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系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，在我国的发病率为40～70/10万[1]，是导致女性死亡的十大原因之一。SLE发病机制不明，尚无有效治疗手段。目前主要以激素、环磷酰胺和骁悉等免疫抑制剂为主，但药物引起的股骨头坏死、重症感染等副作用严重影响治疗效果[2]。随着对其免疫病理机制研究的进展，针对免疫紊乱关键环节的调控策略，如生物制剂、血浆置换、干细胞等为SLE的治疗提供了新的视角和理念[3-6]。但是，这些治疗方法仍然存在很多局限性和个体差异。SLE在祖国医学中属“阴阳毒” “蝴蝶丹” “痈证”等。近年来，很多中医药单独或者联合西药治疗SLE取得较好的效果，且副作用少，价格低廉，逐渐受到广大临床医生的认可和患者的接受。但是中医药治疗SLE的确切调节机制和作用环节尚不明确，本文从代谢组学、免疫细胞、淋巴细胞因子和细胞凋亡等多个方面，对中医药治疗SLE机制的研究进行综述，为利用现代化方法探索祖国传统医学治疗SLE的机制研究提供思路。
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SLE是一种多器官和组织受累的自身免疫性疾病，临床表现多样，目前在现代医学领域尚无疾病亚型的分类。1987年中国卫生部药政局颁布的《系统性红斑狼疮辨证标准》，将SLE辨证分为4种证候，即热毒炽盛、肝肾阴虚、气血瘀滞、脾肾阳虚；1993年《中药新药治疗红斑狼疮的临床研究指导原则》将SLE分为热毒炽热、阴虚内热、肝肾阴虚、瘀热伤肝、脾肾阳虚、风湿热痹6种证候。
SLE的临床表现众多，但是其本质均是肝肾阴虚，进而产生热毒和血瘀。首先肝肾阴虚容易导致患者成为SLE易感人群，热毒和血瘀则可导致多器官和组织的损伤，因此，临床最常见的SLE证候为热毒血瘀阴虚证[7]。此外，中医证型与SLE不同系统受累存在关联，其中热毒炽盛证与神经精神系统、脾肾阳虚证与肾脏系统、瘀热痹阻证与血液和心血管系统、阴虚内热与肺脏系统存在相关性。有人利用气相色谱-质谱联用技术，对不同SLE中医证候类型患者的尿液进行了分析，发现相对于正常对照组，阴虚内热和脾肾阳虚两种证型的SLE患者有4种相同的代谢物（1，2，3-三羧酸环丙烷、柠檬酸三乙酯、甘氨酸和氯苯甲酸）；脾肾阳虚和阴虚内热两种证型的SLE患者有特征代谢物（包括琥珀酸、马尿酸、赤霉酸、9，10-开环胆甾-5，7，10-三烯和2H苯并吡喃），提示三羧酸循环、肠道菌群和糖代谢等通路参与SLE不同证型的病理机制[8]。
体外实验发现，热毒血瘀型SLE患者来源的血清在体外刺激人肾系膜细胞可诱导特异蛋白表达，其中膜联蛋白A2和 A5可作为热毒血瘀证的生物标志物及潜在治疗靶点[9]。自身抗体是SLE诊断的重要指标之一，基于不同自身抗体种类和SLE常见中医证型的关联研究发现：抗核抗体滴度按均值大小排列，依次为热毒炽盛型、阴虚内热型和脾肾阳虚型；抗双链DNA抗体（dsDNA）滴度按阳性率大小排列，依次是脾肾阳虚型、阴虚内热型和热毒炽盛型，其中抗组蛋白抗体阳性率在脾肾阳虚型和热毒炽盛型中存在显著差异[10]。还有研究发现SLE患者的自身抗体谱可以指导SLE中医辨证分型，比如，抗dsDNA抗体和抗U1RNP抗体阳性，多考虑为风湿热痹型，而抗dsDNA抗体和抗核小体抗体阳性，多考虑为脾肾阳虚型[11]。另外，SLE患者的血瘀证与抗心磷脂抗体、补体C3和补体C4等免疫学指标存在相关性，提示自身免疫复合物形成可能是血瘀证的发病机理之一[11]。
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SLE是一种多器官受累的系统性疾病，患者体内的代谢网络必然发生变化，因此，患者循环系统中代谢物种类、浓度或相对比例都有可能发生改变。代谢组学是一种系统生物学技术，通过对体液及组织中的小分子代谢物的整体组成进行动态的跟踪监测，可以分析机体在环境和病理刺激时内源代谢物的改变，为临床疾病生物标志物探索、疾病分型和疗效评估等研究提供靶标和线索。多数研究显示SLE患者与健康对照组相比，血清代谢物的差异主要集中在脂质和氨基酸。高密度脂蛋白（HDL）降低，低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）升高，均提示SLE患者存在脂质代谢紊乱，而血清氨基酸水平降低和糖酵解中间代谢产物丙酮酸下降则说明SLE患者存在能量代谢紊乱[12]。
