗生素的滥用问题，指南建议对于感染可能性低且无休克的成年人，应推迟使用抗生素，以免加快病原体耐药的进程[3]。然而不幸的是，近年来多重耐药菌感染所引发脓毒症的比例一直未能得到遏制，新型抗生素的研发速度又远远滞后于细菌耐药的产生速度，抗生素作为脓毒症治疗的一线药物，已经陷入了困境。
研发针对脓毒症病理生理进程的治疗药物，是解决目前脓毒症危害的必由之路，人们早先已经进行了多项尝试，例如针对细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1的药物Etarnercept、Aflimomab、Anakinra等；针对毒力因子LPS、革兰氏阴性菌内毒素、TLR4的药物HA-1A、ES、Eritoran等；针对凝血障碍的药物活化蛋白C、抗凝血酶Ⅲ、肝素等；以及针对免疫细胞的刺激因子G-CSF和GM-CSF等。这些研究虽然在临床前研究中取得了一定效果，但在进入临床试验后大多以失败告终[4]。尽管困难重重，目前仍有许多研究在不懈推进，并取得进展。
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近10年来，人们对脓毒症病程中的免疫学变化进行了广泛而深入的研究，揭示了免疫抑制在脓毒症发病机制中的作用。各种研究表明，在脓毒症的最初炎症阶段存活下来的患者很容易受到机会性微生物的院内感染而导致晚期死亡。据统计，超过70%的患者死亡发生在脓毒症发病的3 d之后，而其中的大部分又发生在脓毒症发病的后几周[5]。免疫功能障碍或免疫抑制在脓毒症后延迟死亡的病理中起着关键作用[6]。因此，旨在刺激免疫系统的免疫治疗策略在逆转脓毒症诱导的免疫抑制和改善患者预后方面具有巨大的潜力。
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IL-7被认为是人类T细胞发育必不可少的多功能细胞因子，它可以影响T细胞的增殖和分化，在脓毒症期间具有显著改善T细胞稳态的潜力[7]。IL-7与脓毒症治疗相关的主要作用机制包括诱导T细胞增殖，增加T细胞谱系的多样性，上调抗凋亡蛋白Bcl-2，减少淋巴细胞凋亡，增加黏附分子的表达，使其更好地运输和募集，以及帮助中性粒细胞向感染部位募集等[8-9]。
2018年公布的首个通过IL-7逆转脓毒症诱导的获得性免疫缺陷的随机临床试验IRIS-7（n=27），其结果表明，T细胞生长因子CYT107 的耐受性良好，没有引起细胞因子风暴、炎症恶化或器官功能障碍的迹象，并且逆转了CD4+和CD8+ T细胞的显著丧失，使淋巴细胞计数和循环中的CD4+和CD8+ T细胞增加了3~4倍，促进了T细胞的增殖和活化[10]。2023年，该课题组公布了后续的一项为期90 d的随机临床试验NCT03821038（n=40），结果表明，与安慰剂相比，静脉注射CYT107仍可逆转脓毒症导致的淋巴细胞减少，使淋巴细胞计数和循环中的CD4+和CD8+ T细胞增加2~3倍，但有可能给患者带来短暂的呼吸窘迫，因此，通过肌肉注射CYT107是更加优选的治疗方案[11]。目前，CYT107在临床试验中已经取得了一定的成效，但仍需要更大规模的临床试验来证实这一结果。
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当脓毒症发生时，T细胞耗竭的标志物——程序性细胞死亡蛋白（PD-1）及其相应的配体（PD-L1）的表达上调是免疫抑制的特征之一。在动物脓毒症模型和脓毒症患者中，PD-1/PD-L1的这种上调与死亡率的增加相关。临床前脓毒症模型和对脓毒症患者血液样本的分析表明，通过使用抗PD-1/PD-L1抗体阻断这一途径进行免疫调节，可以恢复免疫细胞功能，提高存活率。因此，针对PD-1/PD-L1的抗体治疗作为脓毒症免疫治疗的新方法正受到广泛关注[12-13]。
2019年，两项针对脓毒症患者使用免疫检查点抑制剂的1b期临床研究BMS-936559（n=24）[14]和NCT02960854（n=31）[15]都显示出了这一疗法具有良好的耐受性和安全性，并能使患者28 d以上的免疫状态在一定程度上恢复。但同样，需要进一步的临床试验来验证其安全性和有效性。
