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目前腹腔镜已经在外科手术中广泛应用，腹腔镜胆囊切除术（LC）是胆道外科中常用的术式，能够根治胆囊结石、胆囊炎等相关疾病，具有创伤较小，术后恢复较快等优势[1-2]。但在手术过程中，气管插管、拔管以及二氧化碳气腹等操作，会使患者有较强的应激反应，导致患者血流波动较大，术后对患者的认知功能及睡眠质量也会造成一定的影响[3]。有研究表明[4]，手术患者术后易出现睡眠剥夺，主要为快速眼动睡眠减少，会导致患者心脑血管及神经内分泌疾病的发生，增加了手术期的死亡风险。因此为患者选择合理的麻醉方案和麻醉药物对患者术后预后具有重要的作用。临床中常用的麻醉药物为丙泊酚、依托咪酯、咪达唑仑等，其中咪达唑仑起效温和，对患者的呼吸功能和心血管功能的抑制性较小，但是起效慢且药物消除半衰期长，残留药理活性会延长患者的麻醉苏醒期，对患者的认知功能也有一定的影响[5-6]。而丙泊酚具有诱导平稳且起效快的特点[7-8]，有研究证明，两种药物联合作用，可以减少药物各自的使用剂量，扬长避短，同时增加患者的依从性[9]。但是对于其他方面的研究较少。因此，本文旨在探讨咪达唑仑联合丙泊酚对腹腔镜胆囊切除术患者术后认知功能，应激反应及睡眠质量的影响。
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将2019年4月至2021年1月期间在我院诊治且行腹腔镜胆囊切除术的162例患者作为本次研究的对象，根据手术中麻醉方式的不同将162例患者分为对照组（81例）和观察组（81例）。其中对照组男49例，女32例，年龄46～65岁，平均年龄（55.86±3.77）岁；疾病类型：胆囊结石27例，胆囊息肉25例，胆囊炎29例。观察组男40例，女41例，年龄41～69岁，平均年龄（56.68±5.83）岁；疾病类型：胆囊结石25例，胆囊息肉26例，胆囊炎30例。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
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（1）符合腹腔镜胆囊切除术手术指征；（2）患者精神状况良好；（3）无凝血功能障碍；（4）患者及家属对本次研究知情（告知患者所用的麻醉方法）且签订知情同意书。
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（1）对本次研究中的药物过敏者；（2）合并免疫性功能障碍；（3）既往有手术史；（4）合并肝肾等多器官功能障碍者；（5）妊娠或者哺乳期患者；（6）神经精神类疾病患者。
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进入手术室后对两组患者的血压、心电图、血氧饱和度等持续监测。术前两组患者肌肉注射阿托品0.01 mg/kg（江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：190125BP，规格：1 ml∶0.5 mg），开放静脉通道后，给予患者滴注复方氯化钠（河北天致药业有限公司，批号：19001201，规格：500 ml∶氯化钠4.25 g、氯化钾0.15 g、氯化钙0.165 g）。随后进行麻醉诱导，取舒芬太尼0.3 μg/kg（宜昌人福药业有限责任公司，批号：91A10421，规格：1 ml∶75 μg）、维库溴铵0.1 mg/kg（扬子江药业集团有限公司生产，批号：20190323）。对照组采用咪达唑仑麻醉，患者静脉输注咪达唑仑0.25 mg/kg（江苏恩华药业有限公司，批号：20190110，规格：2 ml∶10 mg）。观察组采用咪达唑仑联合丙泊酚麻醉，患者静脉注射丙泊酚1.5 mg/kg（江苏恩华药业有限公司，批号：201901005，规格：20 ml∶0.2 g），静脉输注咪达唑仑0.05 mg/kg。围术期根据患者的HR、MAP调整输注的速率，同时所有患者均给予浓度为1%~2%的七氟烷（上海恒瑞医药有限公司，批号：20180825，规格：250 ml）持续低流量吸入，根据患者的应激反应等，观察组给予咪达唑仑、丙泊酚进行麻醉维持，对照组给与予咪达唑仑进行麻醉维持，控制两组患者手术所需的麻醉深度。胆囊切除后，静脉给予托烷司琼5 mg（广州白云山天心制药股份有限公司，批号：20181207），采用1%罗哌卡因10 ml（广州嘉博制药股份有限公司，批号：国药准字20190206）浸润切口进行术后镇痛。手术结束立刻停止麻醉。
