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阿霉素（DOX）是一种蒽环类化疗抗生素，尽管其能有效治疗多种实体肿瘤和血液恶性肿瘤，但对肿瘤细胞和正常细胞的无差别攻击导致的毒副作用，使其临床应用受到限制[1-3]。特别是剂量依赖性心脏毒性最为突出，研究认为氧化应激是诱导心脏毒性的重要机制。其他常见的毒副作用还包括急性恶心呕吐、口腔炎、胃肠道紊乱、脱发、神经障碍和骨髓发育不全等[4-6]。同时，多药耐药的出现是DOX使用的附加问题[2]。因此，需要寻求DOX新的剂型结构来降低药物毒副作用带来的风险。
金纳米粒（AuNPs）具有毒副作用小、生物相容性良好的特性，且其具有粒径大小可调控、表面易修饰、高效的光热转化等优势，常被用于肿瘤的诊断和治疗[7-8]。AuNPs表面可修饰连接抗肿瘤药物、靶向肽、荧光物质或功能化基团等，实现精准治疗和实时监测[9]。常用的修饰配体为巯基（-SH），以形成Au-S键的方式连接在AuNPs表面，也可利用氨基与AuNPs的静电作用构建载体，但有研究表明，巯基比氨基作用更强，不易断裂[10]。
本研究制备了一种载DOX的mPEG修饰金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，验证了该纳米载体在保持对乳腺肿瘤细胞杀伤活性的同时，降低了DOX对正常乳腺细胞的毒副作用，为后续AuNPs连接DOX用于肿瘤治疗提供参考。
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ZD-85A型气浴恒温震荡培养箱（上海启前电子科技有限公司）；十万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；超纯水系统、数显pH计（均为德国Sartorius公司）；HDC-15K型离心机（上海泰坦科技股份有限公司）；Zetasizer nano ZS型激光粒度分析仪（英国Malvern公司）；1260 Infinity II型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；UV1800型紫外可见分光光度仪（中国TECHCOMP公司）。
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金纳米粒（20 nm，南京东纳生物科技公司）；HS-mPEG5K（上海芃硕生物科技有限公司）；HS-DOX（西安瑞禧生物科技有限公司）；乙腈、三乙胺、磷酸，均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）。
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人乳腺细胞（MCF-10A）、人乳腺癌细胞（MCF-7），均由海军军医大学药学系药剂学教研室提供。
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用纯水溶解HS-mPEG5K得到浓度为1 mg/ml的HS-mPEG5K溶液，向1 ml AuNPs（50 μg/ml）中加入5 μl HS-mPEG5K溶液，4 ℃孵育8 h，孵育结束后于4 ℃、以12000 g离心10 min，弃去含未反应HS-mPEG5K的上清液，纯水重悬。
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用纯水溶解HS-DOX得到浓度为44.7 μg/ml的HS-DOX溶液，取上步1 ml AuNPs-mPEG重悬液离心，弃去上清液，用0.75 ml纯水重悬后，加入0.25 ml HS-DOX溶液， 4 ℃孵育8 h，离心弃去含未反应HS-DOX的上清液，纯水重悬。
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取1 ml AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX溶液于马尔文Zeta电位样品池，使用激光粒度分析仪测定粒径和Zeta电位，每个样品测量3次。
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取1 ml AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX溶液于石英皿中，扫描波长400 nm～700 nm，以纯水作为各样品的纯溶剂参比进行光谱分析。
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向1 ml 50 μg/ml AuNPs中加入5 μl HS-mPEG5K溶液，4 ℃孵育8 h后离心去上清，分别用0.9375、0.875、0.75、0.5 ml 纯水重悬AuNPs-mPEG，再分别加入0.0625、0.125、0.25、0.5 ml HS-DOX溶液，得到投药浓度分别为2.79、5.59、11.18、22.35 μg/ml的反应体系，4 ℃孵育8 h，离心取上清液，通过高效液相色谱法（HPLC）对上清液进行定量检测，考察HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。具体检测方法见“2.3”项。
