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血管内皮细胞是沿血管腔表面排列的单层内皮细胞，将血管腔与血管平滑肌及组织分隔开，在维持血管稳态中具有重要的作用。心血管系统中复杂应激环境引起的内皮细胞整合应激反应（ISR）、炎症反应所造成的内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的病因[1-2]。与肌组织细胞线粒体相比，内皮细胞线粒体的首要功能是参与信号转导维持细胞功能的完整，其次是进行能量代谢[3-4]。线粒体氧化应激是内皮细胞线粒体损伤的重要原因，而内皮细胞线粒体损伤引起细胞内信号转导异常和代谢紊乱，导致细胞的严重损伤[5]。本文重点阐述动脉粥样硬化病理进程中线粒体氧化应激引起内皮细胞损伤的作用及其机制。
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内皮细胞有提供血液与组织间屏障和调节血管张力、血流动力学、炎症反应的功能，同时具有合成并释放血管调节因子的内分泌功能，参与维持血管结构和功能的完整及血管内环境的稳态[6]。血压的变化、血液剪切应力的变化、炎症反应和脂质累积等理化因素持续刺激内皮细胞时，血管内皮依赖性血管舒张反应受损、血管内皮完整性和通透性变化等损伤导致的内皮细胞功能障碍，是动脉粥样硬化病变的重要原因[7]。内皮细胞产生的活性氧（ROS）导致的内皮细胞损伤和功能障碍，在动脉粥样硬化的整体病理进程中起重要作用。ROS激活的ISR引起促炎细胞因子表达和炎症小体激活，促进白细胞（尤其是单核细胞）粘附并迁移到血管壁中，导致的炎症反应及内皮细胞的凋亡和脱落，是动脉粥样硬化早期病程进展的关键[2,8]；ROS引起的内皮细胞通透性改变和屏障功能障碍，导致血液中活性物质侵入内皮细胞和血管平滑肌细胞中，刺激血管平滑肌细胞迁移、胶原沉积和纤维增生，这一过程是血管厚度增加和动脉粥样硬化斑块形成的原因；内皮细胞通透性改变导致的细胞中Ca2+释放，刺激血管平滑肌细胞钙化，加速动脉粥样硬化斑块形成[9]。此外，内皮细胞间紧密连接的损伤引起的动脉粥样硬化斑块破裂，导致血栓的形成、血管堵塞，在整体血管水平上表现为管腔直径、管壁厚度的改变[10]。
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氧化应激是细胞内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态。线粒体电子传递链的复合体I（NADH-CoQ还原酶）、复合体III（细胞色素c还原酶）泄漏未正确传递的电子至线粒体基质，而电子与O2反应产生超氧阴离子是线粒体ROS（mtROS）产生的主要原因[11]。超氧化物歧化酶（SOD）1型、2型和过氧化氢酶（CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）构成抗氧化酶系统，抗氧化酶系统清除ROS的过程是细胞内的主要抗氧化途径。mtROS产生与清除的动态平衡是细胞维持线粒体稳态的重要机制，这种动态平衡被打破导致的线粒体损伤称为线粒体氧化应激[12]。
生理状态下，内皮细胞的线粒体电子传递链将大部分电子传递至氧化磷酸化产生ATP，这一过程中，仅产生少量的mtROS作为信号分子调节细胞的功能[13]。但动脉粥样硬化相关病理因素通过诱导内皮细胞mtROS的大量产生，导致线粒体氧化应激（图1）。异常的血流剪切力上调血脂代谢相关前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）的表达，抑制呼吸链复合体III的亚基泛醇-细胞色素c还原酶核心蛋白1（UQCRC1）的表达，导致线粒体呼吸产生的电子不能正常传递，大量泄漏至线粒基质，诱导大量mtROS的产生[14]。胞外蛋白因子通过激活内皮细胞膜上的骨形态发生蛋白4（BMP4）和Toll样受体4（TLR4）增加mtROS的产生[15]。动脉粥样硬化的重要病因之一是脂质代谢异常，而大量脂质聚集在内皮细胞时，线粒体内膜中铁转运蛋白2（Mfrn2）的表达增加，Mfrn2将胞质中Fe2+转运至线粒体参与Fenton反应，增加mtROS的产生[16]；同时，脂质中的低密度脂蛋白（LDL）被mtROS氧化修饰形成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）并进一步累积在内皮细胞导致大量mtROS的产生，形成的恶性循环导致线粒体氧化应激[17]。
