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盆腔炎是一种常发病于年轻女性上生殖道感染的妇科疾病。临床研究发现，盆腔炎患者上生殖道内存在大量激活的巨噬细胞[1]。在炎症和病原体的刺激下，巨噬细胞过度激活可以释放出大量炎症因子，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）。研究发现，NLRP3炎性小体激活可以促使caspase-1活化并切割IL-18、IL-1β前体，促进IL-18、IL-1β的成熟与释放，而抑制NLRP3炎性小体过度激活以减轻盆腔炎临床症状，并且与降低炎症因子、趋化因子释放有关。巨噬细胞在不同刺激下可以活化为不同表型：经典活化的M1型和替代活化的M2型。在含有脂多糖（LPS）和IFN-γ微环境中，巨噬细胞活化为变形虫样的M1型，参与炎症的发生。巨噬细胞在含有IL-4、IL-10、IL-13等抗炎因子微环境中被活化为M2型，表达精氨酸酶 1(Arg-1)和甘露糖受体1(CD206) 等特异性标志分子，参与炎症消退和组织重塑。研究发现，M1 /M2比例失衡是多种炎症性疾病的病理标志，如肥胖[2]、糖尿病[3]、动脉粥样硬化[4]等。
益母草碱（LEO）是一种具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用的天然黄酮类化合物[5]，研究报道显示益母草碱可抑制Bax/Bcl-2信号通路激活抑制炎症因子的表达[6]。但鲜有益母草碱对巨噬细胞中NLRP3炎症小体影响的报道。本实验以益母草碱为研究对象，探讨其对巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活的影响，以及对巨噬细胞M1/M2表型的调节作用。
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益母草碱（纯度>98%，西格玛奥德里奇贸易有限公司，上海）；脂多糖（L6143）、DMEM高糖培养基、胎牛血清、NuPAGE 10% Bis-Tris Gel、10×MOPS SDS 运行缓冲液、10×传输缓冲液、预制蛋白Marker、荧光定量PCR、反转录试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）；青-链霉素混合液、胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；Griess试剂盒（江苏碧云天生物试剂公司）；IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；caspase-1兔抗单克隆抗体、β-actin兔抗单克隆抗体、羊抗兔/羊抗鼠单克隆二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；NLRP3兔抗单克隆抗体（英国Biorbyt生物试剂公司）；四甲基偶氮唑蓝溶液（MTT，美国Bio-Rad公司）；TRIzol Regent试剂盒（日本TaKaRa公司）。
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C57BL/6小鼠，6周龄，雌性，体重(20±2) g，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠饲养于实验室SPF级动物房，温度（22 ± 1）°C和湿度（60 ± 2）%，动物自由饮食。动物实验操作均通过实验动物伦理委员会批准。
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以颈椎脱臼的方式处死小鼠，置于75%的乙醇溶液中浸泡10 min，将15 ml PBS缓冲液注入小鼠腹中，仰卧平放，揉捏小鼠腹部5 min，吸出腹液，离心分离巨噬细胞，用DMEM培养液调整细胞浓度，在细胞培养箱中以5%CO2、37 ℃恒温孵育24 h后，换液，去除未贴壁细胞，即得到纯化的小鼠腹腔巨噬细胞[7]。以1.5×105个/ml密度接种于24孔（或96孔）板中培养24 h后，随机分为空白组、益母草碱（10 μmol/L）组、脂多糖（1 μg/ml）组、脂多糖+益母草碱（10 μmol/L）组，益母草碱预处理1 h之后加入脂多糖，放回孵箱中培养，24 h后，提取上清液和细胞蛋白，检测相关指标。