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两组患者在术前及术后抽取外周静脉血2 ml，待离心后取血清，检测血浆皮质醇（Cor）和去甲肾上腺素（NE）水平，进行对比。
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采用蒙特利尔认知评估量表（MoCA）[1]对两组患者手术前后的认知能力进行评估，主要包括定向力、注意力、短期回顾和复制图形的能力等，总分30分。分数越高，表明患者的认知功能越好；分值越低，说明患者的认知功能越低。
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采用多导睡眠检测系统对两组患者手术前后的夜间（当日21:00至次日06:00）睡眠质量进行监测，包括快速动眼（REM）睡眠和主观睡眠质量。
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对两组患者的睁眼时间、拔管时间以及定向力恢复时间进行对比。
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对两组患者的不良发应发生情况进行对比，包括低血压、恶心呕吐、疼痛等。不良反应发生率=发生不良反应的例数/总例数×100%。
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使用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，满足正态分布且方差齐的计量资料（应激指标）采用（
$ \bar{{x}} $ ±s）表示。采用两样本独立t检验比较组间差异，计数资料用率表示。采用x2检验，P<0.05说明差异具有统计学意义。 -
手术前两组患者的Cor和NE水平相比，差异无统计学意义（P>0.05）；手术后两组患者的Cor和NE水平较手术前均明显升高，观察组低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。
表 1 两组患者应激指标对比（
$ \bar x $ ±s）组别 例数 Cor（μg/L） NE（μg/L） 手术前 手术后 手术前 手术后 对照组 81 229.47±29.41 356.99±47.49* 0.31±0.06 0.47±0.08* 观察组 81 230.02±27.29 292.48±37.19*# 0.30±0.05 0.40±0.05*# t 0.12 9.63 1.15 6.68 P 0.90 <0.01 0.25 <0.01 注：* P<0.05，与手术前相比；# P<0.05，与对照组相比 -
手术前，两组患者的MMSE评分相比，差异无统计学意义（P>0.05）；手术后24 h/48 h两组患者的MMSE评分较手术前均明显降低，观察组高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。
表 2 两组患者MMSE评分对比（
$\bar x $ ±s，分）组别 例数 T0 T1 T2 对照组 81 29.00±0.77 20.48±1.25 24.74±1.14 观察组 81 29.12±0.66 23.65±1.42# 26.73±1.52# t 1.06 15.08 9.43 P 0.29 <0.01 <0.01 注：# P <0.05，与对照组相比 -
T0时两组患者REM和主观睡眠质量相比，差异无统计学意义（P>0.05）；T3、T4时两组患者的REM和主观睡眠质量较术前相比均明显降低，观察组下降幅度低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。
表 3 两组患者睡眠质量对比（
$\bar x $ ±s）组别 例数 REM（%） 主观睡眠质量（分） T0 T3 T4 T0 T3 T4 对照组 81 22.10±2.41 13.65±2.76* 16.17±1.84* 8.52±1.21 3.91±1.14* 6.01±1.53* 观察组 81 22.20±2.70 16.94±2.12*# 16.95±1.83*# 8.63±1.41 6.31±1.45*# 7.04±1.13*# t 0.25 8.51 2.71 0.53 11.71 4.87 P 0.80 <0.01 0.01 0.59 <0.01 <0.01 注：* P<0.05，与T0相比；# P<0.05，与对照组相比 -