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天然免疫细胞介导的全身炎症反应失调是脓毒症发病的关键机制之一。在脓毒症发病早期，各种病原相关分子模式（PAMP）如细菌肽聚糖、内毒素等，与免疫细胞表面的特异性受体结合触发了各级促炎症介质的顺序释放。这些促炎症介质的单独或协同作用，导致了脓毒症的发生发展。并且随着病程的进展，包括巨噬细胞、中性粒细胞在内的免疫细胞在靶器官的大量堆积，加剧了炎症介质在靶器官的积累，从而造成了多器官功能的损害[16]。因此，针对炎症相关通路的研究，一直是研究的热点问题。虽然先前一系列靶向诸如TNF-α、IL-6、LPS、TLR4的药物最终都以失败告终，但目前仍有许多富有潜力的靶点值得我们探索。
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黏附斑激酶（FAK）是一类胞质非受体蛋白酪氨酸激酶，属于蛋白酪氨酸激酶超家族，与细胞骨架的动态变化有关，富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）是FAK家族的一种非受体酪氨酸激酶。近年来，FAK和Pyk2已被确定为新的介导炎症反应的关键参与者，参与动脉粥样硬化、哮喘的发病以及肿瘤的转移等[17-19]。
与此同时，近期一项有关FAK-Pyk2通路相关的研究表明，通过药物抑制FAK-Pyk2通路可以提高临床相关的脓毒症造模小鼠的生存率，并对造模所致的器官功能障碍产生保护作用。这种有益的作用可能是由于通过调节FAK-Pyk2下游的炎性级联反应，如p38-MAPK和NLRP3，阻止了白细胞的过度浸润和相关的局部过度炎症的产生[20]。
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Rho属于低分子量GTP酶的Ras超家族，目前研究最多的Rho 成员主要有Rho（A、B、C）、 Rac（1、 2、 3）和Cdc42 三类；Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK）又称为Rho激酶，是Rho下游的靶效应分子，在全身组织中都有分布。Rho/ROCK通路介导了许多病理生理信号，主要包括细胞的迁移、吞噬、收缩、黏附和细胞骨架的重组等。目前，一项针对Rho/RCOK通路与脓毒症关系的研究表明，ROCK抑制剂可减轻LPS吸入模型所诱导的小鼠肺损伤；ROCK抑制剂的预给药抑制了LPS诱导的IL-1β、IL-6生成和MPO活性的增加，阻断NF-κB信号通路，并且可以减轻LPS所诱导的凝血障碍[21]。
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脓毒症患者的治疗反应和临床结果在不同的研究中差异很大，最近人们认为这可能取决于潜在的脓毒症表型，这些表型以不同的器官功能障碍模式为特征，如凝血级联调节的失调[22]。虽然约50%～70%的脓毒症患者存在凝血功能异常，但只有35%的患者出现明显的弥散性血管内凝血（DIC）[23]，以此为特征的表型被称作脓毒症相关凝血障碍（SAC），SAC的典型变化包括国际标准化比值（INR）升高和血小板计数降低，而SAC严重程度的增加，往往与较高的脓毒症死亡率挂钩[24]。目前，人们针对凝血级联反应的靶向治疗已经取得了一定进展，其中，重组人可溶性血栓调节蛋白（rhsTM）便是其代表之一。
rhsTM具有抗凝和抗炎作用，并且能够抑制损伤相关分子模式（如HMGB-1和组蛋白）引起的炎症和器官损伤[25]。近几年有研究表明，具有SAC表型的脓毒症患者可能可以通过使用rhsTM获益。
2019年，一项为了确定在标准治疗的基础上加用rhsTM（ART-123）对SAC患者的不良反应和疗效的Ⅲ期随机临床研究SCARLET（n=816）被公布。其结果表明，在800名完成了研究并被纳入完整分析的患者中，ART-123治疗组和安慰剂组的28 d全因死亡率在统计学上没有显著差异[分别为395名患者中的106名（26.8%）和405名患者中的119名（29.4%），P=0.32][26]。在随后的针对这项试验后分析发现，尽管ART-123治疗组28 d全因死亡率的下降并不显著，但是与安慰剂组相比，接受ART-123治疗的患者的每个生物标记物与基线相比都有显著变化（P<0.05）[25]。
2020年，一项纳入了
1633 名患者的荟萃分析则显示，在脓毒症患者中，SAC与较高的28 d死亡率相关。应用rhsTM可降低SAC患者28 d死亡率，但不能降低非SAC患者的死亡率[27]。综上所述，针对具有SAC表型的脓毒症患者，使用rhsTM治疗是具有一定价值的，但仍需要进一步的临床试验来确证。