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脂多糖预处理巨噬细胞24 h后，在96孔板中每孔加入10 μl（5 mg/ml）MTT溶液，于37 ℃孵箱中培养，4 h后取出，移除细胞上清液，每孔加入200 μl二甲基亚砜，放置于恒温摇床震摇10 min，于562 nm处测定OA值，检测相关指标。
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Griess试剂盒取出，恢复至室温。将细胞上清液和标准品和加入到96孔板中，将试剂I 和试剂II 混匀加入96孔板中，避光，放置于恒温摇床震摇30 min，于470 nm处测定OA值，检测NO含量。
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提前将ELISA试剂盒取出，恢复至室温。稀释细胞上清液，配置标准品工作液，按照ELISA试剂盒说明书要求依次加入反应液，最后加入终止液，于450 nm处检测OD值，计算IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量。
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按照Trizol法提取巨噬细胞中总RNA，根据逆转录试剂盒说明书，进行RT-PCR反应。设定反应条件为：5 ℃预变性30 s，接着95 ℃变性6 s，最后60 ℃退火，延伸37 s，重复反应40个循环。RT-PCR引物设计见（表1）。以GAPDH为内参，利用2−∆∆Ct方法分析结果。
表 1 PCR引物序列
基因 引物序列（5′→3′） NLRP3 F: AGAAGAGACCACGGCAGAAG R: CCTTGGACCAGGTTCAGTGT ASC F: TGGATGCTCTGTACGGGAAG R: CCAGGCTGGTGTGAAACTGAA caspase-1 F: CTTGGAAATAGCTCCCAGAA R: CATTTGGGAACTTCTCATCC TNF-α F: CCAATGGCAGAGTGGGTATG R: TGAAGAGGACCTGGGAGTAG iNOS F: GGGAATCTTGGAGCGAGTTG R: GTGAGGGCTTGGCTGAGTGA CD206 F: CAGGTGTGGGCTCAGGTAGT R: TGGTGAGCTGAAAGGTGA Arg-1 F: TTGCTGTGCTCCATAGTTTCCA R: CCATGCAAGTTTCCACTTGT GAPDH F: GGAGAAACCTGCCAAGTATG R: TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG -
脂多糖处理巨噬细胞24 h后，弃去细胞上层培养基，置于冰上，PBS洗涤3次，加入RIPA裂解液（含1%PMSF）反应30 min，离心，收集上清液。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量，配置缓冲液，变性。每孔10 μl加入到10%预制胶中，设置电压200 V电泳30 min，设置电压25 V电转30 min，TBST洗涤，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗涤，4 ℃一抗孵育过夜，TBST洗涤，二抗孵育30 min，TBST洗涤，加入曝光剂，曝光。
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采用SPSS18.0分析实验中所涉及的数据，组间比较方差齐，用LSD检验，方差不齐采用 Dunnett’s T3检验，以P < 0.05为统计学差异，数据结果用均数 ± 标准误（
$\bar x \pm s$ ）表示。 -
首先，观察益母草碱和脂多糖对巨噬细胞活力的影响（图1）。结果显示，脂多糖和益母草碱均能提高巨噬细胞的活力（P<0.05），当益母草碱与脂多糖共同刺激巨噬细胞时，巨噬细胞活力得到了进一步的增强（P<0.05）。
图 1 益母草碱对巨噬细胞活力的影响