观察组患者在围术期，睁眼时间、拔管时间以及定向力恢复时间均明显低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表4。
表 4 两组患者围术期情况对比（
$\bar x $ ±s，h）组别 例数 睁眼时间 拔管时间 定向力恢复时间 对照组 81 7.04±2.72 7.70±3.11 29.20±2.51 观察组 81 6.14±2.07# 6.81±2.08# 25.83±1.30# t 2.37 2.14 10.73 P 0.02 0.03 <0.01 注：# P<0.05，与对照组相比 -
观察组的不良反应发生率为9.88%，明显低于对照组不良反应发生率20.99%，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表5。
表 5 两组患者的不良反应发生情况对比（%）
组别 例数 低血压 恶心呕吐 疼痛 总发生率 对照组 81 4（4.94） 7（8.64） 6（7.41） 17（20.99） 观察组 81 1（1.23） 4（4.94） 3（3.70） 8（9.88）# x2 4.11 P 0.04 注：# P<0.05，与对照组相比 -
腹腔镜胆囊切除术已经成为治疗多种胆囊疾病的主要方式，虽然能够降低患者术后的疼痛，减少并发症的发生，但是由于腹腔镜手术的复杂性以及手术过程中插管、拔管等操作可对患者造成较强的应激反应，影响围术期患者血流动力学平衡，对术后康复造成不利的影响[14-15]。其原因为创伤区域会释放前列腺素、缓激肽等各种炎症介质，从而激活人体的代谢途径、细胞因子系统等，引起机体出现应激反应[16]。此外，认知功能障碍也是部分患者术后常见的一种并发症，相关研究表明[17-18]，全身麻醉药物在中枢神经中的作用可能会导致患者出现认识功能障碍。因此对麻醉医生的技术水平提出了更高的要求，在确保手术能够顺利进行的前提下，应尽可能地减轻该手术对患者的刺激。腹腔镜胆囊切除术中常会选择咪达唑仑或者丙泊酚实施麻醉，但是二者联合使用对患者的影响报道不多[12]。鉴于此，本研究通过设置对照组，探讨咪达唑仑联合丙泊酚对腹腔镜胆囊切除术患者的影响。
应激反应是机体在受到刺激的条件下所表现出来的一种全身的非特异性适应反应，王卫萍等[19]研究表明，腹腔镜胆囊切除术能够引起患者不同程度的应激反应，从而导致患者机体内释放大量血浆Cor，同时在应急刺激下机体会产生多种神经内分泌反应，释放大量的儿茶酚胺，引起NE浓度的增加。本次研究结果显示，手术后两组患者的Cor和NE水平较手术前均明显升高，观察组低于对照组，说明手术中实施咪达唑仑联合丙泊酚麻醉较单一的咪达唑仑麻醉对患者机体的应激反应小，能够加快患者术后恢复。术后患者出现认知功能障碍是手术和麻醉后所引起的中枢神经系统的并发症。本研究结果显示，手术后24 h/48 h两组患者的MMSE评分水平较手术前均明显降低，观察组高于对照组。分析原因可能为观察组患者由于联合使用咪达唑仑和丙泊酚麻醉，二者使用剂量较对照组小，因此患者的认知功能恢复得较快，与唐毅等[12]的研究结果相符。曹晶等[13]研究表明，该手术会影响患者的睡眠质量，本研究结果显示，术后1 d和术后2 d，观察组的REM和主观睡眠质量高于对照组，说明采用咪达唑仑联合丙泊酚麻醉对患者的睡眠质量影响较小。进一步研究发现，围术期观察组患者的睁眼时间、拔管时间、定向力恢复时间以及术后不良反应均明显低于对照组，与李雪等[20]研究结果相符。说明两种麻醉药物联合使用，能够减少咪达唑仑和丙泊酚药物的剂量和不良反应，对患者的术后恢复情况、生活质量影响较小。
综上所述，在腹腔镜胆囊切除术中使用咪达唑仑联合丙泊酚麻醉对患者造成应激反应以及对患者的认知功能和睡眠质量的影响均较小，能够使患者尽快恢复，值得推广。
Effects of midazolam combined with propofol on recovery of patients with laparoscopic cholecystectomy
