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白血病是一类由造血干细胞恶性增殖引起的以出血、贫血、感染、不同程度的肝、脾、淋巴结肿大等为症状的造血系统恶性肿瘤[1]。目前，化疗是白血病治疗的重要手段，但复发率高、预后差、易产生耐药性等情况使得其对白血病的治疗效果大大折扣[2-3]。因此，寻找低毒、高效的治疗药物来提高疗效并降低复发率是治疗白血病的关键[4-5]。中医古籍中无白血病病名，但据其临床特点，应归属于“急劳”“热劳”“髓劳”“血证”“髓枯”“虚劳”等范畴[6]，由正虚邪实导致形成本虚标实之证。中药有可改善症状、减低化疗后毒副反应等特点，在白血病的治疗方面具有独特优势[7]。
定清片是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院（本院）血液科黄振翘教授、周永明教授在“扶正祛邪”理论指导下，经多年潜心研究，逐步改良而成的一种治疗白血病的有效制剂，由雄黄、黄芩、人工牛黄、栀子、陈皮、冰片等12味药组成[8]。方中诸药配伍，共奏益气养阴、清解邪毒之功，使标本得治、虚实共调。定清片在临床使用中取得了很好的疗效，在临床上定清片联合化疗治疗急性髓系白血病患者的西医疗效总有效率为80.0%，中医证候疗效总有效率为93.34%，缓解率66.7%，高于化疗治疗，还可显著改善患者临床症状，减轻化疗引起的常见毒副反应[9-10]。实验表明，定清片在体外能抑制人白血病HL-60细胞增殖，其作用机制可能与影响细胞周期和诱导细胞凋亡相关[11]，但其具体作用机制尚不明晰，需要进一步研究。
本研究利用网络药理学及分子对接技术，探讨定清片治疗白血病的活性成分和作用靶点，以期阐明其可能的作用机制，为定清片用于白血病的临床治疗提供理论依据。
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本研究通过检索TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以OB≥30%，DL≥0.18[12] 作为筛选条件选出定清片的有效成分及对应的靶点信息。对于TCMSP数据库没有的中药，通过HERB数据库（http://herb.ac.cn/）筛选成分，在Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载有效成分的2 D结构，并在SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）中输入有效成分的2 D结构进行检索，以“Probability>0.1”为条件对靶点进行筛选。最后利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将筛选到的靶点转换为对应的标准基因名。
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在OMIM（https://www.omim.org/）、DisGeNET （https://www.disgenet.org/）和GeneCards（http://www.genecards.org/）数据库，以关键词“Leukemia”进行检索，获取白血病相关疾病靶点，在Venny2.1在线平台导入药物与疾病靶点，绘制药物-疾病共有靶点韦恩图，获得定清片治疗白血病的潜在靶点。
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将药物、活性成分、疾病靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-疾病靶点” 网络图。
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将共有靶点导入 String 数据库（https://cn.string-db.org），种属选择“homo sapiens”，设置置信度为0.4，隐藏游离节点，其他参数保持默认设置，输出后将结果导入Cytoscape软件构建PPI网络，应用MCODE插件，识别密集连接的网络特征，进一步筛选核心靶点群落。
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将物种设置为“homo sapiens”，利用DAVID数据库（https://david-d.ncifcrf.gov/）， 进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。富集结果以P<0.05为标准进行筛选，通过微生信在线软件（http://www.Bioinformatics.com.cn/）进行数据可视化处理。