解毒祛瘀滋阴方能有效控制SLE的病情进展，研究报道其临床效果显著优于单用糖皮质激素组。在代谢水平上，该中医复方可显著上调二十碳五烯酸的含量，同时显著上调氨基酸生物标志物甘氨酸、苯丙氨酸和色氨酸至正常水平 [13]; 在狼疮小鼠模型的研究中，昆仙胶囊治疗组与对照组比较，其小鼠血清中支链氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、 柠檬酸、磷酸胆碱、牛磺酸和葡萄糖含量升高，而酮体、肌酸等含量降低，提示其发挥作用的机制可能与促进机体正常的能量代谢和氧化能力，稳定细胞膜以及抑制细胞的异常凋亡有关[14]。MRL/lps狼疮鼠存在较明显的脂质代谢异常，青蒿-鳖甲药可以有效改善狼疮鼠体内脂质代谢异常，降低血清L-a-溶血卵磷脂水平，减少血栓发生，同时，改善狼疮小鼠急性期的炎症反应，减少其病理损伤[15]。
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巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成细胞，能够通过吞噬凋亡细胞协助清除自身抗原，避免自身免疫反应的发生。巨噬细胞吞噬能力障碍在SLE发病过程中发挥重要作用。体外研究显示植物多糖、柴胡多糖和黑灵芝多糖都能够显著增强巨噬细胞的吞噬能力[16]，可能通过调控固有免疫应答影响SLE的病程。雷公藤多苷能够下调SLE患者树突细胞表面的Toll样受体9（TLR9），进而抑制树突细胞对T细胞的激活作用[17]。
淋巴细胞分化异常和过度激活是SLE的主要病理机制之一，包括T、B淋巴细胞过度活化和炎性细胞因子的异常表达。白藜芦醇能够通过减少干扰素-γ等细胞因子，抑制CD4+T细胞向Th1细胞分化，减轻降植烷（pristane）诱导狼疮鼠的炎症反应[18]。淫羊藿素能够通过转录因子STAT5b调控Foxp3/IL-17α的表达，影响调节性T（Treg）细胞和T辅助17（Th17）细胞的平衡，减轻MRL/lpr狼疮鼠的肾损伤[19]。狼疮颗粒具有补肾化毒的作用。研究发现，和西药组相比，联合狼疮颗粒的中西医结合治疗组的临床疗效更优，能够显著下调血清可溶白细胞介素2受体（sIL-2R）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平[20]。CD229即淋巴细胞信号活化分子家族3(SLAMF3)，是T细胞活化和分化的重要调节分子，能够通过上调CD25，促进CD4+T细胞向具有免疫抑制功能的Treg细胞转化。在MRL/lpr狼疮鼠的研究中也发现解毒祛瘀滋肾方能够通过CD299/CD25轴促进Treg细胞分化来改善SLE病情[21]。另外，研究显示白芍总苷单药能够有效降低小鼠尿蛋白水平，同时降低其外周血单个核细胞中IL-17的mRNA水平，提示白芍总苷也能调控Th17/Treg细胞平衡这一机制发挥作用[22]。基于流式细胞术的分析，进一步证实了白芍总苷能够显著降低MRL/lpr 狼疮鼠外周血Th17细胞的比例，同时增高Treg 细胞的比例[23]。B细胞异常激活产生大量致病性自身抗体是SLE的另一重要免疫病理机制。青蒿素具有免疫调控作用，有望成为SLE的新型治疗药物，目前已进入三期临床试验[24]。在MRL/lpr 狼疮鼠的研究中发现，青蒿素衍生物马来酸蒿薏米胺（SM934）能够显著抑制B细胞TLR7/9的表达，抑制B细胞活化和浆细胞形成，从而降低自身抗体的水平，使狼疮疾病得到有效控制[25]。
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目前，多数研究证实炎性因子的异常表达参与SLE的发生和发展。SLE患者外周血中IL-2水平较低，但IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-21、TNF和IFN 水平较高。狼疮定具有滋阴、解毒的祛瘀作用。临床研究发现SLE 患者的sIL-2R明显高于健康对照组，且疾病活动度高的患者其表达水平更高，这可能是导致SLE患者血清中IL-2水平较低的原因，狼疮定能够有效降低SLE患者sIL-2R水平，调控细胞免疫功能，使紊乱的免疫内环境趋于平衡[26]。狼疮方具有解毒活血的功效，在慢性移植物抗宿主的小鼠模型研究中发现，狼疮方能够有效减少2型T辅助（Th2）细胞分泌的IL-6和IL-10的水平，同时降低自身抗体水平，从而减轻狼疮肾炎的损伤[27]。中药组方通过养阴清热、凉血活血等功效，有效降低阴虚内热型SLE患者血清中IL-4和IL-10水平，同时增加IL-2水平，以调控Th1/Th2细胞平衡并降低狼疮疾病的活动度[28]。凉血化瘀方能有效降低MRL/lpr狼疮鼠血清中IL-6、IL-17、IL-21和自身抗体的水平[29]。益气养阴方通过活血通络、抗炎消肿、解毒清热等功效，显著降低SLE 患者血清中IL-6、IL-8和TNF-α的水平，有助于SLE患者免疫功能的重建[30]。另有研究发现，与常规西药治疗组相比，联合滋阴降火方（生地黄、赤芍、丹参、防风、百合、青蒿、黄芪）治疗阴虚内热型SLE患者，能够显著降低血清中IL-10 和IL-18的水平并提高临床疗效，不良反应无显著差异[31]。