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色谱柱：Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）；流动相：水（0.1%三乙胺，磷酸调节pH 3.0）∶乙腈=75∶25；流速：1.0 ml/min；进样量：10 µl；柱温：室温；检测波长：254 nm。
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对照品溶液：精密称取HS-DOX 4.47 mg，加纯水在100 ml量瓶中定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得到浓度为44.7 μg/ml的HS-DOX对照品溶液。
供试品溶液：1 ml AuNPs-mPEG离心沉淀用0.75 ml纯水重悬，加入0.25 ml HS-DOX（44.7 μg/ml），4 ℃孵育8 h，离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
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配制以下溶液：A：5.59 μg/ml HS-DOX对照品溶液；B：1 ml AuNPs-mPEG离心沉淀用0.75 ml纯水重悬，加入0.25 ml纯水混合，4 ℃孵育8 h，离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，为空白基质溶液；C：供试品溶液。
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用纯水稀释HS-DOX对照品溶液，制得HS-DOX浓度为1.40、2.79、5.59、11.18、22.35 μg/ml的标准工作液。以峰面积（A）为纵坐标，质量浓度（μg/ml）为横坐标进行线性回归。
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分别选取低、中、高3个质量浓度（1.40、5.59、22.35 μg/ml）的HS-DOX标准工作液，1 d内进样3次，每次每个浓度连续进样5次，计算峰面积的相对标准偏差（RSD），考察日内精密度；连续进样3 d，每次每个浓度连续进样5次，考察日间精密度。
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取对照品溶液和供试品溶液于室温下储存，分别于0、4、8、12、16、24 h测定HS-DOX的含量，计算RSD。
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取9份供试品各1 ml，分别加入1 ml的含8.12、10.15、12.18 μg的HS-DOX对照品溶液混合，每组平行制备3份，得到80%、100%、120%加样量的加样供试品溶液。根据以下公式计算HS-DOX的加样回收率。
$$ \text{加样回收率}=\frac{{\mathrm{m}}_{\text{测得量}}-{\mathrm{m}}_{\text{原有量}}}{{\mathrm{m}}_{\text{加入量}}}\times 100{\%} $$ -
测定离心后的上清液，根据以下公式计算吸附率和载药量。
$$\begin{array}{c} \text{吸附率}=\displaystyle\frac{{\mathrm{m}}_{\text{投药}}-{\mathrm{m}}_{\text{上清}}}{{\mathrm{m}}_{\text{投药}}}\times 100{\%}\text{；}\\\text{载药量}=\displaystyle\frac{{\mathrm{m}}_{\text{吸附}}}{{\mathrm{m}}_{\text{吸附}}+{\mathrm{m}}_{\text{金纳米粒}}}\times 100 \% \end{array} $$ -
分别取MCF-10A和MCF-7细胞，用DMEM混合培养基调整细胞密度为5×104 cells/ml，以每孔0.1 ml的体积铺板于96孔板，37 ℃下孵育24 h。分别用相同摩尔浓度的AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX（0.02、0.06、0.18、0.53、1.58、4.75、14.25 μmol/L）处理24 h和48 h，每种药物浓度重复3个孔。用10%的CCK8溶液染色30 min。
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实验结果用(
$\bar x $ ±s)表示。采用GraphPad Prism v9 （San Diego, USA）软件进行统计分析。两组间比较采用Two-Way ANOVA ，P≤0.05认为差异有统计学意义。 -
AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的粒径分布和Zeta电位如表1所示，3种纳米颗粒的粒径逐渐增大，Zeta电位由负电荷转为正电荷，最终得到水动力直径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV的AuNPs-mPEG@DOX。AuNPs与HS-mPEG5K孵育后，部分柠檬酸根被甲氧基聚乙二醇取代，连接了PEG长链的AuNPs-mPEG更稳定不易聚集，粒径增大，负电荷减少；连接HS-DOX后，由于阿霉素含有氨基带正电，因而制备得到带正电荷的纳米颗粒。