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用RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点的蛋白结构，借助Pymol软件去除蛋白的水分子和小分子配体。通过Pubchem数据库获取成分的3 D结构，运用OpenBabel-3.1.1软件将小分子结构转换为mol 2格式。再通过AutoDock vina软件对小分子配体和蛋白受体进行预处理并进行分子对接，得到靶点蛋白和化合物对接的最低结合能，运用Pymol软件将对接结果进行可视化。
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定清片由12味药组成，通过数据库搜集共获得82个活性成分及439个作用靶点。通过疾病数据库得到白血病相关靶点1 878个，将疾病靶点与活性成分靶点进行交集，绘制韦恩图（图1），得到169个共有靶点。将这169个共有靶点导入Cytoscape中，删除与靶点无交集的孤立成分后绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络图（图2），共获得249个节点、712条边。根据网络的拓扑分析，筛选出度值较大的活性成分有槲皮素（97）、桑黄素（78）、山柰酚（75）、木犀草素（61）、川陈皮素（33）、汉黄芩素（20）和柚皮素（17）等，这些度值较大的化合物可能是定清片治疗白血病的潜在活性成分。
图 1 药物-疾病靶点韦恩图
图 2 定清片治疗白血病的药物-成分-靶点网络
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将169个共有靶点导入STRING数据库，将得到的文件导入Cytoscape软件进行可视化处理（图3A），获得PPI网络图。通过分析可知网路中共有162个节点（靶点蛋白）、1 817条边（蛋白相互作用），颜色由深变浅代表度值由大变小。按照度值大小排名靠前的靶点有TP53、AKT1、CASP3、STAT3、TNF、MYC、EGFR、JUN、BCL2等，选取度值最高的靶点绘制核心靶点PPI网络图（图3B），这些可能是定清片治疗白血病的关键靶点。
图 3 定清片治疗白血病共有靶点的PPI网络与核心靶点网络
为进一步探究靶点间的集落关系，对PPI网络开展MCODE子簇分析，得到评分最高的4个基因簇（图4）。其中基因簇1包含31个靶点，2含27个，3含7个，4含8个。评分最高的基因簇1中包含了31个关键靶点，有FOS、IL-2、EGFR、TP53、ICAM1、MAPK3、MAPK14、IFNG、TGFB1、MYC、NFKBIA、HIF1A、CREB1、ESR1、BCL2、TNF、IL-10、AKT1、IL-6、IL-1B、MMP9、CCL2、JUN、CXCL10、PTGS2、IL-4、VCAM1、STAT3、IL-1A、CASP3、CXCL8。
图 4 富集分子复合物检测（MCODE）分析中排名前4位的基因簇
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为聚焦核心靶点的相互作用，对基因簇1中的31个关键靶点进行GO和KEGG通路富集分析，最终得到GO富集条目431条。其中，生物过程（BP）368条，细胞组成（CC）19条，分子功能（MF）44条。通过GO富集分析发现，BP主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正调控、炎症反应、细胞凋亡过程的负调控等；CC主要包括细胞外间隙、转录因子复合物、大分子复合物等；MF主要包括酶的结合、细胞因子活性、相同蛋白质结合等（图5）。KEGG信号通路有138个条目，相关通路主要有TNF信号通路、IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化和癌症信号通路等（图6）。
图 5 定清片作用靶点的GO富集分析
图 6 定清片作用靶点的KEGG通路富集分析