图 1 内皮细胞调控线粒体氧化应激的通路示意图
内皮细胞内的一些分子信号通路，通过直接减少mtROS的产生或者上调抗氧化酶活性间接减少mtROS，防止线粒体氧化应激，维持细胞稳态（如图1）。研究发现，甲硫氨酸被氧化时，甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）的激活，通过增加核因子E2相关因子2（Nrf2）的磷酸化，抑制Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）的表达，上调CAT、SOD2的活性[18]。而大量脂质聚集在内皮细胞时，内皮细胞部分稳态调控机制激活，其中环状RNA（circRNA）通过调节microRNA（miRNA）与mRNA相应位点的结合，实现对氧化和抗氧化相关蛋白质的调控，达到抑制mtROS产生的作用，是新的研究热点。内皮细胞的circNOL12通过竞争性抑制miR-6873-3p，上调成纤维生长因子受体底物2（FRS2）的表达，抑制mtROS的产生[19]；内皮细胞的circDIP2C通过竞争性抑制miR-556-5p，上调甲基胞嘧啶双加氧酶2（TET2）的表达，抑制mtROS的产生[20]；内皮细胞的circ0003204通过竞争性抑制miR-942-5p，下调诱导mtROS产生的组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）的表达[21]；内皮细胞的circBPTF通过竞争性抑制miR-384，上调保守RNA结合蛋白LIN-28同源物B（Lin28B）的表达，抑制mtROS的产生[22]。由此可见，内皮细胞受病理因素刺激时，通过复杂的信号调节网络维持mtROS产生与清除的动态平衡，防止mtROS的过量产生，达到调控线粒体氧化应激的目的。
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研究表明，内皮细胞的线粒体氧化应激直接引起线粒体结构和功能的严重损伤，进而导致细胞的损伤甚至死亡；而线粒体氧化应激中释放到胞浆的ROS通过诱导能量代谢异常、线粒体自噬、炎症反应、细胞凋亡、一氧化氮减少和细胞间紧密连接的损伤，形成复杂的作用网络（图2），导致内皮细胞功能的损伤，同时增加内皮细胞的代谢需求，导致线粒体损伤的持续积累。
图 2 mtROS损伤内皮细胞机制的总体图
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线粒体中的生物大分子容易受到mtROS的氧化损伤。线粒体磷脂膜被mtROS氧化时，流动性降低及通透性增加，导致线粒体膜电位丧失，线粒体失去完整性，mtROS及其他内容物释放到胞质中[23]；线粒体呼吸链中的蛋白质组分被ROS氧化时，导致氧化磷酸化减少，引起线粒体的功能障碍[24]；ROS引起缺少组蛋白保护的线粒体DNA（mtDNA）链断裂和突变的增加，减少线粒体功能性蛋白质的表达及线粒体相关的分子信号的变化，导致线粒体功能障碍[25]。研究还发现，mtROS能上调调节线粒体相关内质网膜形成的锚定蛋白磷酸尿苷酸性簇分类蛋白2（PACS2）的表达，通过增加线粒体与内质网的接触引起内质网内Ca2+持续性向线粒体的转运，导致线粒体渗透性转换孔（mPTP）开放、线粒体膜电位的下降，线粒体失去结构完整性[26]。有研究发现，mtROS能上调参与线粒体分裂的动力相关蛋白-1（Drp-1）的表达，导致线粒体由细长杆形、高度互通的网状结构变成小尺寸椭圆形，嵴变得不明显，线粒体整体结构受到破坏[27]。