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在脓毒症的病理生理过程中，血管内皮细胞功能的改变是其中的重要一环，它关系着多种细胞因子的激活、炎性递质的释放以及凝血系统的激活，并且在脓毒症休克和多器官功能损伤中扮演着重要作用。目前，针对血管内皮稳态的靶向药物研究也已经取得了一定进展。
肾上腺髓质素（ADM）是一种主要由血管内皮细胞表达和分泌的自由循环肽，在血管内显示出血管保护活性，它可以关闭内皮细胞之间的间隙，随后防止血管内液体和其他化合物不受控制地漏入间质-血管外空间（即血管渗漏）；但在间质组织中，ADM却具有血管舒张特性，当浓度较高时会引起低血压，这在脓毒症患者中常常会导致病情进展和恶化。Adrecizumab（ADZ）是一种针对肾上腺髓质素N末端的靶向治疗药物，通过靶向生物活性肾上腺髓质素（bio-ADM）来恢复和维持血管完整性，并能够增强ADM对内皮屏障的保护作用。脓毒症休克的临床前模型显示，使用ADZ调节ADM的信号通路，可以改善内皮稳态、器官功能，并提高宿主存活率，因此，该治疗策略可能通过提供减轻器官功能障碍的机会来改善脓毒症患者的预后[28-29]。
2021年，一项旨在调查ADZ安全性，耐受性以及临床疗效和药动学的Ⅱa期临床研究AdrenOSS-2（n=301）公布了结果显示使用ADZ治疗脓毒症的耐受性较好，并且ADZ治疗组相较于安慰剂组可以更快地降低患者的SOFA评分（P=0.007）[29]。目前针对肾上腺髓质素治疗的研究显示出了较好的研究前景，进一步的Ⅱb/Ⅲ期临床研究可能将很快开始。
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脓毒症从本质上来说，不能将其定义为某一个具体的疾病，而是由感染引起的多器官功能不全的综合征，因此具有相当大的异质性。其异质性可以体现为宿主的基础状态不尽相同；脓毒症感染的病原菌和感染的部位不同；累及器官的种类数量，以及严重程度的不同等。可能正是由于这些异质性，才导致过去针对单一靶点的药物在进入临床试验后以失败告终。
针对脓毒症的这一特点，近年来人们基于基因组学指标、生物标志物和临床指标、临床大数据等将脓毒症进行了分型，力求对不同患者进行更精细化的治疗。例如2019年，Seymour等[22]通过临床大数据和机器学习方法，将脓毒症分为了α、β、γ、δ 4个表型，其中α表型的临床特点为使用升压药物的剂量最小；β表型以高龄患者为主，具有多种合并症及肾功能不全；γ表型患者炎症反应明显，且以呼吸功能不全居多；δ表型则更易发生肝功能不全及休克。由此可见，对于不同表型的脓毒症患者，其对应的治疗方式以及用药的侧重点也必然不同。因此对于未来的脓毒症药物研发，研究人员如果能够更加着眼于患者的异质性特征，针对不同表型的患者研发不同的药物，也许能够取得更加令人满意的结果。
Progress on the treatment of sepsis
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摘要: 脓毒症是危及人类生命的急危重症，目前脓毒症的临床治疗仍以提供支持治疗为主，但是针对脓毒症的新药研发在不断推进，针对脓毒症的免疫功能、炎症通路、凝血功能及血管内皮稳态相关治疗的研究已经取得了一定进展。该文就近年来脓毒症治疗领域的研究进展进行综述。Abstract: Sepsis is a severe and life-threatening symptom that poses a significant risk to human health. Treatment mainly involves supportive care, but research on new drugs is ongoing. Advancements have been achieved in the management of immune function, inflammatory pathway, blood coagulation, and vascular endothelial homeostasis in sepsis. The advances in the treatment of sepsis in recent years were these reviewed in this article.