为进一步探究其作用机制，以KEGG分析获得的TNF、IL-17信号通路为重点研究对象，探讨药物、活性成分、核心靶点的关系。通过分析发现，信号通路中包含的核心靶点有7个，分别为AKT1、CASP3、MMP9、TNF、JUN、IL-6、MAPK3。这7个核心靶点与定清片中相关活性成分对应，构建活性成分-关键靶点-通路网络（图7），包括36个节点和75条边。核心靶点对应得到的13个活性成分为:槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、刺槐素、β-谷甾醇、汉黄芩素、吴茱萸次碱、川陈皮素、桑黄素、睾酮、黄芩素、芒柄花素等。这些成分存在于黄连、太子参、黄芩、黄柏等8味药材中，通过调控核心靶点参与了TNF与IL-17信号通路的调节，可能在定清片治疗白血病的过程中发挥重要作用。
图 7 子网络A的药物-成分-靶点-通路图
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采用分子对接技术，选择药物-疾病共有靶点和基因簇1的“药物-成分-靶点-通路”网络图中节点度值最高的核心靶点蛋白，包括TP53、AKT1以及MMP9、CASP3和TNF，与排名靠前的活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、刺槐素和柚皮素（图8）进行分子对接分析。化合物与靶点的结合能越低，表明其可能有更好的相互作用。从表1的结合能结果可知，定清片中的活性成分与核心靶点蛋白有一定的相互作用，例如槲皮素，与多个靶点的结合能均小于−20.93 kJ/mol，被认为可能有较好的结合性，其中与AKT1的结合能最低（−41.03 kJ/mol），表明其与AKT1的结合能力最强，槲皮素可能与蛋白上的TYR-272、ASN54、GLN79、THR211残基通过氢键等相互作用（图9），其他活性成分均与对应的大分子蛋白上的关键残基存在相互作用，对接可视化结果见图9。这些结果提示，定清片中的多种化合物成分与白血病的相关核心靶点有良好的亲和性。
图 8 定清片主要活性成分的化学结构式
表 1 分子对接结果
活性成分 结合能（kJ / mol） MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 
图 9 分子对接示意图
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定清片是本院黄振翘教授和周永明教授通过多年临床实践拟定的经验方，对白血病的疗效得到了普遍认可。其由12味中药组成，每味药物中又有许多不同的化合物。且其对白血病治疗的作用机制尚未阐明。
白血病的发病机制涉及多种因素，不同的药物治疗针对不同的通路和机制发挥作用[13]。本研究通过网络药理学分析，筛选出可能在定清片防治白血病的作用机制中具有重要作用的5个核心靶点。其中，肿瘤抑制基因TP53是人类癌症中最常见的突变基因之一，也是包括血液系统恶性肿瘤在内的许多恶性肿瘤研究的重要预后指标。其编码产生的p53蛋白与细胞周期的调控、细胞凋亡和衰老等重要的生物学功能息息相关，通过抑制细胞的生长，预防癌症的发展[14-15]。在分子对接实验中，刺槐素与p53蛋白有较好的亲和性。已有研究表明，刺槐素能通过结合RARγ，靶向调控AKT-p53信号通路，诱导癌细胞凋亡[16]；但其是否能直接作用于p53从而调控下游生物学功能尚需实验证实。丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）在细胞存活、细胞周期、侵袭和代谢的调节中发挥作用。研究表明，包括白血病在内的多种癌症都伴有AKT信号的失调，在急性白血病中经常发现AKT的持续激活和磷酸化水平的显著升高。AKT1与PI3K、PTEN和mTOR等构成的重要信号通路对维持细胞存活和凋亡之间的平衡具有重要作用[17]，且AKT1会影响来自胸腺的调节性T细胞的增殖能力[18]。研究发现，定清片中的槲皮素与多个核心靶点均有较好的亲和力，其与AKT的相互作用可能最强。已有多项研究表明，槲皮素可用于白血病的治疗，是一种有应用前景的抗肿瘤药物。槲皮素可通过调节CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路诱导HL-60细胞凋亡和自噬[19]，还能克服癌细胞的耐药性[20]。但槲皮素治疗白血病是否与AKT通路有关，有待进一步研究。在药物-靶点网络中显示与白血病靶点密切相关的化合物，如木犀草素、山柰酚和柚皮素等，都可能是定清片治疗白血病的关键化合物。