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能量代谢将化合物中的能量转移至ATP，为内皮细胞的生理活动提供能量储备。内皮细胞ATP的80%~85 %来自糖酵解，15%~20 %来自线粒体氧化磷酸化。mtROS通过直接损伤参与能量代谢的生物大分子抑制细胞能量代谢，而且还通过一系列反应间接调控代谢的进行。研究发现，内皮细胞内活化的沉默信息调节因子2相关酶家族（SIRT）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）非依赖性脱乙酰酶，通过上调转录因子表达和酶脱乙酰化，在细胞能量代谢中发挥关键作用[28]。SIRT3参与了线粒体ATP的生成、电子传递、调节线粒体呼吸链和去乙酰化激活SOD2等线粒体的大多数生物过程。同时有研究表明，SIRT3通过调节磷酸果糖激酶（PFK）的表达和活性，在内皮细胞糖酵解中发挥重要作用[29]，而过度产生的mtROS会降低SIRT3的表达和活性，抑制细胞的能量代谢[30]。SIRT1通过正向调节过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）的表达和活性，维持线粒体膜电位、线粒体动力学和氧化磷酸化的稳定，而过度产生的mtROS通过影响SIRT1/PGC-1α信号通路，抑制线粒体能量代谢[31]。内皮细胞能量代谢受抑制时，ATP生成减少导致内皮细胞生理活动的减少，引起内皮细胞的严重损伤和功能障碍。
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自噬是细胞内通过溶酶体降解受损细胞器的过程。线粒体氧化应激能够通过内皮细胞的相关信号通路，启动和调节细胞内的线粒体自噬，清除受损线粒体，维持细胞稳态。研究表明，mtROS降低线粒体膜电位，导致PTEN诱导激酶1（PINK1）无法进入线粒体内膜与目标蛋白结合，而线粒体外膜稳定存在的PINK1通过多种调节途径引起线粒体自噬：激活并促进Tax1结合蛋白1（TAX1BP1）与细胞内自噬相关因子微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ型（LC-3Ⅱ）的结合，诱导自噬小体定向吞噬线粒体[32]；磷酸化激活E3泛素连接酶parkin（也称为p62），诱导自噬小体膜与线粒体膜的结合[33]。PINK1受mtROS影响大量存在于线粒体外膜时，生理调节途径异常活化，导致线粒体自噬的过度激活，不止受损线粒体，功能正常的线粒体同样被自噬清除，同时激活自噬相关途径的细胞死亡，引发内皮细胞的严重损伤和功能障碍[32-34]。另有研究表明，mtROS通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）轴，激活Beclin 1介导的内皮细胞线粒体自噬。在这一过程中，敲除细胞内凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1），会抑制细胞内的线粒体自噬，提示LOX-1有促进线粒体自噬的作用[35]。
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细胞凋亡又称程序性死亡，是基因控制的细胞自主有序的死亡方式。炎症反应是血管系统应对损伤因子刺激时引起的以防御为主的反应，是损伤修复的过程。动脉粥样硬化病理过程中，内皮细胞是炎症反应发生时最先受损的部位，而且研究发现内皮细胞线粒体氧化应激同时导致炎症反应和细胞凋亡[25]。受mtROS激活的DNA损伤反应调节因子1（REDD1）作为炎症始动因子，激活下游硫氧还原蛋白相互作用蛋白（TXNIP），TXNIP是一种ROS敏感蛋白质，可以直接与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体结合并促进其活化[36]，受mtROS激活的ISR信号也参与NLRP3的激活[2]；NLRP3通过募集并激活凋亡因子caspase和促炎细胞因子IL-1β、IL-18等，诱导细胞炎症反应和凋亡，同时抑制SOD2的活性，导致严重的细胞损伤[37-38]。