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白血病是一类由造血干细胞恶性增殖引起的以出血、贫血、感染、不同程度的肝、脾、淋巴结肿大等为症状的造血系统恶性肿瘤[1]。目前,化疗是白血病治疗的重要手段,但复发率高、预后差、易产生耐药性等情况使得其对白血病的治疗效果大大折扣[2-3]。因此,寻找低毒、高效的治疗药物来提高疗效并降低复发率是治疗白血病的关键[4, 5]。中医古籍中无白血病病名,但据其临床特点,应归属于“急劳”“热劳”“髓劳”“血证”“髓枯”“虚劳”等范畴[6],由正虚邪实导致形成本虚标实之证。中药有可改善症状、减低化疗后毒副反应等特点,在白血病的治疗方面具有独特优势[7]。
定清片是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院血液科黄振翘教授、周永明教授在“扶正祛邪”理论指导下,经多年潜心研究,逐步改良而成的一种治疗白血病的有效制剂,由雄黄、黄芩、人工牛黄、栀子、陈皮、冰片等12味药组成[8]。方中诸药配伍,共奏益气养阴、清解邪毒之功,使标本得治、虚实共调。定清片在临床使用中取得了很好的疗效,在临床上定清片联合化疗治疗急性髓系白血病患者的西医疗效总有效率为80.0%,中医证候疗效总有效率为93.34%,缓解率66.7%,高于化疗治疗,还可显著改善患者临床症状,减轻化疗引起的常见毒副反应[9-10]。实验表明,定清片在体外能抑制人白血病HL-60细胞增殖,其作用机制可能与影响细胞周期和诱导细胞凋亡相关[11],但其具体作用机制尚不明晰,需要进一步研究。
本研究利用网络药理学及分子对接技术,探讨定清片治疗白血病的活性成分和作用靶点,以期阐明其可能的作用机制,为定清片用于白血病的临床治疗提供理论依据。
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定清片由12味药组成,通过数据库搜集共获得82个活性成分及439个作用靶点。通过疾病数据库得到白血病相关靶点1 878个,将疾病靶点与活性成分靶点进行交集,绘制韦恩图(图1),得到169个共有靶点。将这169个共有靶点导入Cytoscape中,删除与靶点无交集的孤立成分后绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络图(图2),共获得249个节点、712条边。根据网络的拓扑分析,筛选出度值较大的活性成分有槲皮素(97)、桑黄素(78)、山柰酚(75)、木犀草素(61)、川陈皮素(33)、汉黄芩素(20)和柚皮素(17)等,这些度值较大的化合物可能是定清片治疗白血病的潜在活性成分。
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将169个共有靶点导入STRING数据库,将得到的文件导入Cytoscape软件进行可视化处理(图3A),获得PPI网络图。通过分析可知网路中共有162个节点(靶点蛋白)、1 817条边(蛋白相互作用),颜色由深变浅代表度值由大变小。按照度值大小排名靠前的靶点有TP53、AKT1、CASP3、STAT3、TNF、MYC、EGFR、JUN、BCL2等,选取度值最高的靶点绘制核心靶点PPI网络图(图3B),这些可能是定清片治疗白血病的关键靶点。
为进一步探究靶点间的集落关系,对PPI网络开展MCODE子簇分析,得到评分最高的4个子网络(图4)。其中子网络A包含31个靶点,B含27个,C含7个,D含8个。评分最高的子网络A中包含了31个关键靶点,有FOS、IL2、EGFR、TP53、ICAM1、MAPK3、MAPK14、IFNG、TGFB1、MYC、NFKBIA、HIF1A、CREB1、ESR1、BCL2、TNF、IL10、AKT1、IL6、IL1B、MMP9、CCL2、JUN、CXCL10、PTGS2、IL4、VCAM1、STAT3、IL1 A、CASP3、CXCL8。
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为聚焦核心靶点的相互作用,对子网络A中的31个关键靶点进行GO和KEGG通路富集分析,最终得到GO富集条目431条。其中,生物过程(BP)368条,细胞组成(CC)19条,分子功能(MF)44条。通过GO富集分析发现,BP主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正调控、炎症反应、细胞凋亡过程的负调控等;CC主要包括细胞外间隙、转录因子复合物、大分子复合物等;MF主要包括酶的结合、细胞因子活性、相同蛋白质结合等(图5)。KEGG信号通路有138个条目,相关通路主要有TNF信号通路、IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化和癌症信号通路等(图6)。
为进一步探究其作用机制,以KEGG分析获得的TNF、IL-17信号通路为重点研究对象,探讨药物、活性成分、核心靶点的关系。通过分析发现,信号通路中包含的核心靶点有7个,分别为AKT1、CASP3、MMP9、TNF、JUN、IL-6、MAPK3。这7个核心靶点与定清片中相关活性成分对应,构建活性成分-关键靶点-通路网络(图7),包括36个节点和75条边。核心靶点对应得到的13个活性成分为:槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、刺槐素、β-谷甾醇、汉黄芩素、吴茱萸次碱、川陈皮素、桑黄素、睾酮、黄芩素、芒柄花素等。这些成分存在于黄连、太子参、黄芩、黄柏等8味药材中,通过调控核心靶点参与了TNF与IL-17信号通路的调节,可能在定清片治疗白血病的过程中发挥重要作用。
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采用分子对接技术,选择药物-疾病共有靶点和子网络A的“药物-成分-靶点-通路”网络图中节点度值最高的核心靶点蛋白,包括TP53、AKT1以及MMP9、CASP3和TNF,与排名靠前的活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、刺槐素和柚皮素(图8)进行分子对接分析。化合物与靶点的结合能越低,表明其可能有更好的相互作用。从表1的结合能结果可知,定清片中的活性成分与核心靶点蛋白有一定的相互作用,例如槲皮素,与多个靶点的结合能均小于−20.93 kJ/mol,被认为可能有较好的结合性,其中与AKT1的结合能最低(−41.03 kJ/mol),表明其与AKT1的结合能力最强,槲皮素可能与蛋白上的TYR-272、ASN54、GLN79、THR211残基通过氢键等相互作用(图9),其他活性成分均与对应的大分子蛋白上的关键残基存在相互作用,对接可视化结果见图9。这些结果提示,定清片中的多种化合物成分与白血病的相关核心靶点有良好的亲和性。
表 1 分子对接结果
活性成分 结合能(kJ / mol) MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14