表 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的平均粒径和Zeta电位（n=3）
纳米颗粒 平均粒径（nm） 多分散系数 Zeta电位（mV） AuNPs 28.31±0.37 0.38±0.02 −25.30±0.99 AuNPs-mPEG 43.32±1.40 0.38±0.07 −22.20±0.49 AuNPs-mPEG@DOX 46.12±0.49 0.38±0.04 18.60±1.51 -
如图1所示，AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的最大吸收波长分别为524、526、530 nm，随着HS-mPEG5K和HS-DOX被修饰到AuNPs上，最大吸收波长依次出现红移，表明mPEG5K和DOX通过HS键成功连接在AuNPs上。
图 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的UV-Vis光谱图
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为提高纳米载体的吸附率和载药量，考察了HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。如表2所示，随着HS-DOX的投药浓度增加，载体的吸附率和载药量都逐渐升高，当投药浓度为11.18 μg/ml时，纳米载体的吸附率和载药量达到最大值，继续提高HS-DOX的投药浓度，载药量不再上升，吸附率降低。表明HS-DOX投药浓度在11.18 μg/ml时，AuNPs表面吸附可能达到饱和，因而选择11.18 μg/ml投药浓度用于制备AuNPs-mPEG@DOX。
表 2 HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响（n=3）
HS-DOX投药浓度
（μg/ml）吸附浓度
（μg/ml）吸附率
（%）载药量
（%）2.79 0.11±0.02 3.96±0.57 0.22±0.03 5.59 0.51±0.16 9.20±2.89 1.02±0.32 11.18 1.03±0.32 9.21±2.88 2.01±0.62 22.35 0.92±0.02 4.13±0.09 1.81±0.04 -
首先考察方法专属性，实验表明，制备过程未对HS-DOX的测定产生影响（图2）。进一步考察HS-DOX的线性，得线性回归方程为y=17.884 x−5.3651，r=0.9999，证明该液相色谱方法在1.40～22.35 μg/ml浓度范围内线性良好。分别考察了1.40、5.59、22.35 μg/ml 3个低、中、高浓度的精密度，见表3，日内精密度和日间精密度均<2.0%，符合精密度要求。对照品溶液和供试品溶液在24 h内基本稳定，其RSD分别为0.78%和1.01%。HS-DOX平均加样回收率为99.06%，RSD为0.83%，回收率符合要求（表4）。结果表明，该液相方法准确可靠，可用于HS-DOX的定量检测。
图 2 HS-DOX的液相色谱图
表 3 HS-DOX 3种浓度的日内和日间精密度（n=5）
浓度
（μg/ml）日内精密度 日间精密度 $\bar x $±s RSD（%） $\bar x $±s RSD（%） 1.40 1.41±0.02 1.70 1.41±0.03 1.79 5.59 5.52±0.08 1.40 5.55±0.10 1.83 22.35 22.37±0.19 0.84 22.36±0.17 0.77 表 4 HS-DOX的加样回收率（n=3）
加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 原有量（m/μg） 回收率（%） 8.12 18.13 10.03 99.75 18.11 10.10 98.65 17.97 9.98 98.40 10.15 20.42 10.21 100.59 20.33 10.30 98.82 20.00 10.02 98.33 12.18 21.95 9.95 98.52 22.18 10.20 98.36 22.19 9.99 100.16 平均回收率（%） 99.06 RSD（%） 0.83 -
AuNPs-mPEG@DOX和DOX对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h毒性作用如图3所示，随着DOX浓度的增加以及药物作用时间延长，MCF-10A和MCF-7细胞的存活率皆降低。在相同DOX浓度下，AuNPs-mPEG@DOX比游离DOX对正常乳腺细胞MCF-10A的毒性作用明显降低，可起到减小DOX毒副作用的目的。当DOX浓度<4.75 μmol/L作用于乳腺癌细胞MCF-7时，游离DOX表现出比AuNPs-mPEG@DOX明显的细胞毒性作用；在DOX浓度≥4.75 μmol/L的情况下，AuNPs-mPEG@DOX与游离DOX表现出无差异的细胞毒性作用。结果表明将DOX修饰于AuNPs上，由于Au-S键稳定存在，以及PEG的长链保护作用，DOX与细胞的直接接触面积减小，可降低对正常细胞的毒副作用。由于肿瘤细胞的高间质液压大，尺寸较大的AuNPs-mPEG@DOX较游离DOX不易被泵回血液和细胞胞吐，在高浓度时，与DOX肿瘤细胞杀伤作用相当。