mtROS引起mtDNA泄露到胞浆，激活细胞内识别未甲基化CpG二核苷酸的toll样受体9（TLR-9），TLR-9诱导核转录因子Kappa-B（NF-κB）的激活和核转移，导致炎症反应的发生[39]；mtROS激活线粒体内膜的单胺氧化酶A型（MAO-A），MAO-A催化5-HT降解的过程，也参与TLR-9的激活[40]。mtROS导致内质网内Ca2+泄露到胞浆并激活钙蛋白酶1（calpain-1），calpain-1诱导细胞色素c从线粒体释放到胞浆，进入胞浆的细胞色素c激活caspase-3，同时促进促凋亡蛋白Bax的激活及移位到线粒体，导致细胞凋亡的发生[41]；mtROS激活的p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）也参与Bax、caspase-3的激活[40]。研究发现，mtROS还通过直接诱导线粒体内细胞色素c、凋亡诱导因子（AIF）向胞浆释放，引发炎症反应，同时激活线粒体途径凋亡因子caspase-9，导致细胞凋亡[42-43]。炎症反应引起内皮细胞的凋亡，从整个血管内皮结构上脱落，导致内皮细胞屏障功能和调节功能的失效异常。
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内皮细胞合成和释放的一氧化氮（NO）是血管内皮依赖性舒张功能的主要调节因子。此外，NO还具有抑制血小板聚集和粘附、预防血栓形成、调节血管平滑肌细胞增殖的功能[44]。内皮细胞中NO的合成依赖于偶联形式的内皮型一氧化氮合酶（eNOS），mtROS能显著降低eNOS表达和磷酸化，减少NO的生成[45]。此外，mtROS能够与NO迅速反应生成过氧亚硝基阴离子（ONOO-）消耗已生成的NO，而且这一反应通过竞争性抑制SOD2与mtROS的反应过程拮抗SOD2的活性，导致mtROS的清除减少，产生恶性循环持续降低内皮细胞的NO。而ONOO-诱导作为eNOS辅助因子的四氢生物蝶呤（BH4）氧化，导致eNOS解偶联并转化为促氧化剂，反过来刺激ROS的产生，对细胞造成损伤[46]。mtROS还能通过多种通路间接影响NO的生成，激活C-Jun氨基末端激酶（JNK）/ p38 MAPK通路的磷酸化，抑制eNOS表达与活性[47]；降低非对称性二甲基精氨酸（ADMA）的表达，增加下游二甲基精氨酸二甲胺水解酶Ⅱ（DDAH Ⅱ）的表达和活性，抑制eNOS磷酸化[48]；抑制烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）活性，抑制eNOS的磷酸化[49]。NO浓度降低，引起的血管内皮舒张功能障碍，加重血液剪切应力引起的内皮细胞结构和功能的损伤；还加速血小板的聚集和血管平滑肌细胞的增殖，促进了动脉粥样硬化斑块的形成。
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mtROS导致细胞间紧密连接异常是血管内皮屏障功能障碍的主要原因之一。研究发现，mtROS激活的NF-κB诱导炎症反应的同时，还诱导基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达，mtROS经细胞色素c途径激活的caspase也能诱导MMP9的表达，而MMP9切割VE-钙粘蛋白（VE-cadherin），破坏细胞间紧密连接[50]。还有研究发现，mtROS促进Nrf2从细胞质移位到细胞核，上调血红素加氧酶1（HO-1）的表达，HO-1能上调抗氧化酶活性，同时还通过诱导血管内皮生长因子A（VEGF-A，也称为血管通透性因子）的分泌，引起细胞膜上VE-cadherin /VEGF Receptor 2复合物的解离，导致细胞间紧密连接的不连续[51]。内皮细胞间紧密连接的损伤，在动脉粥样硬化早期导致血液中物质侵入血管平滑肌细胞，引发炎症和组织钙化；在斑块形成之后，内皮细胞间紧密连接的损伤导致斑块的不稳定和破裂，导致血栓的形成。