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观察益母草碱对巨噬细胞炎症因子释放的影响，在脂多糖刺激下，巨噬细胞上清液中NO的释放增加，而益母草碱可以抑制巨噬细胞NO释放（图2A）。检测脂多糖对巨噬细胞上清液中IL-1β、IL-18和IL-6释放的影响，结果发现，益母草碱可以降低巨噬细胞IL-1β、IL-18和IL-6释放（图2B-2D）。结果显示，益母草碱可以减少脂多糖引起的巨噬细胞炎症因子的释放。
图 2 益母草碱对巨噬细胞产生NO、IL-1β、IL-6及IL-18的影响
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细胞内IL-1β、IL-18等炎症因子的释放需要经过NLRP3炎症小体的激活，为此，观察了益母草碱对NLRP3炎症小体激活的影响。RT-PCR结果显示（图3），脂多糖刺激后，NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达增加，益母草碱可以降低mRNA表达。Western blot结果也证实益母草碱可以抑制脂多糖引起的巨噬细胞中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达（图4）。
图 3 益母草碱对NLRP3炎症小体相关蛋白mRNA表达影响
图 4 益母草碱对NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响
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应用RT-PCR检测益母草碱对巨噬细胞M1/M2表型的影响。正常情况下，巨噬细胞M1型标志物TNF-α和iNOS表达量较低，经脂多糖诱导刺激后TNF-α和iNOS的表达水平显著升高，益母草碱可以降低脂多糖引起的TNF-α和iNOS的mRNA表达（图5A和5B）。另一方面，脂多糖诱导刺激后，巨噬细胞M2型标志物Arg-1和CD206的表达水平降低，益母草碱预处理可以增加脂多糖引起的Arg-1和CD206表达（图5C和5D）。表明益母草碱可以调控脂多糖引起的巨噬细胞由M1向M2型转化。
图 5 益母草碱调节巨噬细胞由M1/M2型极化
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研究发现在盆腔炎患者的上生殖道内存在大量激活的巨噬细胞[8]。巨噬细胞是参与炎症反应的天然免疫细胞，当病原体入侵或者组织发生病变时，巨噬细胞分泌多种炎症因子，诱导更多的巨噬细胞活化、募集，加强局部抗炎作用。正常生理情况下，炎症因子的含量极少，具有维持机体免疫和调节心脑血管等功能[9]。但当机体长期受到病原微生物、致炎因子刺激时，会导致一系列病理改变，如长期慢性子宫内膜炎刺激可以增加子宫纤维化的发病率[10]。基于此，本实验利用革兰阴性菌来源的脂多糖刺激巨噬细胞，观察益母草碱对脂多糖诱导的巨噬细胞激活和炎症因子表达的影响。结果显示，脂多糖刺激可以引起巨噬细胞过度激活，相关炎症因子表达增加，益母草碱预处理可以减少炎症因子的表达和分泌，提示益母草碱的抗炎作用与抑制巨噬细胞中炎症因子的产生有关。
为了进一步阐明益母草碱的抗炎作用，本实验对NLRP3炎症小体进行了研究。大量研究发现脂多糖可以激活NLRP3炎症小体，引起细胞因子释放增加。鉴于盆腔炎是炎性刺激引起的病理变化，且抑制NLRP3炎症小体可以降低炎症，推测抑制NLRP3炎症小体过度激活可能对盆腔炎起到一定的治疗效果。本实验中发现，益母草碱可以通过抑制脂多糖引起的巨噬细胞中NLRP3炎症小体相关蛋白表达，从而减少炎症因子释放，证实益母草碱可以抑制脂多糖诱导的巨噬细胞内NLRP3炎症小体的过度激活发挥抗炎作用。
巨噬细胞的表型转化在盆腔炎的病理进程中发挥着重要作用，M1型巨噬细胞主要发挥促炎、吞噬病原体的作用，M2型巨噬细胞主要发挥促进组织重塑、损伤修复等。因此，在盆腔炎疾病中，M1型巨噬细胞能够加重上生殖道炎症进展，而M2型巨噬细胞能抑制疾病进展。为了明确脂多糖对巨噬细胞分化的影响，使用RT-PCR实验验证不同处理方式对巨噬细胞分型的影响。结果显示，脂多糖能够促进M1型标志物TNF-α和iNOS的mRNA表达，而益母草碱能明显抑制 TNF-α和iNOS的mRNA表达，同时促进M2型标志物Arg-1和CD206的mRNA表达。上述结果提示，益母草碱能抑制脂多糖诱导的巨噬细胞向M1型分化以及IL-18、IL-1β、TNF-α表达，促进巨噬细胞向M2型分化。