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Key words:
- sepsis /
- pharmacotherapy /
- immunotherapy /
- inflammation /
- coagulation management
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水合氯醛，又称水合三氯乙醛，具有镇静、催眠、抗惊厥等作用，临床上以溶液口服或灌肠方式给药。但水合氯醛稳定性较差，临床使用制成溶液制剂有效期很短，其主要的杂质有三氯甲烷、甲酸、氯乙酸等，其中三氯甲烷是原料生产与储存过程中比较重要的降解杂质[1]。国内较多数的文献对水合氯醛及其制剂的稳定性研究采用滴定法或紫外法[2-3]，此方法准确度差，专属性不足，不能准确评估水合氯醛及其制剂的质量状况。目前，《中国药典》以及国外各国药典收载的水合氯醛及其制剂的质量标准中有关的检查方法专属性均较低[4-7]。
各国药典中鉴别、酸度、炽灼残渣与溶液澄清度是水合氯醛药物的基本理化分析项，醇合三氯乙醛则为控制本品合成过程中产生的一种杂质。水合氯醛在生产、运输过程中可能产生的降解杂质有甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等，现有的法定标准对此部分降解产物未进行控制，有关物质项存在缺失。本文旨在对主要降解产物进行定量检测，如甲酸、三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸进行检测方法开发，其中，水合氯醛通过碳碳键断裂降解成等比例甲酸、三氯甲烷，检测甲酸或检测三氯甲烷均可。
三氯甲烷主要采用气相、气质色谱法[8-10]进行检查，氯乙酸等卤代羧酸可采用液相色谱法和离子色谱法[11-13]分析，水合氯醛专属性较强的检测方法为气相色谱法[10-14]。因卤代羧酸具有沸点高、强极性特点，不易气化，无法直接进样进行气相色谱分析，需进行衍生化处理，故本文将卤代羧酸检测方法与三氯甲烷检测方法分别开发建立。
1. 实验部分
1.1 仪器与试剂
Thermo trace 1300 GC（赛默飞气相色谱仪）；电子天平 ME-204E（梅特勒科技）；三氯甲烷 （北京通广试剂公司）；氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸（标准品，CATO）；正庚烷（fisher）；甲醇、硫酸、硫酸钠；水合氯醛（青岛宇龙海藻药业，批号20190403）。
1.2 色谱条件
色谱柱温：40 ℃保持3 min；以5 ℃/min的速度升至80 ℃，以20 ℃/min升至160 ℃，再以30 ℃/min升至250 ℃；进样口温度：150 ℃；检测器：ECD，温度280 ℃；色谱柱：DB-5.625 30 m×0.25 mm，0.25 μm；进样体积1 μl。
1.3 供试品与对照品溶液配制
分别确定水合氯醛检测三氯甲烷和卤代羧酸的样品处理方法，详见表1。
表 1 三氯甲烷与卤代羧酸检测样品前处理方法溶液名称 前处理1 前处理2 供试品溶液（测定卤代羧酸） / 称取水合氯醛约10 mg，置50 ml具塞试管中，精密加入甲醇2 ml，20%的硫酸乙醇溶液2 ml（V/V），无水硫酸钠0.1 g，密塞，漩涡使溶解，置50 ℃水浴加热40 min，取出后迅速冲凉，精密加入4 ml正庚烷，漩涡混匀，加入
20 ml水，振摇，静置20 min，分层，取上清液即得。卤代羧酸对照品溶液 / 分别称取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸适量，分别用甲醇配制成浓度为100 μg/ml的储备液，取1 ml置10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度即得；取上述溶液各1 ml，置50 ml具塞试管中，精密加入1 ml甲醇，20%的硫酸乙醇溶液2 ml（V/V），无水硫酸钠0.1 g，密塞，漩涡使溶解，置50 ℃水浴加热
40 min，取出后迅速冲凉，精密加入4 ml正庚烷，漩涡混匀，加入20 ml水，振摇，静置20 min，分层，取上清液即得各对照品溶液。供试品溶液（测定三氯甲烷） 称取水合氯醛约10 mg，置10 ml具塞试管中，加甲醇溶液完全，定容后过滤取续滤液即得。 称取水合氯醛约100 mg，置10 ml具塞试管中，加入饱和氯化钠溶液