细胞黏附分子(ICAMs)是一类能够介导免疫细胞与内皮细胞相互作用的糖蛋白分子。研究显示ICAM-1、ICAM-3和p选择素在SLE患者血清中显著高于正常对照组，养阴清热煎通过滋阴凉血、解毒化瘀、补虚泻实等功效，能够显著抑制SLE患者高表达的ICAMs，实现对器官损伤的保护和修复[32]。血管炎是SLE的基本病理机制，血管内皮细胞是直接受损的靶器官。可溶性血栓调节蛋白 、血管假性血友病因子均是由血管内皮细胞合成的糖蛋白，也是血管内皮细胞受损的标志。在自发性狼疮小鼠模型的研究中发现，清养透解方（青蒿、鳖甲、水牛角、生地黄、牡丹皮、玄参）能够有效降低狼疮小鼠血清可溶性血栓调节蛋白、血管假性血友病因子的表达，保护血管内皮，改善肾脏组织慢性炎症的病理改变[33]。
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活动期SLE患者外周淋巴细胞的凋亡水平显著增高，可能与Fas的高表达有关。芪加真武汤可以通过干扰Fas的表达抑制异常的细胞凋亡，从而实现治疗SLE的功效[34]。采用清热化瘀滋阴方，联合常规激素治疗气阴两虚型SLE患者，相对于常规激素单独治疗组，其外周血单个核细胞的凋亡指标bcl-2、bax、fas、p53和c-myc显著降低，提示清热化瘀滋阴方可通过降低细胞凋亡率来实现对免疫功能的调控[35]。解毒祛瘀滋阴方联合激素治疗相对单用激素治疗能够有效上调CD4和CD8阳性细胞中bcl-2的表达，促使机体紊乱的免疫内环境趋于平衡[36]。在BXSB狼疮小鼠的研究中发现，狼疮静能够显著抑制小鼠脾脏中T、B淋巴细胞的异常凋亡，阻止过量核酸抗原的释放，从而抑制B细胞产生致病性自身抗体，来达到治疗SLE的目的[37]。
细胞焦亡（pyroptosis）是一种新发现的程序性细胞死亡。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3 (NL- RP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1 (Caspase-1)及 IL-1β 是参与细胞焦亡的重要因子，提示细胞焦亡与炎症反应的发生发展密切相关。滋阴清热方具有滋阴清热、解毒凉血的功效，联合糖皮质激素治疗阴虚内热型SLE患者效果显著，通过狼疮鼠的体内实验研究发现，滋阴清热方能够显著降低细胞焦亡相关因子，可能是其治疗SLE的机制之一[38]。
综上所述，很多中药能够通过多靶点调控机体的免疫和代谢功能，从而实现对SLE病情的改善（表1）。
表 1 中药治疗系统性红斑狼疮的机制和靶点
药名 组成成分 作用机制/靶点 相关分子 单药 柴胡多糖 巨噬细胞 NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 黑灵芝多糖 巨噬细胞 TLR4 雷公藤素 树突细胞 TLR9 淫羊藿 Treg/Th17 STAT5b 白芍总苷 Treg/Th17 IL-17 mRNA 青蒿素 B细胞 TLR7/9 复方 青蒿-鳖甲药 青蒿、鳖甲 脂质代谢 L-a-溶血卵磷脂 解毒祛瘀滋阴方 白花蛇草、紫草、赤芍、生地、炙鳖甲 氨基酸代谢 二十碳五烯酸、甘氨酸、
苯丙氨酸、色氨酸细胞凋亡 Bcl-2 清热化瘀滋阴方 麦冬、赤芍、水牛角片、炒白术、连翘、牡丹皮、
紫草、秦艽、青风藤、金银花、白花蛇草细胞凋亡 Bcl-2、bax、fas、p53、c-myc 解毒祛瘀滋肾方 生地黄、炙鳖甲、青蒿、白花蛇草、积雪草、赤芍、