图 3 AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX分别对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h细胞毒性
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DOX在杀伤肿瘤细胞的同时也会损害机体的正常细胞，其随剂量增加会对心脏、大脑、肝脏和肾脏等器官产生不良反应。同时，它还会损害免疫系统，增加病人对病原体的易感性，削弱他们的愈合能力。本文制备了载DOX的mPEG修饰金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，粒径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV，最大吸收波长为530 nm。成功建立了可用于检测AuNPs-mPEG@DOX未吸附HS-DOX含量的HPLC方法，在HS-DOX投药浓度为11.18 μg/ml时有最大吸附率和载药量。该纳米载体能明显降低DOX对正常乳腺细胞的毒副作用，且当浓度达到一定值时，具有与游离DOX相同的肿瘤细胞杀伤作用，为后续开发AuNPs连接DOX的肿瘤治疗方案奠定了良好的基础。
纳米颗粒被认为是选择性增加肿瘤细胞内药物积累从而减少毒副作用的重要途径。AuNPs作为无机纳米颗粒的一种，因其独特性质被广泛应用于药物递送、肿瘤诊断和治疗领域。除AuNPs本身结构可降低DOX毒副作用，也可通过在AuNPs表面修饰核酸适配体[11-12]、肿瘤穿透肽[13]等有效靶向和进入肿瘤细胞，减少DOX对正常细胞的损害；或利用肿瘤部位的特殊环境，通过响应型功能键将DOX连接于AuNPs上，如低pH[14]、过表达酶[15]和高水平的GSH[16]等来调控载体尺寸大小和DOX释放，提高载药纳米颗粒在肿瘤部位蓄积量，继而提高抗肿瘤作用。此外，也可以通过将DOX和Varlitinib与PEGAuNPs结合[17]，来增强DOX对肿瘤细胞的抑制作用，降低对正常细胞的毒性。虽然利用AuNPs载DOX同时降低其毒性的策略目前已被广泛研究，但其粒径大小、表面电荷和各类形状等因素对生物分布和细胞摄取的影响，AuNPs表面有限吸附能力带来的载体量过大，以及进入细胞后的代谢途径等问题还需要进行更多的探索。
Preparation and cytotoxicity of doxorubicin-containing gold nanoparticles
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摘要:
目的 构建载阿霉素（DOX）的甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰的金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，以降低DOX的毒副作用。 方法 制备AuNPs-mPEG@DOX，通过粒径、电位和紫外可见光吸收光谱（UV-Vis）进行表征。考察连接巯基的DOX（HS-DOX）投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。建立未吸附HS-DOX含量测定的高效液相色谱法（HPLC），对专属性、线性、精密度、稳定性和加样回收率进行考察。采用CCK-8法检测AuNPs-mPEG@DOX对MCF-10A和MCF-7细胞的毒性作用。 结果 成功制备了AuNPs-mPEG@DOX，粒径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV，最大吸收波长为530 nm。建立了可用于检测AuNPs-mPEG@DOX未吸附HS-DOX含量的HPLC方法，测定最佳投药浓度11.18 μg/ml，HS-DOX条件下的吸附率为（9.21±2.88）%，载药量为（2.01±0.62）%。细胞毒性实验表明AuNPs-mPEG@DOX可明显降低DOX对正常乳腺细胞的毒副作用；DOX在≥4.75 μmol/L时，AuNPs-mPEG@DOX与游离DOX对乳腺肿瘤细胞的细胞毒性作用一致。 结论 AuNPs-mPEG@DOX可有效降低DOX的毒副作用，为后续AuNPs连接药物降低其毒副作用的研究提供参考。 Abstract:Objective To construct methoxy polyethylene glycol (mPEG) modified gold nanoparticles (AuNPs) loaded with doxorubicin (DOX) AuNPs-mPEG@DOX in order to reduce the toxicity and side effects of DOX. Methods AuNPs-mPEG@DOX was prepared and characterized by Z-Average, Zeta potential and UV-Vis spectroscopy. The impact of thiol-linked DOX (HS-DOX) at various