0.35 ml，氯化钠0.5 g，正己烷5 ml，密塞，振摇提取，静置20 min，取正己烷层，取续滤液即得。三氯甲烷对照品溶液 称取三氯甲烷适量，甲醇溶解至
60 μg/ml即得。称取三氯甲烷适量，用正己烷配置成浓度为20 μg/ml的储备液；取1 ml置10 ml量瓶中，用正己烷定容至刻度即得。 2. 结果与讨论
2.1 卤代羧酸检测分析方法验证
2.1.1 系统适用性试验
按照图1方法，配制用于氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸检测的对照品溶液，并按照“1.2色谱条件”进样检测，结果如下。
对照品溶液浓度分别为氯乙酸 9.95 μg/ml，二氯乙酸 13.49 μg/ml，三氯乙酸9.45 μg/ml，连续进样5针，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的保留时间分别为4.33、5.89和7.38 min，各峰面积RSD分别为0.75%、1.00%、1.00%，满足系统适用性要求。衍生化转化目标物更容易被气化，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸经衍生化后分别以氯乙酸乙酯、二氯乙酸乙酯、三氯乙酸乙酯形式被检测。
2.1.2 线性关系考察
分别取氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸对照品适量，加甲醇溶解稀释制成浓度为10 μg/ml的储备液，分别取储备液适量置具塞试管中，按照表1衍生化处理后，取正庚烷层，即得各自的工作曲线样品溶液，按照“1.2色谱条件”进样检测，以峰面积为纵坐标，相应卤代羧酸浓度为横坐标，进行线性回归。结果见表2，并按照信噪比大于3和大于10分别规定检测限和定量限。
表 2 氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸线性试验结果样品名称 线性方程 回归系数 r 线性范围(μg/ml) 检测限(μg/ml) 定量限(μg/ml) 氯乙酸 Y=0.0042X+0.0002 0.9997 0.25~5 0.025 0.05 二氯乙酸 Y=0.1106X+0.005 0.9998 0.125~2.5 0.05 0.125 三氯乙酸 Y=0.32X+0.0164 0.9998 0.0625~2.5 0.01 0.0625 将上述信噪比满足定量限的各对照品溶液连续进样5针，氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面积RSD为别为5.27%、1.94%、1.15%，显示各目标物的定量限浓度下检测精密度满足要求（RSD<15%）。
2.1.3 重复性试验
按表1前处理方法进行配制供试品溶液和对照品溶液，平行取6份供试品溶液，连续采集，记录并计算各供试品溶液中氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸的含量，氯乙酸均未检出，二氯乙酸含量RSD为4.43%，三氯乙酸含量结果RSD为4.56%，按照本方法进行卤代羧酸含量检测，含量结果RSD均小于6%。 按照《中国药典》2020年版“通则9101分析方法验证指导原则”要求[15]，本供试品中卤代羧酸的含量（10 ppm）重复性要求RSD小于6%。本方法重复性满足要求。
2.1.4 准确度试验
采用加样回收率进行方法准确度考察，精密称取10 mg水合氯醛原料药10份，分别置10个50 ml锥形瓶中，编号1~3加入混合对照品溶液1.2 ml，编号4~6加入混合对照品溶液1 ml，编号7~9加入混合对照品溶液0.8 ml，上述混合对照品溶液中，氯乙酸浓度为 9.95 μg/ml，二氯乙酸 浓度为13.49 μg/ml，三氯乙酸浓度为9.45 μg/ml，第10份不加混合对照品溶液，同步取样混合对照品1 ml置50 ml锥形瓶中，得到11份样品，按照表2衍生化处理，取正庚烷层进样检测，结果如表3。