牡丹皮、佛手、升麻、重楼、生甘草Treg CD299、CD25 凉血化瘀方 水牛角、生地黄、赤芍、牡丹皮、制大黄、玄参、知母 细胞因子 IL-6、IL-17、IL-21 益气养阴方 生薏仁、丹皮、芍药、白花蛇草、升麻、水牛角、丹参、青蒿、鳖甲 细胞因子 IL-6、IL-8、TNF-α 养阴清热煎 生地黄、牡丹皮、青蒿、白花蛇草、蛇莓、半枝莲、益母草、丹参 细胞黏附分子 ICAM-1、ICAM-3 滋阴清热方 山茱萸、生地黄、茯苓、泽泻、牡丹皮、青蒿、甘草 细胞凋亡 IL-1β、NLRP3 芪加真武汤 茯苓、白芍、附子、生姜、甘草、黄芪、刺五加 细胞凋亡 fas 中药组方 生地、黄芩、积雪草、川穹、丹参、猫抓草 细胞因子 IL-2、IL-4、IL-10 狼疮静 生地、熟地、丹皮、白花蛇草 细胞凋亡、B细胞 核酸抗原 狼疮定 白花蛇草、赤芍、生地、水牛角等 细胞因子 IL-2 狼疮方 白花蛇草、半枝莲、紫草、丹参、益母草 细胞因子 IL-6、IL-10 狼疮颗粒 生地黄、熟地黄、牡丹皮、白花蛇草 Treg/Th17 sIL-2R、TNF-α 昆仙胶囊 昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟丝子等 能量代谢 支链氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、柠檬酸、磷酸胆碱、牛磺酸、葡萄糖 注：NLRP. 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白；IL. 白介素；ICAM. 细胞黏附分子；Treg. 调节性T细胞；Th17. T辅助细胞17；TNF. 肿瘤坏死因子；TLR. Toll 样受体 -
SLE是一种复杂的多器官受累疾病，具有明显的异质性，而中医药的优势在于整体调控和辨证论治。中医理论中的“扶正驱邪”，即达到驱邪而不伤正，有助免疫功能恢复新的平衡；“同病异治”，即同一种疾病根据不同的证型采用不同的治疗方法，有助SLE个体化治疗方案的制定。但目前中医药治疗SLE的基础理论尚不明确，基于生物标志物探索中医药治疗SLE的病理机制，有望为SLE的诊疗提供新的思路和策略。
Research progress of tradition Chinese medicine treatment mechanism of systemic lupus erythematosus based on biomarkers
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摘要: 系统性红斑狼疮（SLE）是一种多器官受累的自身免疫性疾病，目前基于糖皮质激素和免疫抑制剂的治疗，仍然存在很多局限性和个体差异。近年来，越来越多的研究表明，联合中医药治疗SLE具有疗效好，不良反应低和安全性高等优点。但是，中医药治疗SLE的确切调节机制和作用环节尚不明确，本文从代谢组学、免疫细胞、淋巴细胞因子和细胞凋亡等，对中医药治疗SLE机制的研究进行综述，为利用现代化方法探索祖国传统医学治疗SLE的机制研究提供思路。Abstract: Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with multiple organ involvement. There are still many limitations and individual differences in the treatment based on glucocorticoids and immunosuppressants. In recent years, more and more studies have shown that the combination of traditional Chinese medicine in the treatment of SLE has the advantages of good efficacy, low adverse reactions, and high safety. However, the exact regulatory mechanism and combined traditional Chinese medicine in the treatment of SLE are still unclear. This paper reviews the research on the mechanism of traditional Chinese medicine in the treatment of SLE from metabonomic, immune cells, lymphocyte factors and apoptosis, etc, provides ideas for exploring the mechanism of traditional Chinese medicine in the treatment of SLE with modern methods.