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摘要:
目的 探究咪达唑仑联合丙泊酚对腹腔镜胆囊切除术后患者恢复的影响。 方法 选择2019年4月至2021年1月期间入院行腹腔镜胆囊切除术的患者162例，根据不同麻醉方式的将其分为对照组（实施咪达唑仑麻醉）和观察组（实施咪达唑仑联合丙泊酚麻醉），各81例。对比两组手术前后应激指标水平，术前（T0）、术后24 h（T1）及48 h（T2）的MoCA评分，T0、术后第1天（T3）、2天（T4）的术后相关恢复情况。 结果 观察组患者的术后Cor、NE水平及睁眼、拔管、定向力恢复时间、不良反应发生率均低于对照组（ P<0.05）；T1、T2时观察组的MMSE评分、T3、T4时的睡眠质量评分均高于对照组（P<0.05）。 结论 咪达唑仑联合丙泊酚用于腹腔镜胆囊切除术安全性高，患者术后恢复良好。 Abstract:Objective To explore the effect midazolam combination with propofol on postoperative recovery in patients undergoing laparoscopic cholecystectomy. Methods A total of 162 patients who were admitted to the hospital for laparoscopic cholecystectomy from April 2019 to January 2021 were selected. According to different anesthesia methods, they were divided into control group (midazolam anesthesia) and observation group (midazolam combined with propofol anesthesia), with 81 cases in each group. The stress index levels before and after operation, MoCA scores before operation (T0), 24 h after operation (T1) and 48 h after operation (T2), sleep quality at T0, the first day after operation (T3) and the second day after operation (T4), the perioperative recovery were compared between the two groups. Results The levels of Cor and NE, the recovery time of eyes opening, extubation, orientation, and the incidence of adverse reactions in the observation group were lower than those in the control group (P<0.05). Observation group MMSE score when T1, T2, T3, T4 sleep quality score were higher than control group (P<0.05). Conclusion Midazolam combined with propofol was safe and had good postoperative recovery in patients undergoing laparoscopic cholecystectomy. -
Key words:
- Midazolam /
- Propofol /
- Laparoscopic cholecystectomy /
- Stress response /
- Cognitive function /
- Sleep quality