表 3 氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸准确度试验结果编号 原有量（m/mg） 加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 回收率（%） 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 氯乙酸 二氯乙酸 三氯乙酸 1 10.23 3.00 3.00 3.00 3.14 2.88 3.11 104.5 95.45 95.82 2 10.17 3.00 3.00 3.00 2.72 2.85 2.99 90.64 94.35 91.75 3 9.97 3.00 3.00 3.00 2.61 2.70 3.35 86.99 89.44 103.7 4 10.00 2.50 2.50 2.50 2.46 2.38 2.51 98.25 94.44 91.13 5 9.95 2.50 2.50 2.50 2.13 2.44 2.50 85.09 96.70 90.44 6 10.08 2.50 2.50 2.50 2.52 2.35 2.48 100.9 93.22 89.86 7 10.11 2.00 2.00 2.00 1.71 1.89 2.03 85.53 93.40 89.49 8 9.88 2.00 2.00 2.00 1.82 1.86 2.05 91.01 91.88 90.83 9 10.01 2.00 2.00 2.00 1.78 1.88 2.09 88.82 92.87 92.85 按照本方法进行卤代羧酸含量检测准确度试验，回收率结果符合相关要求。 按照《中国药典》2020年版“通则9101分析方法验证指导原则”要求，本供试品中卤代羧酸的含量（10 ppm）回收率限度要求为80%~115%。本方法准确度满足要求。
2.1.5 稳定性试验
取“2.1.1”项下的各对照品溶液，分别于24 h内不同时间进样检测，结果显示氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸峰面积RSD分别为4.0%、2.1%、1.6%，表明本方法样品溶液24 h内稳定性良好。
2.2 三氯甲烷检测方法学验证
2.2.1 专属性考察
分别按照表1中两种前处理方式配制对照品溶液、供试品溶液。前处理1测定色谱图见图2，前处理2测定色谱图见图3。在上述色谱条件下，两种前处理使用的正己烷和甲醇均不干扰三氯甲烷的测定，三氯甲烷保留时间约为2.5 min。
2.2.2 重复性与系统适用性试验
分别按照前处理1和前处理2方法制备6份供试品；另取三氯甲烷对照品适量，分别用甲醇溶解稀释至60 μg/ml；用正己烷溶解稀释至2 μg/ml。将以上供试品与对照品，按照“1.2 色谱条件”进样检测，结果见表4。
表 4 三氯甲烷检测方法重复性试验样品名称 前处理方法1 前处理方法2 峰面积 含量（%） 峰面积 含量（%） 对照品溶液 1.5129 / 0.2863 / 供试品1 0.7824 3.19 0.0608 0.00212 供试品2 1.4486 5.91 0.0616 0.00215 供试品3 1.6091 6.56 0.0596 0.00208 供试品4 0.6147 2.51 0.0582 0.00203 供试品5 0.8345 3.40 0.0653 0.00228 供试品6 1.0321 4.21 0.0679 0.00237 RSD（%） 37.46 5.89 因水合氯醛对热不稳定，熔点低57 ℃，在高温条件下碳碳键断裂产生三氯甲烷和甲酸，直接进样或顶空进样均可导致水合氯醛降解而使检测结果偏高，不能反映其实际三氯甲烷含量。而且依据ICH Q3C（R6）残留溶剂指导原则，三氯甲烷属于药品生产中应限制使用的溶剂（二类溶剂），其限度要求是60 ppm（即残留上限0.006%），结合本品原料药检测结果与重复性结果，前处理方法2检测结果准确真实。
连续进样5针正己烷配制的三氯甲烷对照品溶液，峰面积RSD为2.45%，表明本法的系统适用性试验结果良好。
2.2.3 线性与范围
精密称取三氯甲烷对照品，用正己烷溶解稀释至20 μg/ml，分别取其中0.2、0.4、0.8、1.0、1.5 ml置10 ml量瓶，用正己烷稀释至刻度即得工作曲线样品，按照“1.2 色谱条件”进样，以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标进行线性回归，得线性方程Y=0.1094X+0.0222, r =0.9998，表明三氯甲烷在浓度0.2408~3.011 μg/ml范围内线性良好。将三氯甲烷对照品溶液逐级稀释，得0.02、0.001 μg/ml进样分析，信噪比分别为14和4，分别为定量限和检测限。
2.2.4 三氯甲烷检测准确度试验