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Key words:
- biomarkers /
- systemic lupus erythematosus (SLE) /
- traditional Chinese medicine /
- metabonomic /
- immune cells /
- cytokines
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心力衰竭，简称心衰，是由于心脏器质性或功能性异常导致的心室充盈或射血能力受损所引起的复杂临床综合征[1]。随着人口老龄化程度不断加深以及许多患者从急性心脏疾病中存活，慢性心衰的患者数呈现增长态势，尽管过去30年其生存率有了显著提高，但5年病死率仍约为50%[2, 3]。慢性心衰因其高发病率和高病死率，长期以来一直是社会的主要医疗负担[4]。慢性心衰主要表现为射血分数降低的心衰，其药物治疗主要包括血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂、钠-葡萄糖协同转运体2抑制剂组成的四联疗法[5]。患者尤其是长期用药者，由于低血压、电解质紊乱等不良反应的影响，通常用药依从性欠佳。
传统中药在治疗心衰方面有着悠久的历史和独特的理论[6]，具有多靶点且成本较低等优势，如黄芪[7]。黄芪注射液是临床上治疗心衰的常用中药注射剂之一，疗效肯定[8]。大量研究已经证实了黄芪治疗心衰的有效性和安全性[9, 10]。黄芪甲苷是黄芪治疗心衰的主要活性成分[11]。但是，由于黄芪甲苷水溶性差，生物利用度极低，限制了黄芪甲苷药物制剂在临床上的转化[12, 13]。因此，黄芪甲苷可作为先导化合物，进行结构优化，既保持其原有的活性，又能增强其水溶性，以便增加生物利用度，充分发挥黄芪甲苷治疗心衰的作用。本研究主要从合成的系列水溶性黄芪甲苷衍生物中，筛选具有抗心衰效用的化合物，并初步探讨其对心肌重塑和心肌纤维化的改善作用，以期为临床提供抗心衰的候选新药。
1. 材料
1.1 动物
雄性C57BL/6小鼠150只，7~8周龄，体重为18~22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：20170012004976。动物实验严格遵守动物护理伦理指南进行操作，已通过海军军医大学动物实验伦理委员会批准。饲养环境为无特定病原体（SPF）环境，温度为（25±2 ）℃，每日光照12 h，昼夜循环，自由摄取标准饲料和饮用水。
1.2 试剂与材料
水溶性黄芪甲苷结构改造衍生物包括HHQ、HHQ12CS和HHQ18TC，HHQ进一步结构改造得到HHQ16和HHQ19，均由上海医药工业研究院孙青䶮教授提供。卡托普利、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、异氟烷均购自国药集团。内源性过氧化物酶封闭液、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、苏木素染色液购自碧云天公司。Masson复合染色试剂盒购自博谷德生物工程公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒购自日本Takara公司。Target Retrieval Solution购自丹麦Dako公司。COL1、COL3抗体、TGF-β1抗体购自英国Abcam公司。αSMA抗体购自中国博奥森生物技术公司。
1.3 仪器
呼吸机（意大利UgoBasile公司）；麻醉剂（中国惠德万邦公司）；二维及M型超声（意大利EsaoteMyLab公司）；诊断仪及探头（意大利One/Touch公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；病理切片机（中国辅光精密仪器公司）；包埋机（中国BIOBASE博科公司）；组织摊片机（中国湖北孝感安立信公司）；高通量组织研磨仪（中国上海必横生物公司）；PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；Stepone Plus实时荧光定量PCR仪（美国AB applied biosystems公司）。
2. 方法
2.1 左冠状动脉前降支（LAD）结扎心衰模型的建立
通过2.5%异氟烷麻醉小鼠，气管插管接入呼吸机保持麻醉状态。开胸暴露心脏，在左心耳下缘约1 mm处用线缝扎冠状动脉，缝合后，待小鼠恢复自主呼吸，饲养3~4周，通过心超检测慢性心衰模型，从中筛选慢性心衰造模成功的小鼠（EF<50%）。
2.2 分组及给药