dosage concentrations on the drug adsorption rate and drug loading of AuNPs-mPEG@DOX was investigated. Furthermore, a HPLC method was developed to accurately determine the content of unadsorbed HS-DOX in AuNPs-mPEG@DOX. The specificity, linearity, precision, stability and average recovery of this method were thoroughly investigated. The cytotoxic effect of AuNPs-mPEG@DOX on MCF-10A and MCF-7 cells was evaluated using a CCK-8 assay. Results AuNPs-mPEG@DOX was successfully prepared with Z-Average of (46.12±0.49) nm, Zeta potential of (18.60±1.51) nm and the maximum absorption wavelength of 530 nm. An efficient HPLC method for the detection of unadsorbed HS-DOX in AuNPs-mPEG@DOX was devised. The optimal dosage concentration of HS-DOX for AuNPs-mPEG@DOX was determined to be 11.18 μg/ml, resulting in a drug adsorption rate of (9.21±2.88)% and a drug loading rate of (2.01±0.62)%. Cytotoxicity experiments demonstrated that AuNPs-mPEG@DOX significantly reduced the toxic and side effects of DOX on normal breast cells. Additionally, AuNPs-mPEG@DOX and free DOX exhibited comparable cytotoxic effects on breast tumor cells when DOX concentration was equal to or greater than 4.75 μmol/L. Conclusion AuNPs-mPEG@DOX effectively reduce the toxicity of DOX, providing a reference for future research on reducing the toxicity of AuNPs-linked drugs. -
Key words:
- gold nanoparticles /
- doxorubicin /
- breast tumor /
- toxicity
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夏枯草消瘤合剂由中药夏枯草、牡蛎、生地黄、莪术、苍术、白术组成，是中医肿瘤学专家钱伯文教授的经验方。方中诸药配伍，以达化痰软坚，活血化瘀，补养气血的功效。其临床实验研究已证实，该药配合一线化疗方案治疗中晚期非小细胞肺癌患者，有助于提高患者的生存治疗和减少化疗所产生的毒副作用[1]。由该方制成的合剂在我院临床使用多年，前期研究对于组方中化学成分的研究仍限于迷迭香酸、咖啡酸的稳定性研究[2]。尽管方中一些单味药的化学成分已有报道[3-18]，但是整个复方制剂的化学成分未见报道。由于组分的复杂性，复方的成分分析比单味药更具有挑战性，明确夏枯草消瘤方色谱图中各个色谱峰归属对于该复方的质量控制及体内深入研究具有重要意义。
高效液相-高分辨飞行时间质谱（HPLC-TOF/MS）串联技术对于中药复杂体系中化学成分分析和鉴定非常有效。其灵敏度高、操作简便、耗时短，可以在短时间获得化合物准确的相对分子质量，通过与所建立的已知化学成分数据库比对，可以快速的对被测成分进行分析鉴别[19-20]。因此，本文采用HPLC-TOF/MS技术，首次对夏枯草消瘤方中化学成分进行鉴别，并且对各成分进行药材归属，以进一步阐明夏枯草消瘤方的化学物质基础。
1. 材料和方法
1.1 仪器
Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和二级管阵列检测器；Agilent 6220高分辨飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司），配有标准电子喷雾离子源（ESI）；分析软件为 MassHunter 数据采集在线工作站和Qualiative Analysis 离线分析软件。
1.2 药品与试剂
咖啡酸（批号：110885-200102，纯度>98.5%）、迷迭香酸（批号：111871-201505，纯度>98.5%）对照品，均购自中国食品药品检定研究院，甲醇和甲酸为色谱纯（Fisher，USA），其余试剂均为分析纯，水为纯水。