取水合氯醛原料药，按表2中前处理方法2配制，平行9份，编号1~3加入0.6 ml对照品溶液，编号4~6加入对照品储备液0.5 ml，编号7~9加入对照品储备液0.6 ml，分别置10 ml离心管中，加入饱和氯化钠0.5 ml，氯化钠0.5 g，4.4 ml正己烷，振摇溶解，静置30 min，分别取正己烷层进样检测，结果见表5。
表 5 三氯甲烷检测准确度试验样品编号 加入量（m/μg） 检测值（m/μg） 本底值（m/μg） 回收率（%） 供试品1 1.2042 2.30 1.19 91.53 供试品2 1.2042 2.18 1.19 81.70 供试品3 1.2042 2.39 1.19 99.71 供试品4 10.79 11.77 1.81 92.32 供试品5 10.79 11.60 1.81 90.71 供试品6 10.79 11.79 1.81 92.46 供试品7 12.948 13.25 1.81 88.29 供试品8 12.948 12.81 1.81 84.94 供试品9 12.948 14.04 1.81 94.41 按照本方法进行三氯甲烷含量检测的准确度试验，回收率符合《中国药典》相关要求。
2.2.5 三氯甲烷检测溶液稳定性
取三氯甲烷对照品、水合氯醛原料药，按表2中前处理方法2进行配制对照品溶液、供试品溶液，按“1.2色谱条件”进样检测，考察24 h内不同时间样品的稳定性，结果显示供试品与对照品稳定性均小于5.0%，稳定性良好。
2.3 水合氯醛稳定性试验
水合氯醛具有较强的挥发性与引湿性，在高温条件下挥发与降解性能均增强，结合《中国药典》2020年版药品稳定性试验技术要求，对本品进行影响因素试验与加速试验考察。将水合氯醛置样品瓶（封口）中，分别置温度25 ℃/湿度75%，温度40 ℃/湿度75%，温度60 ℃/湿度60%以及温度25 ℃/湿度60%、光照强度4500 lx条件下考察，并于不同时间点检测杂质含量变化，结果见表6。
表 6 水合氯醛稳定性试验结果放置条件 时间（t/d） 检测结果（%） 三氯乙酸 二氯乙酸 三氯甲烷 氯乙酸 温度25 ℃/湿度75% 10 0.001 0.003 0.004 未检出 30 0.001 0.003 0.004 未检出 温度40 ℃/湿度75% 10 0.001 0.003 0.152 未检出 30 0.001 0.003 0.323 未检出 温度60 ℃/湿度60% 10 0.001 0.004 0.546 未检出 30 0.001 0.004 0.871 未检出 温度25 ℃/湿度60%、
光照强度4500 lx10 0.001 0.003 0.045 未检出 30 0.001 0.003 0.151 未检出 以上数据显示，水合氯醛原料受温度和光照影响较大，主要的降解产物为碳碳键断裂的水解产物三氯甲烷，卤代羧酸未有明显的改变。三氯甲烷是主要的降解产物，其中三氯甲烷为二类毒性溶剂，但目前水合氯醛的国内外法定标准中均无三氯甲烷的含量检测和限度要求，且水合氯醛本身具有较大的毒性，则其降解产物的限度仍需结合长期稳定性结果和临床使用的安全性、有效性进行综合评估。另本次试验采用称量瓶封口存放，密封性不佳，会加速水合氯醛的挥发水解，本品应室温避光密封保存；在制剂研发和存储运输过程中，应严格控制温度与光照影响。
3. 结论
本文建立了气相色谱法测定水合氯醛原料药中杂质三氯甲烷、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。利用检测目标物的理化性质，采用不同前处理方法进行三氯甲烷、卤代羧酸的检测，色谱峰形良好，方法简单、准确度高、重复性良好，可避免水合氯醛检测过程中的自身降解，准确高效的检测药物中杂质含量，满足目前市售原料及其制剂的检测需求。
本法中，三氯甲烷检测限浓度为供试品浓度的万分之0.005（0.5 ppm）；氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.1（10 ppm）；二氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.2（20 ppm）；三氯乙酸检测限浓度为供试品浓度的万分之0.04（4 ppm）。本品多次检测以及稳定性试验中均未出现氯乙酸，说明本品中确无高于检出限的残留，也不易降解产生。
通过水合氯醛的稳定性实验发现，本品在温度、光照条件下均会发生降解，三氯甲烷为主要的降解产物，故进行本品相关制剂的研发、检测、生产和运输过程中需要严格控制生产工艺与储存条件，保证产品的质量稳定，保障用药安全性。
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