在炎症反应过程中，脂多糖可以引起巨噬细胞中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等炎症因子表达增加，益母草碱可以通过抑制NLRP3炎症小体激活发挥其抗炎作用，提示抑制NLRP3炎症小体过度激活可能成为盆腔炎治疗的新策略，同时，本研究也为进一步开发益母草碱作为妇科用药提供理论基础。
Effect of leonurine on peritoneal macrophages M1/M2 phenotypic differentiation via inhibiting overactivation of NLRP3 inflammasome
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摘要:
目的 研究益母草碱对脂多糖(LPS)诱导小鼠腹腔巨噬细胞免疫应答影响及相关机制。 方法 分离小鼠腹腔巨噬细胞，用脂多糖和益母草碱预处理24 h，MMT法检测巨噬细胞活性；Griess法检测NO释放量；ELISA法检测IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的释放量；RT-PCR法检测NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、iNOS、Arg-1和CD206的mRNA表达量；Western blot检测NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达量。 结果 益母草碱能显著抑制脂多糖引起的巨噬细胞上清液中NO、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的释放。RT-PCR及Western blot实验结果显示，益母草碱可以抑制脂多糖引起的巨噬细胞中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA及蛋白表达；益母草碱还能明显抑制脂多糖所诱导的巨噬细胞向M1型分化，并促进巨噬细胞向M2型分化。 结论 益母草碱能通过抑制NLRP3炎症小体，促进脂多糖诱导的巨噬细胞由M1表型向M2表型分化。 Abstract:Objective To find the effect of leonurine on LPS-induced macrophages activation and its potential mechanism. Methods Mouse primary peritoneal macrophages were isolated and pretreated for 24 h with LPS and leonurine. MTT assay was used to detect the cell viability of macrophages. The production of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-18 in culture medium were tested by ELISA, and the production of NO was detected by Griess reagent. The mRNA expression of NLRP3, ASC, caspase-1, TNF-α, iNOS, Arg-1 and CD206 were detected by RT-PCR, and the protein expression of NLRP3, ASC and caspase-1 were detected by Western blotting. Results LPS can significantly increase the releases of NO、IL-1β、IL-6、TNF-α and IL-18 from macrophages. Leonurine can suppress the expression of pro-inflammatory