首先对黄芪甲苷衍生物进行药效筛选。将LAD结扎造模成功后的小鼠随机分为模型组、卡托普利组、系列黄芪甲苷衍生物（HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC）组、假手术组，共6组。造模后4周使用0.5%CMC-Na溶液配制黄芪甲苷衍生物，并按照小鼠每10 g体重0.1 ml进行灌胃给药，黄芪甲苷衍生物组分别给予10 mg/kg的HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC，假手术组和模型组分别给予同等剂量的0.5%CMC-Na溶液，卡托普利组给予8.6 mg/kg卡托普利混悬液，每日给药1次，连续28 d。HHQ衍生物药效筛选分组同上，即造模成功的小鼠随机分为模型组、HHQ组、HHQ16组和HHQ19组、假手术组，一共5组。假手术组和模型组处理同上，HHQ衍生物组分别用10 mg/kg的HHQ、HHQ16、HHQ19灌胃，每日给药1次，连续28 d。
2.3 心脏超声检测心功能
通过吸入2.5%异氟烷气体麻醉小鼠，在检测过程中提供1.0%~1.5%浓度的异氟烷以维持麻醉状态。通过二维及M型超声诊断仪检测小鼠的心功能，筛选造模后的成功模型（EF<50%）以及评价给药后小鼠的心功能。主要检测指标有左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）等参数。分别于给药18、28 d对各组小鼠进行心脏超声检测。
2.4 心脏形态学分析
对小鼠进行心脏超声检测之后称重，然后取心脏称重。计算心脏重量和体重的比值，即心体比（mg/g）。心脏标本用10%福尔马林固定24 h后，将心脏取出，排列整齐，拍照，观察心脏的大小和形态。取小鼠心脏组织于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规石蜡包埋切片处理。用HE染色和Masson染色观察心脏大体形态及胶原形成。
2.5 实时荧光定量PCR
提取心肌组织总RNA，逆转录成cDNA，实时定量PCR体系包括：SYBR 10 μl，引物（上游引物和下游引物）1 μl，cDNA 3 μl，以及DEPC水7 μl，引物合成序列见表1。
表 1 引物合成序列名称 上游引物 下游引物 COL1A1 TAAGGGTCCCCAATGGTGAGA GGGTCCCTCGACTCCTACAT COL3A1 ACGTAGATGAATTGGGATGCAG GGGTTGGGGCAGTCTAGTG αSMA GGACGTACAACTGGTATTGTGC TCGGCAGTAGTCACGAAGGA TGF-β1 GAGCCCGAAGCGGACTACTA TGGTTTTCTCATAGATGGCGTTG Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 2.6 免疫组织化学染色
心脏组织于4%多聚甲醛组织固定液中固定。梯度乙醇脱水后将组织浸入热石蜡中，将浸好的石蜡放入包埋机中包埋。将组织进行横切后去石蜡，使用Target Retrieval Solution进行抗原修复操作。用内源性过氧化物酶封闭液消除内源性过氧化物酶的干扰。用1%牛血清白蛋白封闭，使用相应的特异性抗体进行染色，根据种属关系选择对应二抗染色。为了可视化染色，使用DAB显色，并用苏木素进行复染。
2.7 统计方法
实验处理及统计图表的绘制利用GraphPad Prism软件完成。实验结果均采用均数±标准误（mean ± SEM）的方式呈现。两组样本之间的比较采用两独立样本t检验（t-test）；两组以上两两之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素重复方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响
LVEF和LVFS是评价心衰的重要指标，心衰时LVEF和LVFS下降。如图1所示，阳性对照药卡托普利给药后增加18 d和28 d的LVEF和LVFS，以18 d最为显著，LVEF增长百分比为56%；黄芪甲苷衍生物HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC均增加LVEF和LVFS，且呈时间依赖性，增强效果在3种药物之间无显著差异。以HHQ为例，LVEF增长百分比在18 d为61%，28 d为71%，优于同期的卡托普利。结合3种药物的合成难易性、稳定性、水溶性和药动学参数（数据在此不展示），HHQ可以作为进一步优化的候选化合物。