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综上所述，线粒体氧化应激作为初始损伤因素，通过多种机制的共同作用诱导炎症反应、细胞凋亡、过度自噬等损伤事件，导致血管内皮功能障碍。对这一病理过程所涉及损伤事件的深入研究，越来越多的线粒体氧化应激诱导内皮细胞损伤的相关分子信号通路和内皮细胞对线粒体氧化应激的调控机制被阐明，有助于增加对线粒体氧化应激损伤内皮细胞机制的认识和理解动脉粥样硬化发病过程，并为从初始损伤因素缓解动脉粥样硬化病理进程提供有益的参考。但是深入研究线粒体氧化应激损伤内皮细胞机制的同时，针对线粒体的抗氧化研究则略显不足，目前临床使用的通过抗氧化作用改善内皮细胞氧自由基产生的药物有普罗布考和维生素，为数不多。仍需进一步研究通过抑制ROS大量产生或者激活细胞内固有抗氧化系统进而缓解线粒体氧化应激、并维持内皮细胞结构和功能完整性的治疗策略，将线粒体氧化应激作为临床治疗动脉粥样硬化的重要靶点，减少内皮细胞的初始损失并降低动脉粥样硬化患者的发病率。
Mitochondrial oxidative stress in vascular endothelial cell and atherosclerosis
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摘要: 血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化病理过程的起始环节。线粒体氧化应激与血管内皮细胞功能密切相关，线粒体氧化应激通过诱导线粒体自噬、一氧化氮生成减少、炎症反应、细胞代谢失衡和凋亡，导致血管内皮细胞的功能障碍。同时，血管内皮细胞也通过调控线粒体氧化应激维持自身稳态。本文旨在综述动脉粥样硬化病理过程中线粒体氧化应激诱发血管内皮细胞损伤的主要分子信号通路，为后续研究两者间的分子机制提供参考。Abstract: The injury of vascular endothelial cell function is the beginning of the pathological process of atherosclerosis. Mitochondrial oxidative stress is closely related to vascular endothelial cell function, which causes the dysfunction of vascular endothelial cell by inducing mitophagy, reducing nitric oxide production, inflammation, cellular metabolic imbalance and apoptosis. Meanwhile, vascular endothelial cell could also maintain their homeostasis by regulating mitochondrial oxidative stress. The molecular signaling pathways of the vascular endothelial cell injury caused by mitochondrial oxidative stress in the pathological process of atherosclerosis were outlined in this review, which provided reference for further research on the molecular mechanism between mitochondrial oxidative stress and endothelial damage.