factor levels, such as IL-1β (P<0.05), IL-18 (P<0.05), NO(P<0.05), IL-6(P<0.05) and TNF-α (P<0.05). Leonurine can decrease the activation of macrophage as well as the expression of NLRP3 Inflammasome.Protein expressions of NLRP3、ASC、caspase-1 were mitigated. Conclution Leonurine exerts beneficial effects through M1/M2 phenotypic differentiation of peritoneal macrophage via inhibiting overactivation of NLRP3 inflammasome. These findings suggest that leonurine might have a therapeutic potential for pelvic inflammatory disease. -
Key words:
- macrophage /
- inflammasome /
- leonurine /
- NLRP3 inflammasome /
- M1/M2 polarization
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脑血管疾病是仅次于心脑血管疾病和癌症的第三大病症，其中脑缺血是常见的脑血管疾病之一。脑缺血的患病率和死亡率仍处于上升趋势，严重影响人们的健康。目前，西医对于脑缺血的主要治疗方式是溶栓和取栓，但有严格的溶栓时间窗和较大的取栓风险，并且缺血后造成神经功能的损伤没有有效的药物治疗[1]。中医药在脑缺血的预防和治疗中具有潜在作用，以气虚为本、血瘀为标作为主要病因[2]。查阅近几年文献发现，益气活血化瘀方药在防治脑缺血中表现出多方面和整体调节的优势。
参麻颈复方是临床名老中医经验方，临床应用发现具有活血通络，益气养血，宁神安脑，健筋壮骨之效。该方由首乌藤、丹参、山茱萸（制）、天麻、当归、川芎等组成，临床应用广泛。首乌藤有养血安神、祛风通络之效[3]，丹参有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神之效[4]，当归有补血调经、活血散寒、消肿止痛生肌、润肠通便之效[5]，川芎、陈皮的补气之效辅佐以上药物活血功效运行，而且川芎具有活血化瘀之效，是传统中医防治中风选择最多的配方之一[6]。本研究评估参麻颈复方对小鼠脑缺血损伤的改善作用，并进一步探讨其对骨髓来源内皮祖细胞干预发挥防治脑缺血损伤的机制，为中药方剂治疗脑缺血提供新的思路、寻找新的靶点。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器及试剂
细胞培养箱（Thermo公司）；倒置荧光显微镜（Leica 公司）；Odssey红外荧光显像（Li-Cor公司）；酶标仪（芬兰 Labsystens Dragon 公司）；涡旋混合器（江苏天翎仪器有限公司）；超净台（苏州净化设备有限公司）；电子天平JA2003（上海天平仪器厂）。 参麻颈复方颗粒（岳阳医院自制制剂，批准文号：沪药制字Z05050324）；尼莫地平片（天津市中央药业有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京西浓科技有限公司）；VEGF抗体（abcam公司）；BDNF抗体（abcam公司）；GAPDH内参抗体（abcam公司）；Tubulin内参抗体（abcam公司）；内皮细胞培养基（EGM-2 Single Quots，Lonza公司)；波连蛋白（vitronection，BD公司）。
1.2 实验动物及分组
实验动物为SPF级C57BL/6雄性小鼠30只（上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证：SCXK（沪）2017-0012），体重为18-20 g，6-7周龄。适应性饲养1周后，将30只小鼠随机分为模型对照组（Control组）、参麻颈组（SMJ组）、尼莫地平组（NMDP组），10只/组。实验过程中对于实验小鼠的所有处理均符合伦理学规定。