夏枯草、生地黄、莪术、麸炒苍术、麸炒莪术、牡蛎、煅牡蛎均由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中药房提供（见表1）。药材及饮片均经第二军医大学药学院生药学教研室黄宝康教授鉴定。
表 1 药材信息药材名称 批号 药材来源 夏枯草 180207 上海康桥药业有限公司 生地黄 180302 上海同济堂药业有限公司 莪术 180306 上海虹桥中药饮片有限公司 麸炒白术 2018031001 上海上药华宇药业有限公司 麸炒苍术 180407 上海虹桥中药饮片有限公司 牡蛎 2017102006 上海上药华宇药业有限公司 煅牡蛎 180301 上海同济堂药业有限公司 2. 方法
2.1 对照品溶液的制备
分别精密称取咖啡酸、迷迭香酸对照品3.22、5.68 mg置10 ml量瓶中，加甲醇稀释定容，配成浓度分别为322、568 μg/ml的母液，精密吸取母液 1 ml 置于 10 ml 量瓶，加甲醇定容后，即得对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取夏枯草4.2 g、牡蛎8.4 g、煅牡蛎8.4 g、地黄4.2 g、莪术4.2 g、白术（麸炒）2.1 g、苍术（麸炒）2.1 g，以上七味，充分润湿，分别加8倍量与4倍量水煎煮两次，每次煮沸后于85 ℃保温20 min，煎液滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.10以上（80 ℃），离心，取上清液；精密吸取夏枯草消瘤方溶液上清液5 ml，置于50 ml容量瓶中，加甲醇定溶，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得夏枯草消瘤方样品溶液。
2.3 色谱条件
色谱柱：ACE C18（3.0 mm×150 mm），流动相A相为甲醇，B相为水（含0.1%甲酸），梯度洗脱：0~5 min：5%A，5~10 min：5%~15%A，10~30 min：15%~45%A，30~40 min：45%~70%B，40~50 min：70%~90%B；进样量2 μl，流速为0.4 ml/min；柱温为25 ℃；运行时间为50 min。
2.4 质谱条件
采用ESI离子源，正、负离子模式均进行检测，雾化器为高纯氮气，具体参数如下：正离子模式：毛细管电压3500 V，干燥器温度350 ℃，干燥器流速10L/min，雾化器压力40 psig，碎片电压160 V；参比离子m/z121.9856，1033.9881；扫描范围m/z100-1200。测定样品之前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精度误差小于1×10-6。
2.5 夏枯草消瘤方化学成分数据库的建立
根据国内外专业数据库中科院化学专业数据库、Pubmed、Chemspider等，以及国内外相关研究文献，收集了夏枯草消瘤合剂方中六味中药化学成分名称及分子式共760个。采用安捷伦“formula-database generator”软件（含各元素精确质量数），根据各成分碳、氢、氧的个数，计算精确相对分子质量、M+H和M-H准分子离子峰相对分子质量的相应的化学成分数据库。
3. 结果和讨论
3.1 夏枯草消瘤合剂的相关图谱
夏枯草消瘤方样品溶液的总离子流图见图1。其中图1A为正离子160 V模式，图1B为负离子160 V模式，图1C为负离子260 V模式。
3.2 利用对照品鉴别化合物
实验中利用已有的2个对照品，在负离子模式、碎片电压160 V条件下，无偏差的鉴别出咖啡酸、迷迭香酸，对照品总离子流图见图2。
3.3 利用精确质量数和同位素分布鉴别化合物
正离子模式下以图1中2号峰疣孢酚为例，说明夏枯草消瘤方色谱峰的鉴别过程。保留时间为24.032 min，色谱图中的准分子离子为267.1591。利用Qualiative Analysis数据分析软件的计算功能计算精确质量数的可能元素组成（5×10−6），并比对数据库中已知化合物的质荷比，初步确定元素组成为C15H22O4，为疣孢酚的(M+H)+。计算该准分子离子的核素分布情况，从图3A可以看出同位素分布的理论值（方框所示）与实际值（方框内峰所示）吻合良好，确定此峰为疣孢酚。同理可得负离子模式下图1中18号峰，地黄苷D的解析过程（图3B）。
3.4 夏枯草消瘤合剂化学成分鉴别结果
根据飞行时间质谱测得精确的相对分子质量，比对所建立的数据库，应用Qualiative Analysis 质谱分析软件计算分子组成，将理论值与实测值进行比对，结合上述对照品鉴别结果及相关文献报道，对夏枯草消瘤合剂中药材在正、负离子模式下所得色谱图中色谱峰进行分析，初步鉴别出37个化学成分，结果见表2、表3。对于部分未见区分的同分异构体，后期可考虑调节碎片电压获得化合物的裂解规律进行区分。