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松科(Pinaceae)植物马尾松(Pinusmassoniana Lamb.)主要产于江苏、安徽、河南、陕西及长江中下游各省区，资源丰富[1]。松叶“味苦，温；暖，无毒”，具有祛风燥湿、杀虫、止痒之功用。水煎、浸酒以外用或内服[2]用于治风湿痿痹、跌打损伤、湿疮、疥癣、慢性气管炎等症以及预防感冒、流脑。文献报道马尾松叶中的主要化学成分为挥发油、黄酮、多糖、木脂素和树脂等，现代药理研究表明马尾松叶提取物具有抗氧化、抗衰老、抑菌等多方面活性[3-15]。
近年来由于抗生素的滥用、器官移植、免疫抑制剂以及HIV患者的增多，深部真菌感染发病率逐年上升，其中白念珠菌是最主要的致病菌。氮唑类药物氟康唑是临床上首选的抗白念珠菌(Candida albicans)感染药物。但是长期和重复给药导致白念珠菌对氟康唑耐药越来越强。目前联合用药是恢复耐药真菌对治疗药物的敏感度，提高耐药菌对氟康唑的敏感性，治疗深部耐药菌感染的一种有效的治疗途径。从天然活性成分中寻找与现有的抗真菌药物联合发挥协同作用的小分子化合物是近年来的研究方向之一[16-20]。本文选用接近“传统水煎或浸酒法”的传统中药提取方法，用乙醇加热提取后，石油醚再萃取的方法得到马尾松叶低极性部位，通过测定马尾松叶低极性部位协同氟康唑抗耐药白念珠菌的MIC80值，同时，采用气相色谱-质谱的方法对低极性部位的化学成分进行分析鉴定，初步探究其联合氟康唑的体外抗真菌活性。
1. 材料
1.1 试剂与设备
Thermo Trace GC Ultra气相色谱、Thermo DSQ Ⅱ质谱、Xcalibur工作站(美国赛默飞世尔公司）；马尾松叶(浙江东阳市，经海军军医大学黄宝康教授鉴定为马尾松Pinusmassoniana Lamb.)；所有试剂均为分析纯；水为重蒸水；载气为高纯氦气。
氟康唑注射液（上海信谊金朱药业有限公司）；黄芩素（上海历鼎生物技术有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，中国医药集团上海化学试剂公司）；白念珠菌103（Candida albicans103，海军军医大学长海医院真菌室提供）。
1.2 马尾松叶低极性部位的制备
取干燥马尾松叶，粉碎，称取二份，每份50.0 g，分别用150 ml石油醚和80%乙醇加热回流提取1h，滤过；滤渣再分别用150 ml石油醚和80%乙醇加热回流提取1 h，滤过。分别合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得石油醚提取物（简称醚提取物）2.5 g和80%乙醇提取物（简称醇提取物）8.0 g。取干燥后的醇提取物5.0 g，加入水100 ml混溶，获得混悬液。混悬液用50 ml石油醚萃取3次，合并浓缩石油醚萃取液，获得石油醚浸膏（简称醚浸膏）即马尾松叶低极性部位0.8 g。取125 mg醚浸膏，置于100 ml量瓶中，加入80%甲醇，超声、加热使其几近完全溶解，放置、冷却；再加入80%甲醇定容，摇匀、放置；吸取1 ml定容后的浸膏液，微孔滤膜过滤后待测。
1.3 色谱-质谱条件
色谱柱TR - 35MS石英毛细管（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升温，起始温度40 ℃，保持2 min后以10 ℃/min的速度升至300 ℃并保持5 min；汽化温度250 ℃，进样量1 μl；分流比10∶1。载气为高纯氦气，流速1.0 ml/min。离子源：EI源；离子源温度为250 ℃；电子能量：70 eV；扫描范围：50～650 m/z。
2. 方法
2.1 抑菌实验方法