聚类分析结果显示，定清片治疗白血病的作用机制可能与TNF信号通路和IL-17信号通路有关。TNF参与白血病发生发展的所有过程，包括细胞转化、增殖、血管生成和髓外浸润等，并且在急性髓性白血病患者外周血中，调节性T细胞的增殖依赖于TNF受体通路[21]。而对慢性淋巴细胞白血病（CLL）、免疫功能紊乱和肿瘤细胞生存期延长是病情进展的重要诱因之一。在CLL早期，存在机体Th细胞免疫系统失衡，其中Th2细胞活化、嗜酸性粒细胞聚集，促进慢性炎症的发生，致使IL-17水平升高，最终导致CLL进展，预后欠佳[22]。IL-17诱导炎性细胞因子（如TNF-α和IL-6）和趋化因子（CXCL1、CXCL2）的持续产生，从而促进急性髓性白血病（AML）的发生发展[23]。在B细胞急性淋巴细胞白血病中，Th17细胞分泌的IL-17A水平明显升高，其通过激活Akt 信号通路显著促进细胞的增殖，提高柔红霉素的耐药性[24]。这些研究均表明，TNF信号通路和IL-17信号通路在白血病的发生发展中有重要作用，药物对这些通路发挥调控作用可能是其治疗白血病和改善耐药性的作用机制。
综上所述，本研究基于网络药理学方法，对定清片中的12味药材进行有效成分和作用靶点的筛选，构建了药物成分-疾病-靶点网络图，并通过对关键子网络核心靶点的富集分析，探索其治疗白血病的主要通路。定清片中的主要有效成分如山柰酚、槲皮素、木犀草素、柚皮素、刺槐素等，可能通过与核心靶点TP53、AKT1、MMP9、CASP3和TNF等的相互作用，调控TNF、IL-17等信号通路，从而发挥对白血病的治疗作用。本研究围绕中药复方多种药物成分、多靶点的基本分析策略，验证了“定清片”的有效性和科学性，为其在临床的推广应用提供了一定的理论依据。
Mechanism of effective ingredients of Dingqing tablets in the treatment of leukemia based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:
目的 探讨定清片治疗白血病的药理作用机制。 方法 检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、本草组鉴平台（HERB），收集定清片的活性成分；利用SwissTargetPrediction数据库预测其作用靶点。利用GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取疾病靶点，将药物与疾病的共有靶点导入String网站，构建共有靶点蛋白相互作用（PPI）网络，并利用MCODE插件筛选核心子网络。利用DAVID数据库中对评分最高的基因簇1基因进行GO和KEGG富集分析，构建“成分-靶点-通路”网络；利用AutoDock对定清片的活性成分和核心靶点进行分子对接，并对其结果进行可视化分析。 结果 数据库检索共获得定清片活性成分82个及其作用靶点439个，白血病相关靶点1 878个，活性成分和疾病的共有靶点169个。由度值推测定清片中发挥作用的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚等，而PPI核心网络表明其治疗白血病的关键靶点主要包括TP53、MMP9、TNF、AKT1、CASP3等；子网络的基因富集分析及“成分-靶点-通路”网络图显示定清片可能通过调节TNF、IL-17等信号通路来发挥对白血病的治疗作用。分子对接结果显示活性成分与靶点间有较强的结合活性。 结论 定清片的活性成分可能通过调控TP53、AKT1和CASP3等基因参与TNF、IL-17等信号通路，从而发挥对白血病的治疗作用。 Abstract:Objective To explore the material basis and mechanism of the Chinese medicine Dingqing tablets in the treatment of leukemia. Methods The potential active ingredients of Dingqing tablets were retrieved through TCMSP and HERB Database and the targets of herbs were screened by Swiss TargetPrediction databases. The treatment targets of leukemia were searched from the GeneCards, OMIM and Disgenet databases. The protein-protein interaction network was used to construct the interactive target regulation function of Dingqing tablets and leukemia by STRING software, and the core subnetworks