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脑血管疾病是仅次于心脑血管疾病和癌症的第三大病症，其中脑缺血是常见的脑血管疾病之一。脑缺血的患病率和死亡率仍处于上升趋势，严重影响人们的健康。目前，西医对于脑缺血的主要治疗方式是溶栓和取栓，但有严格的溶栓时间窗和较大的取栓风险，并且缺血后造成神经功能的损伤没有有效的药物治疗[1]。中医药在脑缺血的预防和治疗中具有潜在作用，以气虚为本、血瘀为标作为主要病因[2]。查阅近几年文献发现，益气活血化瘀方药在防治脑缺血中表现出多方面和整体调节的优势。
参麻颈复方是临床名老中医经验方，临床应用发现具有活血通络，益气养血，宁神安脑，健筋壮骨之效。该方由首乌藤、丹参、山茱萸（制）、天麻、当归、川芎等组成，临床应用广泛。首乌藤有养血安神、祛风通络之效[3]，丹参有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神之效[4]，当归有补血调经、活血散寒、消肿止痛生肌、润肠通便之效[5]，川芎、陈皮的补气之效辅佐以上药物活血功效运行，而且川芎具有活血化瘀之效，是传统中医防治中风选择最多的配方之一[6]。本研究评估参麻颈复方对小鼠脑缺血损伤的改善作用，并进一步探讨其对骨髓来源内皮祖细胞干预发挥防治脑缺血损伤的机制，为中药方剂治疗脑缺血提供新的思路、寻找新的靶点。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器及试剂
细胞培养箱（Thermo公司）；倒置荧光显微镜（Leica 公司）；Odssey红外荧光显像（Li-Cor公司）；酶标仪（芬兰 Labsystens Dragon 公司）；涡旋混合器（江苏天翎仪器有限公司）；超净台（苏州净化设备有限公司）；电子天平JA2003（上海天平仪器厂）。 参麻颈复方颗粒（岳阳医院自制制剂，批准文号：沪药制字Z05050324）；尼莫地平片（天津市中央药业有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京西浓科技有限公司）；VEGF抗体（abcam公司）；BDNF抗体（abcam公司）；GAPDH内参抗体（abcam公司）；Tubulin内参抗体（abcam公司）；内皮细胞培养基（EGM-2 Single Quots，Lonza公司)；波连蛋白（vitronection，BD公司）。
1.2 实验动物及分组
实验动物为SPF级C57BL/6雄性小鼠30只（上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证：SCXK（沪）2017-0012），体重为18-20 g，6-7周龄。适应性饲养1周后，将30只小鼠随机分为模型对照组（Control组）、参麻颈组（SMJ组）、尼莫地平组（NMDP组），10只/组。实验过程中对于实验小鼠的所有处理均符合伦理学规定。
1.3 实验方法
1.3.1 制备动物模型
采用电凝法制备局灶性脑缺血模型[7]，用浓度为12%的水合氯醛对小鼠进行腹腔注射，剂量控制在350 mg/kg。小鼠麻醉后，仰卧位固定在手术台。借助显微镜，用显微镊沿颞肌纤维束的方向钝性分离肌肉，直到颧骨及麟骨暴露，显微镊夹住颧骨固定小鼠头部，用牙科钻重点打磨颧骨和麟骨的交叉部位，骨壳变薄并有裂缝时，停止打磨，用撬棒沿已暴露的动脉血管剥离骨片，直至小鼠左侧大脑中动脉与伴行的迷走神经分叉暴露；在显微镜下，找准纹状体外侧动脉近心端，用双极电凝器凝断左侧大脑中动脉后，将电凝器缓慢移出，显微镜下再次确认是否凝断。最后用显微镊将皮肤和肌肉归置原位，以便于缝合。小鼠完全苏醒后，观察精神状态，若出现站立不稳、左侧肢体偏瘫、提尾向一侧转圈等神经功能损害症状，即为造模成功。
参麻颈组在手术前通过灌胃方式给予6.88 g∙kg−1的参麻颈复颗粒；尼莫地平组给予2.16 mg/kg溶液灌胃；模型对照组给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，共14 d。
1.3.2 神经行为学功能评分
术后第3 d，由观察者在不知分组情况下记录神经行为学表现，并采用参考文献[7]评分方法，如提尾悬空试验等[8]，评估神经行为学功能评分。
提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠重复提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠测20次，并且每次测定的时间间隔不少于1 min，以保证小鼠得到充足的休息。小鼠的偏转率计算按以下公式：摆动频率（%）=（T−10）/10×100%。