菌株选用临床分离耐药菌株白念珠菌103（氟康唑的MIC80>128.0 μg/ml）。采用美国临床和实验室标准协会（CLSI）提出的RPMI1640 培养基微量稀释法，取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640液体培养基100 μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100 μl，菌液浓度范围为（1～5）×103cfu/ml；2号孔分别加菌液160 μl和受试药物溶液40 μl；12号孔不含药物，只加菌液100 μl作阳性生长对照。2～11号孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物（醚提取物、醇提取物和醚浸膏）浓度分别为250.0、125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98和0.49 μg/ml，对照品黄芩素浓度分别为128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1%，氟康唑溶液的终浓度为8.0 μg/ml。96孔板于30℃恒温培养箱培养24 h后取出，读取受试药物与氟康唑（8.0 μg/ml）联用时的MIC80值。微量稀释法测试结果见表1。
表 1 马尾松叶3种提取物与氟康唑联用对体外白念珠菌103活性(MIC80)试验结果化合物 MIC80 联合抑菌浓度
分数指数
（FICI）联合作用 单用(μg/ml) 与氟康唑联用(μg/ml)* 醚提取物 >250.0 >250.0 1.031 无关 醇提取物 >250.0 7.81 0.047 协同 醚浸膏 >250.0 31.25 0.094 协同 黄芩素 16.0 4.0 0.281 协同 氟康唑 >128.0 − − − *与8 μg/ml 氟康唑联合使用 协同药效的判定采用联合抑菌浓度分数指数（FICI），即联用抑菌时每种药物所需最低抑菌浓度（MIC）与单用这种药物抑菌时所需MIC的比值的和。当FICI≤0.5时，两种药物的相互作用效果被定义为具有协同作用；当FICI>0.5时，认为两种药物无相互作用。
2.2 色谱-质谱分析方法
按“1.3”项下实验条件对马尾松叶低极性部位进行分析，25 min得到马尾松叶低极性化学成分的总离子流图（图1）。共检测出30个峰，通过检索NIST08光谱数据库，按60%以上匹配率（SI和RSI均大于600，最大值1 000），并结合质谱裂解规律确定其化学成分。运用峰面积归一法通过Xcalibur化学工作站数据处理系统，测得各个化学成分在石油醚部位中的质量百分数。
3. 结果与分析
由表1可见，各受试药物单用时，对照品黄芩素的MIC80为16.0 μg/ml，提示了其具有一定的抗菌活性，其他的化合物的MIC80均大于250 μg/ml。各受试药物与氟康唑（8.0 μg/ml）联用后，对照品黄芩素、醇提取物及醚浸膏的MIC80降至4.0～31.25 μg/ml，相应的FICI值均小于0.5，显示黄芩素、醇提取物、醚浸膏分别与氟康唑联用对耐药白念珠菌均具有协同活性，但醇提取物和醚浸膏的协同活性不及对照品黄芩素，醚浸膏协同活性小于醇提取物。醚提取物单用及与氟康唑联用的MIC80均大于250 μg/ml，FICI大于0.5，显示其单用及与氟康唑联用均没有协同氟康唑抗耐药白念珠菌活性。
如表2所示，本次GC-MS检测出30种成分，鉴定出17个化合物。统计出本次所测马尾松叶的低极性化学成分中含有烷烃4个（6.1%），甾烷类5个（4%），脂肪酸1个（0.75%），二萜5个（53.99%），其他峰均提示为聚硅氧烷（35.16%），其中含量较高的化学成分是：玛瑙酸（8.38%，见图2）、脱氢枞酸甲酯（8.41%，见图3）。
表 2 马尾松叶低极性化学成分分析结果序号 保留时间(min) 相似度SI值 相似度RSI值 化合物 含量(%) 1 10.30 821 850 正十五烷 1.52 2 13.15 797 840 2,6,11,15-四甲基-十六烷 2.23 3 15.68 781 822 2,6,10-三甲基-十四烷 1.37 4 17.95 709 727 3-乙基-5-（2-乙基丁基）-十八烷 0.98 5 19.03 661 770 泪柏醚 0.68 6 19.96 641 684 1-单烯丙基甘油三甲基硅醚 0.75 7 20.00 639 670 3,3-亚乙基二氧基-5β-胆甾烷 1.00 8 20.78 688 700 玛瑙酸/贝壳杉萘甲酸 