1.3 实验方法
1.3.1 制备动物模型
采用电凝法制备局灶性脑缺血模型[7]，用浓度为12%的水合氯醛对小鼠进行腹腔注射，剂量控制在350 mg/kg。小鼠麻醉后，仰卧位固定在手术台。借助显微镜，用显微镊沿颞肌纤维束的方向钝性分离肌肉，直到颧骨及麟骨暴露，显微镊夹住颧骨固定小鼠头部，用牙科钻重点打磨颧骨和麟骨的交叉部位，骨壳变薄并有裂缝时，停止打磨，用撬棒沿已暴露的动脉血管剥离骨片，直至小鼠左侧大脑中动脉与伴行的迷走神经分叉暴露；在显微镜下，找准纹状体外侧动脉近心端，用双极电凝器凝断左侧大脑中动脉后，将电凝器缓慢移出，显微镜下再次确认是否凝断。最后用显微镊将皮肤和肌肉归置原位，以便于缝合。小鼠完全苏醒后，观察精神状态，若出现站立不稳、左侧肢体偏瘫、提尾向一侧转圈等神经功能损害症状，即为造模成功。
参麻颈组在手术前通过灌胃方式给予6.88 g∙kg−1的参麻颈复颗粒；尼莫地平组给予2.16 mg/kg溶液灌胃；模型对照组给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，共14 d。
1.3.2 神经行为学功能评分
术后第3 d，由观察者在不知分组情况下记录神经行为学表现，并采用参考文献[7]评分方法，如提尾悬空试验等[8]，评估神经行为学功能评分。
提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠重复提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠测20次，并且每次测定的时间间隔不少于1 min，以保证小鼠得到充足的休息。小鼠的偏转率计算按以下公式：摆动频率（%）=（T−10）/10×100%。
T为实验小鼠头部向手术对侧偏转的次数。
平衡木试验：记录小鼠由木棍一端顺利通过平衡木80%长度所用的时间。在正式试验前对小鼠进行3次训练，正式试验时每只小鼠重复测定3次，对每只小鼠均间隔5 min后进行下一次实验。
1.3.3 脑组织TTC染色
行为学评分测完后，小鼠脱颈处死，取脑组织，放1×PBS中清洗干净，将脑组织放在脑片模具中，共切7片，每片2 mm，放2%的TTC溶液中，并在37 ℃水浴锅中染色10 min，染色结束后放4%多聚甲醛固定6 h，按照脑片大小顺序排好拍照，脑片使用Image J统计软件测定小鼠的脑梗死体积。
1.3.4 细胞功能测定
取脑组织的同时，提取小鼠骨髓来源内皮祖细胞，培养至第7d时，收集和处理细胞，对细胞黏附、迁移及形成小管能力进行测定。
细胞黏附实验：用胰酶消化细胞,按照3×105个/ml细胞接种于预先包被人纤维粘连蛋白的96孔板中，在细胞培养箱中培养5 h后弃掉未黏附细胞，再用4%多聚甲醛固定，以Hochest 33258染料染色后于倒置显微镜下拍照。
细胞迁移实验：调整细胞浓度3×105个/ml，Transwell小室置于24孔板，按分组下室加600 μl配好的下室溶液，细胞悬液接种于上室各100 μl,置培养箱内培养24 h，用PBS清洗2次，弃上清液，在2%多聚甲醛固定15 min。弃上清，PBS清洗2次，上室转移至含600 μl Hochest 33258染料的孔中，避光染色15 min。弃上清，PBS浸泡5 min,弃上清，光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组迁移细胞数。
小管形成实验：调整各组细胞至3×105个/ml，每孔100 μl的细胞悬液加到铺有基质胶的孔中，最后将96孔板移至培养箱孵育6 h，在光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组小管形成数量。
1.3.5 Western blot检测
细胞样本同“1.3.4”项中相同来源，六孔板放在冰枕上，用预冷PBS润洗细胞两次，弃上清液；向板内加入60 μl已配置好的细胞裂解液，在冰枕上裂解15 min，收集细胞液转移至1.5 ml EP管中，使用高速离心机在12 000 r/min，4 ℃离心15 min，将离心后的上清液收集到新的离心管中并放到−80 ℃冰箱保存。应用紫外分光光度计测量蛋白浓度后，进行蛋白定量，95 ℃ 5 min蛋白灭活后，−20 ℃保存待用。SDS-PAGE凝胶电泳：初始电压调为50 V，电泳至Marker中红色条带分离出，将电压调为 120 V，直至Marker显示跑到胶的底部时停止电泳。转膜：恒流200 mA转膜，不同目的蛋白按其分子量大小设置转膜时间。封闭：用5%脱脂牛奶封闭1 h。封闭之后用1%牛奶配置的一抗4 ℃孵育过夜。第2天，用1%牛奶配制的二抗室温孵育1 h，NC膜放到Odyssey扫膜仪上进行扫描，保存扫描照片，使用Quantity One软件统计蛋白的灰度值。