表 2 夏枯草消瘤合剂中化学成分的正离子模式鉴别结果序号 相对时间（min） 化合物 分子式 M+H 实验值（m/z） 理论值（m/z） 误差（×10–6） 来源 1 19.174 7-羟基异喹啉 C9H7NO [M+H]+ 146.060 8 146.052 8 –0.72 地黄. 2 24.032 Verrucarol C15H22O4 [M+H]+ 267.159 1 267.151 8 0.06 莪术 3 28.388 白术内酯Ⅱ C15H20O2 [M+H]+ 233.153 3 233.146 3 1.49 白术. 41) 30.653 芦丁 C27H30O16 [M+H]+ 611.160 8 611.153 4 –0.27 夏枯草 51) 30.703 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 C21H20O12 [M+H]+ 465.102 9 465.095 5 –0.25 夏枯草 61) 33.713 伞形酮 C9 H6 O3 [M+H]+ 163.038 7 163.031 7 1.54 夏枯草 7 38.337 白术内酯Ⅲ C15H20O3 [M+H]+ 249.148 2 249.141 2 2.05 白术 81) 41.969 十四烷基柠檬酸 C20H36O7 [M+H]+ 389.252 9 389.246 1 1.31 白术 注：1)表示正负模式下测得 表 3 夏枯草消瘤合剂中化学成分的负离子模式鉴别结果序号 相对时间（min） 化合物 分子式 M+H 实验值（m/z） 理论值（m/z） 误差（×10–6） 来源 91) 1.999 精氨酸 C6H14N4O2 (M-H)– 173.104 3 173.111 7 0.56 地黄 101) 2.109 葡萄糖酸 C6H12O7 (M-H)– 195.051 1 195.058 3 –0.23 夏枯草 11 2.789 苹果酸 C4H6O5 (M-H)– 133.014 3 133.021 5 –0.61 夏枯草 12 2.842 柠檬酸 C7H12O6 (M-H)– 191.019 5 191.027 0 1.04 夏枯草 13 3.305 二氢梓醇 C15H24O10 (M+CHO2)– 409.134 8 409.136 9 0.88 地黄 141) 4.441 梓醇 C15H22O10 (M+CHO2)– 407.118 8 407.121 2 2.01 地黄 15 4.724 尿嘧啶核苷 C9H12N2O6 (M-H)– 243.062 2 243.069 5 0.43 地黄 16 5.869 络氨酸 C9H11NO3 (M-H)– 180.066 4 180.073 9 1.28 地黄 17 9.186 鸟苷 C10H13N5O5 (M-H)– 282.084 1 282.091 7 1.12 地黄 181) 12.586 地黄苷D C27H42O20 (M+CHO2)– 731.225 6 731.226 9 –0.57 地黄 191) 14.46 丁香酸 C9H10O5 (M-H)– 197.045 3 197.052 8 1.48 地黄 20 14.562 益母草苷 C15H24O9 (M+Cl)– 383.111 1 383.642 0.88 地黄 21 18.189 原儿茶酸 C7H6O3 (M-H)– 137.024 5 137.031 7 –0.75 夏枯草 22 19.253 2, 3-二氢 -7-甲氧基-4 -甲基 -1H-1,
5 -苯并二氮卓 -2-酮C11H12N2O2 (M-H)– 203.082 5 203.089 9 0.52 苍术 23 21.839 地黄苦苷 C16H26O8 (M-H)– 345.155 3 345.162 8 0.41 地黄 24 22.327 咖啡酸 C9H8O4 (M-H)– 179.035 1 180.049 5 –0.9 白术 251) 27.255 异迷迭香酸苷 C24H26O13 (M-H)– 521.130 8 521.137 3 –1.42 夏枯草 42) 28.487 芦丁 C27H30O16 (M-H)– 609.146 1 609.153 4 0.08 夏枯草 52) 28.61 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 C21H20O12 (M-H)– 463.088 1 463.095 5 0.26 夏枯草 261) 30.296 迷迭香酸 C18H16O8 (M-H)– 359.077 2 359.084 5 0.18 夏枯草 271) 38.237 异地黄苷 C31H40O15 (M-H)– 651.229 1 651.236 7 0.59 地黄 281) 52.394 表莪术酮 C15H28O2 (M-H)– 239.201 4 239.208 9 1.07 莪术 291) 52.687 肉豆蔻酸 C14H28O2 (M-H)– 227.201 7 227.208 9 –0.12 夏枯草 301) 52.748 熊果酸 C30H48O3 (M-H)– 455.353 455.306 3 0.17 夏枯草 311) 53.606 亚油酸 C18H32O2 (M-H)– 279.232 8 279.240 2 0.55 夏枯草 321) 53.911 软脂酸 C16H32O2 (M-H)– 255.233 4 255.240 2 –1.71 夏枯草 33 54.095 油酸 C18H34O2 (M-H)– 281.249 0 281.255 9 –1.43 夏枯草 341) 54.92 硬脂酸 C18H36O2 (M-H)- 283.264 5 283.271 5 –0.93 苍术 35 33.114 6-0-E阿魏酰基筋骨草醇 C25H32O12 (M-H)– 523.181 7 523.189 4 0.73 地黄 36 51.355 麝香草酚 C10H14O (M-H)– 149.097 1 149.104 5 0.28 夏枯草 37 54.305 11-十八烯酸- C18H34O2 (M-H)– 281.248 6 282.225 9 0.09 夏枯草 注：1)表示负模式下碎片电压160V和260V测得；2)表示正负模式下测得。 3.5 讨论