were filtered by the MCODE plug-in. A component-target pathway network was constructed by GO and KEGG enrichment analysis of the highest scoring Gene cluster 1 gene in the DAVID database. Molecular docking of the active components and core targets of Dingqing tablets was performed by AutoDock and the results were visualized. Results A total of 82 active ingredients and 439 targets of action of Dingqing tablets, and 1 878 leukemia-related targets were obtained through database retrieval, in which 169 common targets of active ingredients and diseases were mapped. Based on the degree values, the main active ingredients were determined as quercetin, luteolin, kaempferol, etc. The PPI core network indicated that the key targets for treating leukemia included TP53, MMP9, TNF, AKT1, CASP3, etc. The gene enrichment analysis of sub-networks and the component-target pathway network diagram showed that Dingqing tablets might exert therapeutic effects on leukemia by regulating signaling pathways such as TNF and IL-17. The molecular docking results showed fairly strong binding activity between the active ingredients and the targets. Conclusion The active ingredients of Dingqing tablets may participate in TNF, IL-17, and other signaling pathways by regulating genes such as TP53, AKT1, and CASP3, thereby exerting therapeutic effects on leukemia. -
Key words:
- Dingqing tablets /
- leukemia /
- network pharmacology /
- molecular docking /
- mechanism
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药物利用研究（DUR）是促进用药安全、有效和经济的重要手段[1]。随机对照临床试验（RCT）作为评价药物安全性、有效性的金标准，在外推至日常诊疗环境时往往面临挑战。作为RCT的重要补充，真实世界研究（RWS）考察日常诊疗环境中产生的真实世界数据（RWD），注重评价药物使用的“安全性”和“有效性”，已经成为药物利用研究的热点[2]。RWS着眼于应用到医疗实践环境中，大大缩短了试验周期、降低了成本，真实世界实效性临床研究更加易于获取全面的病例数据，使其结果更具有可靠性及可行性[3]。应当正确认识两者关系，将两者作为互补且相辅相成的研究方法和手段来为药物利用评价和监管评价等方面提供循证支持[4-7]。
随着医院管理信息系统（HIS）的高速发展以及高新传感器技术在生物医疗领域探索运用，使得逐步精准化、数字化患者的各项检查及健康诊疗数据成为现实，并进一步完善患者诊疗、实验室检查以及用药信息等全生命周期的医疗记录，且便于追溯及交互关联[2]。尽管数据库技术及大数据挖掘服务于药物安全性、有效性等方面研究成为现实，但应用于DUR尚缺乏具体的技术指导方案、自然流程等。本研究借鉴国内外RWS在药品器械上市后适应证开发及安全性评价方面的做法，梳理DUR中RWS有效技术手段和方法路径，为RWS更好的服务于DUR提供借鉴和参考。