T为实验小鼠头部向手术对侧偏转的次数。
平衡木试验：记录小鼠由木棍一端顺利通过平衡木80%长度所用的时间。在正式试验前对小鼠进行3次训练，正式试验时每只小鼠重复测定3次，对每只小鼠均间隔5 min后进行下一次实验。
1.3.3 脑组织TTC染色
行为学评分测完后，小鼠脱颈处死，取脑组织，放1×PBS中清洗干净，将脑组织放在脑片模具中，共切7片，每片2 mm，放2%的TTC溶液中，并在37 ℃水浴锅中染色10 min，染色结束后放4%多聚甲醛固定6 h，按照脑片大小顺序排好拍照，脑片使用Image J统计软件测定小鼠的脑梗死体积。
1.3.4 细胞功能测定
取脑组织的同时，提取小鼠骨髓来源内皮祖细胞，培养至第7d时，收集和处理细胞，对细胞黏附、迁移及形成小管能力进行测定。
细胞黏附实验：用胰酶消化细胞,按照3×105个/ml细胞接种于预先包被人纤维粘连蛋白的96孔板中，在细胞培养箱中培养5 h后弃掉未黏附细胞，再用4%多聚甲醛固定，以Hochest 33258染料染色后于倒置显微镜下拍照。
细胞迁移实验：调整细胞浓度3×105个/ml，Transwell小室置于24孔板，按分组下室加600 μl配好的下室溶液，细胞悬液接种于上室各100 μl,置培养箱内培养24 h，用PBS清洗2次，弃上清液，在2%多聚甲醛固定15 min。弃上清，PBS清洗2次，上室转移至含600 μl Hochest 33258染料的孔中，避光染色15 min。弃上清，PBS浸泡5 min,弃上清，光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组迁移细胞数。
小管形成实验：调整各组细胞至3×105个/ml，每孔100 μl的细胞悬液加到铺有基质胶的孔中，最后将96孔板移至培养箱孵育6 h，在光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组小管形成数量。
1.3.5 Western blot检测
细胞样本同“1.3.4”项中相同来源，六孔板放在冰枕上，用预冷PBS润洗细胞两次，弃上清液；向板内加入60 μl已配置好的细胞裂解液，在冰枕上裂解15 min，收集细胞液转移至1.5 ml EP管中，使用高速离心机在12 000 r/min，4 ℃离心15 min，将离心后的上清液收集到新的离心管中并放到−80 ℃冰箱保存。应用紫外分光光度计测量蛋白浓度后，进行蛋白定量，95 ℃ 5 min蛋白灭活后，−20 ℃保存待用。SDS-PAGE凝胶电泳：初始电压调为50 V，电泳至Marker中红色条带分离出，将电压调为 120 V，直至Marker显示跑到胶的底部时停止电泳。转膜：恒流200 mA转膜，不同目的蛋白按其分子量大小设置转膜时间。封闭：用5%脱脂牛奶封闭1 h。封闭之后用1%牛奶配置的一抗4 ℃孵育过夜。第2天，用1%牛奶配制的二抗室温孵育1 h，NC膜放到Odyssey扫膜仪上进行扫描，保存扫描照片，使用Quantity One软件统计蛋白的灰度值。
1.4 统计学处理
使用Graphpad prism 5.0分析数据。实验数据均以（
$ \bar x $ ±s）表示，两组之间的差异采用非配对T检验进行分析，多组数据间的差异采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05表示差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 各组小鼠神经功能学评分
小鼠造模成功后出现明显的神经功能障碍，表现为站立不稳、左前肢屈曲内收，肌张力下降。与对照组比较，尼莫地平组小鼠的神经功能有明显改（P<0.01）；与对照组比较，参麻颈组小鼠的爬杆时间（P<0.05）和对侧偏转率（P<0.01）均有显著降低，表明小鼠给予参麻颈复方后，能有效保护缺血后神经功能的缺损（图1）。
2.2 各组小鼠脑梗体积变化
用TTC染色后结果显示：对照组小鼠术后脑组织出现明显的梗死灶。与对照组比较，给参麻颈组小鼠脑缺血后脑梗体积显著减少（P<0.01）；给予尼莫地平的小鼠与参麻颈组相比，其脑梗体积虽有减少，但无统计学差异（图2）。 2.3 各组小鼠内皮祖细胞黏附功能比较