8.38 9 20.88 621 690 N-[24-氧代-3α-（三甲基硅氧基）-5β-胆安-24-基]甘氨酸甲酯 0.51 10 20.96 636 739 24, 25-二羟基维生素D3 / 24R, 25-二羟胆钙化醇 1.11 11 21.16 609 633 17-乙酰氧基-4,4,10,13-四甲基-7-氧代-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊烷(a)菲-3-基,乙酸 0.61 12 21.38 777 915 隐青霉酸甲酯 / 山莨菪碱酸甲酯 /海松酸甲酯 4.62 13 21.45 626 636 3-羟基-2,5,5,8a-四甲基-1,4,4a,5,6,7,8,8a-八氢萘-1-羧酸，2-三甲基硅乙基酯 31.90 14 21.79 645 662 3,11,18-三乙酰氧基-3,19:14,15-二环氧孕烷-20-酮 0.77 15 21.87 625 765 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-十六甲基八硅氧烷 1.50 16 22.09 841 889 脱氢枞酸甲酯 8.41 17 22.29 676 788 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13-十四甲基七硅氧烷 1.30 4. 讨论
近年来研究发现马尾松叶提取物具有抗真菌活性：马尾松叶石油醚、氯仿等溶剂的提取物以及不同比例的乙醇水提取物可以抑制曲霉、青霉、啤酒酵母的生长；马尾松叶乙醇提取物对枯萎病、灰霉菌有显著的抑菌活性；马尾松叶水提物对白色念珠菌有较弱抑菌性[21-25]。但马尾松叶提取物对氟康唑耐药白念珠菌的协同抗菌活性未见报道。
本研究发现，马尾松叶的醇提取物和醚浸膏单独使用时均不及黄芩素，没有抗耐药白念珠菌活性，但联用氟康唑（8 μg/ml）后，醇提取物和醚浸膏均表现出协同活性，醇提取物的活性更好，而醚提取物无论是单独使用还是联用氟康唑都没有抗耐药白念珠菌活性。醚浸膏与醚提取物相比，提取方法的改变，导致了提取物抑菌效果的有无。醚浸膏的活性应该源于乙醇加热提取获得的更丰富、含量更高的化学成分，尽管醚浸膏的主要成分也是低极性成分，但与醚提取物相比无论在含量和组成上均应不同。醚提取物含有更丰富的挥发油等低极性成分，但是可能缺少了一些重要的活性抗真菌成分，导致其没有协同抗耐药真菌作用。我们进一步对活性部位醚浸膏进行了GC-MS化学成分分析，结果表明，其化学成分与文献报道的采用水蒸气和超临界CO2提取法获得的马尾松叶挥发油成分相比差异大。活性部位醚浸膏中化合物结构类型和数量比文献报道的直接提取的挥发油少，且没有以蒎烯、莰烯为主的单萜和以石竹烯等为主的倍半萜，仅有烷烃类少量化合物重合[26-31]。活性部位醚浸膏采用了乙醇加热提取后，再经石油醚萃取得到，加热提取可能导致了蒎烯、莰烯、石竹烯等低沸点萜类化合物的丢失，但分子量更大的二萜类化学成分含量升高（53.99%）。二萜类化学成分中脱氢枞酸甲酯、海松酸甲酯是主要化学成分，两者也是松香酸的主要成分。有文献报道松香酸具有抗赤霉菌、灰霉菌等多种抗真菌活性[32-35]。因此，醚浸膏中的二萜类化合物可能是其协同氟康唑抗耐药白念珠菌作用的重要活性成分，值得进一步研究。此外，Zuzana研究发现云杉提取物中的β-谷甾醇抑制微生物生长，同时低浓度的脱氢枞酸甲酯破坏细胞壁，两者相互协同可能是云杉提取物对青霉菌、链格孢菌、米根霉的抑菌活性的关键[36]。本研究获得的醚浸膏中也含有丰富的树脂酸（13.03%）和甾烷（4%）。树脂酸和甾烷的协同可能也是醚浸膏具有协同氟康唑抗耐药白念珠菌活性的原因，这一点也值得进一步研究。
综上所述，本文首次报道了马尾松叶乙醇提取物以及马尾松叶低极性部位具有协同氟康唑抗耐药白念珠菌作用，并首次对马尾松叶低极性部位进行了GC-MS分析，鉴别的化合物除了烷烃、脂肪酸、脱氢枞酸甲酯外其它11种成分都是首次从该植物中发现，丰富了马尾松叶的化学成分。
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