1.4 统计学处理
使用Graphpad prism 5.0分析数据。实验数据均以（
$ \bar x $ ±s）表示，两组之间的差异采用非配对T检验进行分析，多组数据间的差异采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05表示差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 各组小鼠神经功能学评分
小鼠造模成功后出现明显的神经功能障碍，表现为站立不稳、左前肢屈曲内收，肌张力下降。与对照组比较，尼莫地平组小鼠的神经功能有明显改（P<0.01）；与对照组比较，参麻颈组小鼠的爬杆时间（P<0.05）和对侧偏转率（P<0.01）均有显著降低，表明小鼠给予参麻颈复方后，能有效保护缺血后神经功能的缺损（图1）。
2.2 各组小鼠脑梗体积变化
用TTC染色后结果显示：对照组小鼠术后脑组织出现明显的梗死灶。与对照组比较，给参麻颈组小鼠脑缺血后脑梗体积显著减少（P<0.01）；给予尼莫地平的小鼠与参麻颈组相比，其脑梗体积虽有减少，但无统计学差异（图2）。 2.3 各组小鼠内皮祖细胞黏附功能比较
细胞黏附实验结果显示：对照组相比于另外两组，黏附细胞数目减少。预先给予参麻颈的小鼠，在发生脑缺血后，小鼠骨髓来源内皮祖细胞黏附于96孔板中细胞数目，明显高于对照组（P<0.01）；给予尼莫地平组，其细胞数目也比对照组增多（P<0.01）；而尼莫地平组和参麻颈组两组的差异无统计学意义（图3）。 2.4 各组小鼠内皮祖细胞迁移功能比较
迁移实验结果显示：与参麻颈组和尼莫地平组比较，模型对照组细胞迁移至Transwell板上室下面的数目可见减少。与对照组比较，给予参麻颈复颗粒后的脑缺血小鼠，其骨髓来源内皮祖细胞迁移数显著增加（P<0.05）；给予尼莫地平的小鼠与对照组比较，其迁移细胞数目增加（P<0.01）；参麻颈组和尼莫地平组，两组结果有差异但无统计意义（图4）。 2.5 各组小鼠内皮祖细胞形成小管能力比较
从图中可看出，对照组小鼠内皮祖细胞形成小管的数目减少。与对照组比较，参麻颈组内皮祖细胞形成小管数目有明显增加（P<0.05），尼莫地平组小管形成数目更为突出（P<0.01）；尼莫地平组形成的小管状态也优于参麻颈组（图5）。
2.6 各组小鼠内皮祖细胞中相关蛋白的表达水平
Western blot检测结果显示：与对照组比较，参麻颈组（P<0.01）和尼莫地平组（P<0.01）小鼠内皮祖细胞内BDNF蛋白表达增加，而参麻颈组和尼莫地平组之间结果差异无统计学意义（图6）。
3. 讨论
缺血性中风是一种以动脉粥样硬化为基础的中枢系统不可逆损伤；它是由阻塞颈内动脉、椎动脉或者脑血管的血栓形成引起的，这一过程减少了血液供应，导致细胞代谢紊乱和衰老，并进一步导致血管内皮损伤[9-10]。脑缺血后导致严重的脑损伤，并造成神经功能障碍，包括偏瘫、肢体痉挛和认知障碍等，从而降低患者的生活质量[11]。目前，西医临床治疗存在局限性，使得该疾病的残疾率仍然很高，以及带来的社会经济负担也在继续增加。中医药博大精深，很多研究者一直都在致力于寻找改善脑缺血所致神经功能障碍的中医疗法。
中医典籍《伤寒杂病论》早就将活血化瘀中药或中药复方用于缺血性疾病的治疗。活血化瘀中药复方通过多靶点、多途径的作用方式发挥整体性作用。现代研究方法——代谢组学、基因组学、蛋白质组学等为中药复方作用机制的阐述提供强有力的支持。前期相关研究显示，在传统中药中，发现许多成分可以促进血管的生成，如丹参酮，川芎嗪，三七总皂苷等[12-14]，这些是方剂中常用的中药，也是活血化瘀类草药的代表。而参麻颈复方中，大部分的中药具有活血化瘀作用，是否能够改善骨髓来源内皮祖细胞功能，又能否促进脑缺血损伤后的新血管的生成，需要进一步验证。