细胞黏附实验结果显示：对照组相比于另外两组，黏附细胞数目减少。预先给予参麻颈的小鼠，在发生脑缺血后，小鼠骨髓来源内皮祖细胞黏附于96孔板中细胞数目，明显高于对照组（P<0.01）；给予尼莫地平组，其细胞数目也比对照组增多（P<0.01）；而尼莫地平组和参麻颈组两组的差异无统计学意义（图3）。 2.4 各组小鼠内皮祖细胞迁移功能比较
迁移实验结果显示：与参麻颈组和尼莫地平组比较，模型对照组细胞迁移至Transwell板上室下面的数目可见减少。与对照组比较，给予参麻颈复颗粒后的脑缺血小鼠，其骨髓来源内皮祖细胞迁移数显著增加（P<0.05）；给予尼莫地平的小鼠与对照组比较，其迁移细胞数目增加（P<0.01）；参麻颈组和尼莫地平组，两组结果有差异但无统计意义（图4）。 2.5 各组小鼠内皮祖细胞形成小管能力比较
从图中可看出，对照组小鼠内皮祖细胞形成小管的数目减少。与对照组比较，参麻颈组内皮祖细胞形成小管数目有明显增加（P<0.05），尼莫地平组小管形成数目更为突出（P<0.01）；尼莫地平组形成的小管状态也优于参麻颈组（图5）。
2.6 各组小鼠内皮祖细胞中相关蛋白的表达水平
Western blot检测结果显示：与对照组比较，参麻颈组（P<0.01）和尼莫地平组（P<0.01）小鼠内皮祖细胞内BDNF蛋白表达增加，而参麻颈组和尼莫地平组之间结果差异无统计学意义（图6）。
3. 讨论
缺血性中风是一种以动脉粥样硬化为基础的中枢系统不可逆损伤；它是由阻塞颈内动脉、椎动脉或者脑血管的血栓形成引起的，这一过程减少了血液供应，导致细胞代谢紊乱和衰老，并进一步导致血管内皮损伤[9-10]。脑缺血后导致严重的脑损伤，并造成神经功能障碍，包括偏瘫、肢体痉挛和认知障碍等，从而降低患者的生活质量[11]。目前，西医临床治疗存在局限性，使得该疾病的残疾率仍然很高，以及带来的社会经济负担也在继续增加。中医药博大精深，很多研究者一直都在致力于寻找改善脑缺血所致神经功能障碍的中医疗法。
中医典籍《伤寒杂病论》早就将活血化瘀中药或中药复方用于缺血性疾病的治疗。活血化瘀中药复方通过多靶点、多途径的作用方式发挥整体性作用。现代研究方法——代谢组学、基因组学、蛋白质组学等为中药复方作用机制的阐述提供强有力的支持。前期相关研究显示，在传统中药中，发现许多成分可以促进血管的生成，如丹参酮，川芎嗪，三七总皂苷等[12-14]，这些是方剂中常用的中药，也是活血化瘀类草药的代表。而参麻颈复方中，大部分的中药具有活血化瘀作用，是否能够改善骨髓来源内皮祖细胞功能，又能否促进脑缺血损伤后的新血管的生成，需要进一步验证。
本研究中，参麻颈复方颗粒预处理后，小鼠脑缺血所致的神经行为学功能评分显著改善；TTC染色梗死体积也显著减少（P<0.01）。证明参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤具有保护作用，可改善神经功能和减小缺血梗死体积。
越来越多的临床前研究表明[15]，无论是缺血性脑卒中急性期还是慢性期，均会导致炎症和脑组织不可逆转的损伤。因此，为了减轻缺血组织的病理损伤，修复内皮功能障碍引起的血管损伤成为缺血性脑卒中治疗的主要方向。骨髓来源内皮祖细胞是内皮愈合和血管生成的关键效应因子。内皮祖细数量减少、内皮功能障碍与心血管事件风险增加息息相关[16]，这与内皮祖细胞介导的血管修复受损致使血管疾病进展是一致的[17]。为了响应缺血信号和血管损伤,骨髓来源的内皮祖细胞被动员到循环中并募集到内皮损伤部位，从而形成新生血管，这也是一种自然的防御机制[18]。
第二部分实验研究了参麻颈复方颗粒对脑缺血损伤小鼠内皮祖细胞的保护作用。结果显示，小鼠脑缺血损伤后，来自骨髓的内皮祖细胞黏附在96孔板和迁移至Transwell板下室的数目有显著减少，给予参麻颈复方颗粒预处理后，黏附细胞数目（P<0.01）和迁移细胞数目（P<0.05）均有明显增加。另外，脑缺血损伤可影响血管新生的速度和质量，表现为内皮祖细胞形成小管的能力，包括形成小管的数量和小管长度。本研究的结果中，参麻颈复方颗粒显著增加脑缺血损伤小鼠的内皮祖细胞形成小管的数量和长度（P<0.05）。
神经营养因子是一组对神经系统的发育、生长、存活和分化至关重要的蛋白质[19]。脑源性神经营养因子（BDNF）是神经系统中含量最丰富、分布最广的神经营养因子。血管内皮细胞合成并分泌BDNF，并通过刺激其原肌球蛋白受体激酶B促进神经系统中的细胞分化、细胞生长、突触形成和神经发生[20-21]。重要的是，BDNF在缺血性和创伤性脑损伤后表现出许多神经保护特性[22]。BDNF通过促进新生血管、调节内皮一氧化氮生成和抑制凋亡来改善内皮细胞功能障碍[23]。