1. 相关概念
DUR是按照预定的标准，评价、分析和解释一个给定的医疗卫生制度下药物利用的模式、质量、影响因素和结果，着重于药物的市场销售、分配、处方和使用情况，强调由此产生的医疗、社会和经济方面的结果。广泛应用于药物流行病学、抗菌药物管理、药物监测、药物警戒等方面的研究。2020年4月，国家药监局发布《真实世界证据支持药物研发与审评的指导原则（试行）》[8]，对RWD、真实世界证据（RWE）以及RWS等概念做了相关阐述[8-9]。RWS作为实现从RWD到RWE的有效手段，是连接两者的桥梁[10]。然而，大规模的数据并不一定就能产生有价值的证据，只有通过适用性评估的RWD、分析得出医疗产品的使用和潜在收益或风险的临床证据时才有可能使数据转变为证据[11-12]。数据适用性即从数据使用者角度出发，评价数据满足使用者需求的程度[13]，强调数据质量在开展相应RWS方面的可应用程度[14]。
2. 真实世界药物利用研究现状
2.1 真实世界研究与药物利用研究结合现状
国家药品监督管理局自2014年起就陆续出台多项措施，支持RWS用于医疗器械评价、药物审评、研发及监管决策，完善医疗器械不良事件监测和再评价制度，并联合高校、医联体推进多项试点工作的开展，出台了《真实世界研究支持儿童药物研发与审评的技术指导原则（试行）》[15]等法规文件以推进RWS。目前RWS主要集中在以下3个方面：①药物治疗效果[16-17]，RWS在药物疗效、不良事件、安全可靠方面的结果研究，以满足药物对人类临床应答的解释以及推广方面应用；②指南或临床实践[18-20]，国内外权威的指南是临床实践的重要参考依据，RWS也可用于协助制定和修订患者治疗方案，而RWE有利于指南更加科学性和具有实践性。此外，RWS还可以用于协助政府部门管理的指导性文件的制定；③经济效益[21-23]，RWS应用于卫生经济学中筛选研究和治疗选择等方面，帮助医师制定最优的药物治疗方案，并提供合理的经济成本。此外，RWS在帮助制定个性化医疗政策方面也具有很大的潜力。
2.2 真实世界研究体系现状
国际上，随着药品审评和监管标准的不断提高，越来越多的研究者重视RWS，目前已经形成了良好的研究体系，比如美国的以患者为中心的结局研究所（PCORI）和欧盟临床试验公共注册和结果数据库（EUPAS）。RWS主要集中于：①在研究用药的随机对照试验、观察性研究及实践指南中的应用；②在疾病的发病风险评估、医疗健康保险的应用。目前国内的RWS主要涉及：①在中医方面的应用研究[24-26]，包括中药的药物疗效及不良反应的研究；②基于医院信息数据库疾病及其合并疾病的用药特征的分析；③在医疗大数据及循证医学方面的应用[27-29]。
RWS的研究设计和方法学也不断完善，近年来不少国家或国际组织都陆续出台关于RWS的指南以及指导原则，提高了RWS的质量和可靠性，比如美国 FDA[30-31]、欧洲EMA[32]，英国NICE[33]。
3. 真实世界研究在药物利用研究中的应用
3.1 真实世界药物利用研究的方法
3.1.1 数据来源及研究问题
RWS收集真实诊疗数据或者基于已经存在的研究型数据库或数据研究平台，建立登记数据库，针对具体研究问题，运用循证医学方法，开展数据分析，从而回答验证假设[34-36]。RWD通常来自于以上一个或多个数据库，包含需要主动收集的数据以及常规诊疗行为产生的临床数据。随着医学大数据的快速发展，一些研究型数据库或数据研究平台也逐步拓展，目前，国内外利用公共数据库如SEER、MIMIC等进行相关研究已成为RWS的重要发展方向。
RWS通常基于研究目的建立研究数据库或数据集，研究要素一般包含目标患者人口学特征、用药信息、门诊、住院信息、实验室检查、治疗转归与结局，以及其他研究目的所涉及到的临床治疗、护理、手术处置等信息。如果数据来自多个不同数据库，还必须通过如患者身份证号码、住院号/检查号、姓名等患者唯一标识码进行辨识和数据关联。如果研究的资料内容涉及到患者的个人信息等情况，还要注意取得伦理学审核以及保护患者隐私[37-41]。真实世界DUR的药品数据通常通过ATC编码来规范，采用用药依从性，限定日剂量（DDD）、平均治疗天数（ATD）、总DDD数、处方年费用等DUR指标[42]。基于药物效果和安全性研究、经济学和药物政策、多个疾病和多个治疗方案的复杂病情分析是当前真实世界药物利用研究的一个热点。