对色谱条件的摸索，考察了甲醇-水、乙腈-水系统，发现甲醇的洗脱效果优于乙腈，且各色谱峰分离效果更好，加入0.1%甲酸可以改善峰型，并提高质谱响应，故采用甲醇-0.1%甲酸水为流动相。由于本组方含有药材较多，组方内所含成分比较复杂，因此选择大梯度洗脱，以期最大程度地得到其中的化合物保留。质谱检测比较了正、负离子两种扫描模式，由于组方中所含多种化合物响应模式各有不同，因此，选择正、负离子两种扫描模式同时进行监测。对于碎片电压的选择，本方中大部分化学成分在160 V时以准分子离子峰形式稳定存在，有少量化学成分在负离子模式下260V时以准分子离子峰形式稳定存在，图谱本底较低，因此选择160 V、260 V的碎片电压可以最大限度地对复方中的成分进行鉴别。
4. 结论
本研究运用 HPLC-TOF/MS 技术快速鉴别夏枯草消瘤合剂中37种化学成分，其中正离子模式碎片电压160 V条件下8个；负离子模式碎片电压160 V条件下28个，碎片电压260 V条件下19个；正负离子均有响应4个，负离子模式两种碎片电压下均有响应16个，并对成分进行了药材归属。该方法在传统的植物化学分离提取基础上对色谱峰进一步明确化，为夏枯草消瘤方的质量控制、体内的深入研究及临床应用奠定了良好的基础。
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图 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的UV-Vis光谱图
注：1. AuNPs-mPEG@DOX；2. AuNPs；3. AuNPs-mPEG。
图 3 AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX分别对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h细胞毒性
A.MCF-10A的24 h细胞毒性；B.MCF-10A的48 h细胞毒性；C.MCF-7的24 h细胞毒性；D.MCF-7的48 h细胞毒性*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与DOX组比较。
表 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的平均粒径和Zeta电位（n=3）
纳米颗粒 平均粒径（nm） 多分散系数 Zeta电位（mV） AuNPs 28.31±0.37 0.38±0.02 −25.30±0.99 AuNPs-mPEG 43.32±1.40 0.38±0.07 −22.20±0.49 AuNPs-mPEG@DOX 46.12±0.49 0.38±0.04 18.60±1.51 
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表 2 HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响（n=3）
HS-DOX投药浓度
（μg/ml）吸附浓度
（μg/ml）吸附率
（%）载药量
（%）2.79 0.11±0.02 3.96±0.57 0.22±0.03 5.59 0.51±0.16 9.20±2.89 1.02±0.32 11.18 1.03±0.32 9.21±2.88 2.01±0.62 22.35 0.92±0.02 4.13±0.09 1.81±0.04
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表 3 HS-DOX 3种浓度的日内和日间精密度（n=5）
浓度
（μg/ml）日内精密度 日间精密度 $\bar x $ ±sRSD（%） $\bar x $ ±sRSD（%） 1.40 1.41±0.02 1.70 1.41±0.03 1.79 5.59 5.52±0.08 1.40 5.55±0.10 1.83 22.35 22.37±0.19 0.84 22.36±0.17 0.77
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表 4 HS-DOX的加样回收率（n=3）
加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 原有量（m/μg） 回收率（%） 8.12 18.13 10.03 99.75 18.11 10.10 98.65 17.97 9.98 98.40 10.15 20.42 10.21 100.59 20.33 10.30 98.82 20.00 10.02 98.33 12.18 21.95 9.95 98.52 22.18 10.20 98.36 22.19 9.99 100.16 平均回收率（%） 99.06 RSD（%） 0.83
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