本研究中，参麻颈复方颗粒预处理后，小鼠脑缺血所致的神经行为学功能评分显著改善；TTC染色梗死体积也显著减少（P<0.01）。证明参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤具有保护作用，可改善神经功能和减小缺血梗死体积。
越来越多的临床前研究表明[15]，无论是缺血性脑卒中急性期还是慢性期，均会导致炎症和脑组织不可逆转的损伤。因此，为了减轻缺血组织的病理损伤，修复内皮功能障碍引起的血管损伤成为缺血性脑卒中治疗的主要方向。骨髓来源内皮祖细胞是内皮愈合和血管生成的关键效应因子。内皮祖细数量减少、内皮功能障碍与心血管事件风险增加息息相关[16]，这与内皮祖细胞介导的血管修复受损致使血管疾病进展是一致的[17]。为了响应缺血信号和血管损伤,骨髓来源的内皮祖细胞被动员到循环中并募集到内皮损伤部位，从而形成新生血管，这也是一种自然的防御机制[18]。
第二部分实验研究了参麻颈复方颗粒对脑缺血损伤小鼠内皮祖细胞的保护作用。结果显示，小鼠脑缺血损伤后，来自骨髓的内皮祖细胞黏附在96孔板和迁移至Transwell板下室的数目有显著减少，给予参麻颈复方颗粒预处理后，黏附细胞数目（P<0.01）和迁移细胞数目（P<0.05）均有明显增加。另外，脑缺血损伤可影响血管新生的速度和质量，表现为内皮祖细胞形成小管的能力，包括形成小管的数量和小管长度。本研究的结果中，参麻颈复方颗粒显著增加脑缺血损伤小鼠的内皮祖细胞形成小管的数量和长度（P<0.05）。
神经营养因子是一组对神经系统的发育、生长、存活和分化至关重要的蛋白质[19]。脑源性神经营养因子（BDNF）是神经系统中含量最丰富、分布最广的神经营养因子。血管内皮细胞合成并分泌BDNF，并通过刺激其原肌球蛋白受体激酶B促进神经系统中的细胞分化、细胞生长、突触形成和神经发生[20-21]。重要的是，BDNF在缺血性和创伤性脑损伤后表现出许多神经保护特性[22]。BDNF通过促进新生血管、调节内皮一氧化氮生成和抑制凋亡来改善内皮细胞功能障碍[23]。
第三部分实验深入探讨了参麻颈复方颗粒保护小鼠脑缺血损伤的作用，结果显示，小鼠脑缺血后，大脑受到损伤，内皮祖细胞中BDNF蛋白表达显著降低，内皮祖细胞功能受损；参麻颈复方颗粒干预后，BDNF蛋白表达水平显著增加（P<0.01），细胞功能得以改善。这与二甲双胍上调人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中BDNF的表达逆转高糖状态下的细胞损伤相同[23]。由于BDNF蛋白表达的增加，脑缺血小鼠的神经功能得到改善，脑梗死体积减小。
综上所述，参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤有保护作用，这一作用可能与促进内皮祖细胞中脑源性神经因子BDNF蛋白表达，改善内皮祖细胞功能有关。我们这一研究为参麻颈复方颗粒在心血管疾病的治疗提供了新视角，并进一步验证了在心脑血管疾病治疗领域的应用，这可能减缓疾病的进展和改善预后。
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表 1 PCR引物序列
基因 引物序列（5′→3′） NLRP3 F: AGAAGAGACCACGGCAGAAG R: CCTTGGACCAGGTTCAGTGT ASC F: TGGATGCTCTGTACGGGAAG R: CCAGGCTGGTGTGAAACTGAA caspase-1 F: CTTGGAAATAGCTCCCAGAA R: CATTTGGGAACTTCTCATCC TNF-α F: CCAATGGCAGAGTGGGTATG R: TGAAGAGGACCTGGGAGTAG iNOS F: GGGAATCTTGGAGCGAGTTG R: GTGAGGGCTTGGCTGAGTGA CD206 F: CAGGTGTGGGCTCAGGTAGT R: TGGTGAGCTGAAAGGTGA Arg-1 F: TTGCTGTGCTCCATAGTTTCCA R: CCATGCAAGTTTCCACTTGT GAPDH F: GGAGAAACCTGCCAAGTATG R: TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG 
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