图 1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=5~9）A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001, 与0 d比较。3.2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响
对上述筛选出来的HHQ药物进一步衍生化，使其具有更好的合成路线、稳定性、水溶性和药动学参数（数据不展示）。进一步以HHQ为对照，对其衍生物HHQ16和HHQ19进行药效评估。如图2所示，给药28 d，HHQ衍生物均能使得心衰小鼠的LVEF%和LVFS%升高，其中，HHQ16升高LVEF%的百分比为104%，HHQ19升高LVEF%的百分比为171%（图2A、图2B）；而HHQ升高LVEF%的百分比为99%。但HHQ19显著增加心率（HR）（图2C），而HR增加会导致心肌耗氧量增加，增加死亡率[14]。因此，3种HHQ衍生物均能提升心衰小鼠的心功能，综合上述因素，选择HHQ16为最优候选化合物。
图 2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=7~10）A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）；C.心率（HR）**P<0.01，***P<0.001，与0 d比较。3.3 HHQ16改善心衰小鼠心脏大小、形态和结构
进一步观察候选化合物HHQ16对心肌重塑的影响，初步探索其作用机制。如图3所示，与假手术组比较，模型组心脏显著变大，形态不规则，心体比显著升高（图3B）；HHQ16给药28 d后，心脏显著变小，心体比显著下降（图3A、图3B）。HE染色（图3C）表明，假手术组小鼠心肌细胞结构正常，模型组可见部分心肌细胞呈现区域性不规则，心肌细胞变大。HHQ16给药28 d后，形态变规则，心肌细胞肥大显著改善。
3.4 HHQ16抑制心衰小鼠心肌组织纤维化
进一步观察HHQ16对心肌纤维化的影响。首先通过Masson染色，观察胶原沉积。如图4所示，假手术组的心肌组织无胶原沉积。模型组的心肌组织胶原沉积增多；而HHQ16组给药28 d，心肌胶原沉积显著减少。COL1、COL3、αSMA和TGF-β1是评估心肌纤维化的重要指标[15]。免疫组织化学染色结果显示（图5），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA蛋白表达水平显著升高，经HHQ治疗后，这些蛋白表达水平显著降低。基因水平也展示了相似的改变（图6），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA表达水平显著升高，而HHQ16能显著降低这些纤维化指标的mRNA表达水平。以上结果表明，HHQ16可以改善心衰造成的心肌纤维化。
图 6 HHQ16对心衰小鼠心肌纤维化相关指标mRNA水平的影响A.COL1；B.COL3；C.αSMA；D.TGF-β1*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与模型组比较。4. 讨论
心衰已经成为严重威胁人类健康的全球性公共卫生问题。越来越多的研究表明，由于“多靶点效应”，中药治疗心衰具有独特的优势，中药活性成分为新药开发提供了有价值的候选化合物。黄芪甲苷是治疗慢性心衰的中成药黄芪注射液的主要有效成分。然而，黄芪甲苷结构复杂，水溶性差，生物利用度低，化学合成困难，限制了该药物的临床转化。本研究涉及的水溶性黄芪甲苷衍生物均可显著改善心功能，最终根据化合物合成难易、药物稳定性、水溶性以及初步药动学比较，确定HHHQ16为最优候选药物。HHQ16具有抗心衰作用，对左冠状动脉前降支结扎模型诱导的慢性心衰小鼠有明确的治疗效果。
心肌重塑是由一系列复杂的分子和细胞机制导致的心肌结构、功能和表型的变化，包括心肌细胞肥大及心肌纤维化（心肌基质重构）等改变，以及在此基础上形成的心脏扩大、心脏质量增加。目前的研究认为，心肌重塑是心衰发生、发展的分子细胞学基础，是心衰恶化的主要机制之一。相关研究表明黄芪甲苷具有抗氧化、增强免疫力、增强心肌收缩力、减轻心肌纤维化和心肌重塑等作用[16-20]。通过对心衰小鼠表型观察，发现经过LAD手术后，模型组的心脏显著变大，心肌细胞变大，结构不规则，通过HHQ16治疗28 d后，心脏显著变小，心肌细胞接近正常，形态变规则。表明HHQ16能够改善心衰小鼠心肌重塑。
心肌纤维化被认为是心衰的基本病理变化，也是心肌重塑的分子基础[21]。心肌纤维化是当心肌因缺血、炎性反应、衰老等原因受损时，局部的心肌细胞凋亡，心肌成纤维细胞增殖，胶原纤维为主的细胞外基质增多，从而产生的一种病理变化。其主要特征是胶原蛋白合成和降解之间的平衡紊乱，导致心脏的深层结构和功能异常，造成收缩和舒张功能的严重损害，最终体现为心衰[22, 23]。心肌纤维化与心衰患者的疾病严重程度密切相关，但纤维化过程尚未成为心衰的直接治疗靶标。实验和临床证据均表明，心肌纤维化的改变可能是可逆的[22]，开发预防和逆转心肌纤维化的药物对于减轻心肌重塑和延缓心衰的发展至关重要。