第三部分实验深入探讨了参麻颈复方颗粒保护小鼠脑缺血损伤的作用，结果显示，小鼠脑缺血后，大脑受到损伤，内皮祖细胞中BDNF蛋白表达显著降低，内皮祖细胞功能受损；参麻颈复方颗粒干预后，BDNF蛋白表达水平显著增加（P<0.01），细胞功能得以改善。这与二甲双胍上调人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中BDNF的表达逆转高糖状态下的细胞损伤相同[23]。由于BDNF蛋白表达的增加，脑缺血小鼠的神经功能得到改善，脑梗死体积减小。
综上所述，参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤有保护作用，这一作用可能与促进内皮祖细胞中脑源性神经因子BDNF蛋白表达，改善内皮祖细胞功能有关。我们这一研究为参麻颈复方颗粒在心血管疾病的治疗提供了新视角，并进一步验证了在心脑血管疾病治疗领域的应用，这可能减缓疾病的进展和改善预后。
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表 1 两组患者应激指标对比（
$ \bar x $ ±s）组别 例数 Cor（μg/L） NE（μg/L） 手术前 手术后 手术前 手术后 对照组 81 229.47±29.41 356.99±47.49* 0.31±0.06 0.47±0.08* 观察组 81 230.02±27.29 292.48±37.19*# 0.30±0.05 0.40±0.05*# t 0.12 9.63 1.15 6.68 P 0.90 <0.01 0.25 <0.01 注：* P<0.05，与手术前相比；# P<0.05，与对照组相比 
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表 2 两组患者MMSE评分对比（
$\bar x $ ±s，分）组别 例数 T0 T1 T2 对照组 81 29.00±0.77 20.48±1.25 24.74±1.14 观察组 81 29.12±0.66 23.65±1.42# 26.73±1.52# t 1.06 15.08 9.43 P 0.29 <0.01 <0.01 注：# P <0.05，与对照组相比
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表 3 两组患者睡眠质量对比（
$\bar x $ ±s）组别 例数 REM（%） 主观睡眠质量（分） T0 T3 T4 T0 T3 T4 对照组 81 22.10±2.41 13.65±2.76* 16.17±1.84* 8.52±1.21 3.91±1.14* 6.01±1.53* 观察组 81 22.20±2.70 16.94±2.12*# 16.95±1.83*# 8.63±1.41 6.31±1.45*# 7.04±1.13*# t 0.25 8.51 2.71 0.53 11.71 4.87 P 0.80 <0.01 0.01 0.59 <0.01 <0.01 注：* P<0.05，与T0相比；# P<0.05，与对照组相比
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表 4 两组患者围术期情况对比（
$\bar x $ ±s，h）组别 例数 睁眼时间 拔管时间 定向力恢复时间 对照组 81 7.04±2.72 7.70±3.11 29.20±2.51 观察组 81 6.14±2.07# 6.81±2.08# 25.83±1.30# t 2.37 2.14 10.73 P 0.02 0.03 <0.01 注：# P<0.05，与对照组相比
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表 5 两组患者的不良反应发生情况对比（%）
组别 例数 低血压 恶心呕吐 疼痛 总发生率 对照组 81 4（4.94） 7（8.64） 6（7.41） 17（20.99） 观察组 81 1（1.23） 4（4.94） 3（3.70） 8（9.88）# x2 4.11 P 0.04 注：# P<0.05，与对照组相比
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