Mechanism of effective ingredients of Dingqing tablets in the treatment of leukemia based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:
目的 探讨定清片治疗白血病的药理作用机制。 方法 检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、本草组鉴平台(HERB),收集定清片的活性成分;利用SwissTargetPrediction数据库预测其作用靶点。利用GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取疾病靶点,将药物与疾病的共有靶点导入String网站,构建共有靶点蛋白相互作用(PPI)网络,并利用MCODE插件筛选核心子网络。利用DAVID数据库中对评分最高的子网络A基因进行GO和KEGG富集分析,构建“成分-靶点-通路”网络;利用AutoDock对定清片的活性成分和核心靶点进行分子对接,并对其结果进行可视化分析。 结果 数据库检索共获得定清片活性成分82个及其作用靶点439个,白血病相关靶点1 878个,活性成分和疾病的共有靶点169个。由度值推测定清片中发挥作用的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚等,而PPI核心网络表明其治疗白血病的关键靶点主要包括TP53、MMP9、TNF、AKT1、CASP3等;子网络的基因富集分析及“成分-靶点-通路”网络图显示定清片可能通过调节TNF、IL-17等信号通路来发挥对白血病的治疗作用。分子对接结果显示活性成分与靶点间有较强的结合活性。 结论 定清片的活性成分可能通过调控TP53、AKT1和CASP3等基因参与TNF、IL-17等信号通路,从而发挥对白血病的治疗作用。 Abstract:Objective To explore the material basis and mechanism of the Chinese medicine Dingqing tablets in the treatment of leukemia. Methods The potential active ingredients of Dingqing tablets were retrieved through TCMSP and HERB Database and the targets of herbs were screened by Swiss TargetPrediction databases. The treatment targets of leukemia were searched from the GeneCards, OMIM and Disgenet databases. The protein-protein interaction network was used to construct the interactive target regulation function of Dingqing tablets and leukemia by STRING software, and the core subnetworks were filtered by the MCODE plug-in. A component-target pathway network was constructed by GO and KEGG enrichment analysis of the highest scoring sub-network A gene in the DAVID database. Molecular docking of the active components and core targets of Dingqing tablets was performed by AutoDock and the results were visualized. Results A total of 82 active ingredients and 439 targets of action of Dingqing tablets, and 1 878 leukemia-related targets were obtained through database retrieval, in which 169 common targets of active ingredients and diseases were mapped. Based on the degree values, the main active ingredients were determined as quercetin, luteolin, kaempferol, etc. The PPI core network indicated that the key targets for treating leukemia included TP53, MMP9, TNF, AKT1, CASP3, etc. The gene enrichment analysis of sub-networks and the component-target pathway network diagram showed that Dingqing tablets might exert therapeutic effects on leukemia by regulating signaling pathways such as TNF and IL-17. The molecular docking results showed fairly strong binding activity between the active ingredients and the targets. Conclusion The active ingredients of Dingqing tablets may participate in TNF, IL-17, and other signaling pathways by regulating genes such as TP53, AKT1, and CASP3, thereby exerting therapeutic effects on leukemia. -
Key words:
- Dingqing tablets /
- leukemia /
- network pharmacology /
- molecular docking /
- mechanism
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表 1 分子对接结果
活性成分 结合能(kJ / mol) MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 -
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