胶原蛋白是细胞外基质的重要组分，其中COL1约占心脏胶原总量的85％，参与组成具有抗张强度的粗纤维，COL3约占11％，可组装成细纤维，以保持基质网的弹性[24]。在以心肌纤维化为特征的心脏疾病中，不管其病因如何，TGF-β1通常是导致纤维化的最后的、共同的中介物之一。TGF-β1是最重要的促纤维化生长因子之一，通过调节前胶原蛋白基因的表达，促进合成细胞外基质，促使心肌纤维化[25]。在肌成纤维细胞中，αSMA被组装成应力纤维，进一步导致细胞外基质蛋白过度沉积，减弱组织顺应性并加速心衰，肌成纤维细胞的分化是心肌纤维化反应的标志，其中，α-SMA的表达是此种分化的重要特征[26]。在本研究中，用Masson染色检测了小鼠的胶原，LAD手术可使小鼠胶原明显增多，而HHQ16给药治疗后能有效减少胶原沉积。通过免疫组化染色和qPCR检测了小鼠心肌纤维化相关指标，发现HHQ16可下调COL1、COL3以及αSMA蛋白水平的表达，并且下调COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA水平的表达，从而改善LAD手术引起的心肌纤维化，改善心衰程度。
综上所述，本研究从黄芪甲苷衍生物对心衰小鼠的保护作用入手，筛选出改造后黄芪甲苷衍生物最优的候选化合物HHQ16，通过对心肌重塑和心肌纤维化相关指标的检测，初步研究了其在心衰治疗中的作用机制，为HHQ16治疗心衰的药物研发提供科学依据。
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表 1 中药治疗系统性红斑狼疮的机制和靶点
药名 组成成分 作用机制/靶点 相关分子 单药 柴胡多糖 巨噬细胞 NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 黑灵芝多糖 巨噬细胞 TLR4 雷公藤素 树突细胞 TLR9 淫羊藿 Treg/Th17 STAT5b 白芍总苷 Treg/Th17 IL-17 mRNA 青蒿素 B细胞 TLR7/9 复方 青蒿-鳖甲药 青蒿、鳖甲 脂质代谢 L-a-溶血卵磷脂 解毒祛瘀滋阴方 白花蛇草、紫草、赤芍、生地、炙鳖甲 氨基酸代谢 二十碳五烯酸、甘氨酸、
苯丙氨酸、色氨酸细胞凋亡 Bcl-2 清热化瘀滋阴方 麦冬、赤芍、水牛角片、炒白术、连翘、牡丹皮、
紫草、秦艽、青风藤、金银花、白花蛇草细胞凋亡 Bcl-2、bax、fas、p53、c-myc 解毒祛瘀滋肾方 生地黄、炙鳖甲、青蒿、白花蛇草、积雪草、赤芍、
牡丹皮、佛手、升麻、重楼、生甘草Treg CD299、CD25 凉血化瘀方 水牛角、生地黄、赤芍、牡丹皮、制大黄、玄参、知母 细胞因子 IL-6、IL-17、IL-21 益气养阴方 生薏仁、丹皮、芍药、白花蛇草、升麻、水牛角、丹参、青蒿、鳖甲 细胞因子 IL-6、IL-8、TNF-α 养阴清热煎 生地黄、牡丹皮、青蒿、白花蛇草、蛇莓、半枝莲、益母草、丹参 细胞黏附分子 ICAM-1、ICAM-3 滋阴清热方 山茱萸、生地黄、茯苓、泽泻、牡丹皮、青蒿、甘草 细胞凋亡 IL-1β、NLRP3 芪加真武汤 茯苓、白芍、附子、生姜、甘草、黄芪、刺五加 细胞凋亡 fas 中药组方 生地、黄芩、积雪草、川穹、丹参、猫抓草 细胞因子 IL-2、IL-4、IL-10 狼疮静 生地、熟地、丹皮、白花蛇草 细胞凋亡、B细胞 核酸抗原 狼疮定 白花蛇草、赤芍、生地、水牛角等 细胞因子 IL-2 狼疮方 白花蛇草、半枝莲、紫草、丹参、益母草 细胞因子 IL-6、IL-10 狼疮颗粒 生地黄、熟地黄、牡丹皮、白花蛇草 Treg/Th17 sIL-2R、TNF-α 昆仙胶囊 昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟丝子等 能量代谢 支链氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、柠檬酸、磷酸胆碱、牛磺酸、葡萄糖 注：NLRP. 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白；IL. 白介素；ICAM. 细胞黏附分子；Treg. 调节性T细胞；Th17. T辅助细胞17；TNF. 肿瘤坏死因子；TLR. Toll 样受体 
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