RWS作为一项非随机、开放性、不使用安慰剂的研究。为了挖掘真实的临床医疗环境产生的诊疗数据，应把质量控制作为全局指标来进行把握，并从研究伊始就建立起全面的数据质量控制方案并严格遵守。同时，在研究中详细记录异常情况[43]，还要注意数据清洗以及混杂因素的控制，如此才能保证研究证据的质量及等级[44]。
3.1.2 研究人群及纳排标准
RWS人群纳入条件较为宽松，但仍在研究中需要明确与研究目的相关或可能影响研究的因素，以及纳入及排除标准的研究时间段和制定日期。研究通常通过WHO国际疾病分类（ICD-9/10）筛选研究人群。研究人群通常为患有特定疾病的患者、药物使用者（罕见病、孕妇、儿童等）以及患有多种疾病的复杂病例或有多种伴随症状的人群。有时候为解决研究对象以往接受过某种治疗措施可能导致的选择偏倚，还需要考虑遵照首次用药人群的设计[45]。最后，研究者需谨慎纳入和排除标准，以免直接影响研究结果的外推。
研究者应当严格参照PICOTS原则明确的6个关键点（总体、干预、比较对象、结果、时间和场所），同利益相关者一同提出针对研究问题可利用的科学方法[46]。
3.1.3 真实世界药物利用研究设计
观察性研究设计是RWS中广泛使用的设计类型之一[44]，常见的有前瞻性观察研究[47]、回顾性队列研究[18,48]、Meta分析[49]等。根据不同的研究目的和研究对象，可以选择适合的研究方法和样本来源，通常需要开展大规模、跨学科的合作，以确保研究结果的可靠性和科学性。RWS设计时要结合研究目的来具体确定研究要素，综合考虑年龄、混杂偏倚和特殊人群、药品ATC编码，以及病历等非结构化数据。设计通常包括以下几个阶段：①定义问题：在研究开始之前明确研究的目的和问题，确定研究的对象、变量和数据采集方式。需要考虑研究的可行性、科学性和意义。②研究设计：根据定义的问题，制定设计方案。明确设计类型、样本容量、数据采集方式、结局指标以及数据分析方法等。③招募研究对象：确定研究对象的选择标准，并依照这些标准进行样本招募。④数据收集和管理：采集所需的研究数据，将收集到的数据进行规范化、清洗、质量控制和审查等处理。⑤数据分析：使用统计学方法进行数据分析，包括描述性统计、回归分析、生存分析和成本效益分析等。⑥结果解释和推广：将研究结果进行整合、解释和推广，发表研究报告和文章，向目标受众，如医师、政策制定者、患者和公众等，传达研究结论和建议。
3.1.4 特征变量及评价指标
RWS设计阶段应该充分了解现有数据的优缺点，并恰当合理的定义并描述暴露因素，尽可能的收集与暴露相关的特征指标。RWS结局指标是评估一种治疗或干预措施在真实医疗实践中的效果和安全性以及相关临床和经济结果的指标。
通常有以下几种结局指标：①主要疗效结局：主要的成果、结果或效果指标。例如，治疗效果、复发率、临床终点事件；②次要疗效结局：主要疗效结局之外的其他疗效结果或事件。如总体存活率（OS）、无进展生存期（PFS）、无病生存期（DFS）、疾病进展时间（TTP）、治疗失败时间（TTF）、死亡率，住院时间等[50]；③安全性结局[12,51]：一般采用药物不良反应（ADR）、不良反应发生率（IRs，通常以1000人/年表示）[12]、危险性信号、药物相互作用等；④经济学结局[52-53]：包括成本效益和成本效用评估、日均费用、医疗保险、社会资源利用及患者的自付费用等。
选取结局指标时需要根据研究目的和研究对象，进行目标导向和可行性评估。常规首选应该是临床意义明确和易于全面评估的主要疗效结局，同时可以考虑次要疗效结局和安全性结局作为辅助评估。为综合评估治疗效果和成本并获得系统的经济评估结果，相关经济学方面的评价指标也应该考虑进来。
3.2 统计及敏感性分析
通常对目标患者群体和治疗模式进行描述性统计分析，分析各分类变量的频率、百分比，以及在连续区间尺度上测量的变量平均值、标准差、中位数及范围，有学者应用Kaplan-Meier（KM）生存函数进行相关生存分析[54]。针对研究目标确定分析要素，选用合适的统计分析方法，如卡方检验、logistic回归和多元线性回归等，对治疗结局、暴露因素、协变量数据类型及分布情况进行校正分析。由于所有研究结果基于假设提出，而这些假设往往是推论真实性的依据。研究者需对数据的局限性和问题本质有清晰认识，研究过程中对假设进行调整，评价观察结果对特定假设的敏感度或方向大小上的一致性。
3.3 混杂因素及偏倚控制
3.3.1 混杂因素
RWD来源包含电子病历、医保数据库、生命体征记录、医学图像等，存在许多复杂的混杂因素。混杂因素可能的类型包括个体基线特征、随时间变化的特征、医疗诊断和治疗、环境因素。常见的混杂控制策略包括随机对照、匹配分析、协变量校正、倾向值和剂量反应模型等。除此之外，在实施RWS时，还要注意有代表性的样本选择，对数据质量和分析偏倚进行评估和控制，以获得准确和可靠的研究结论。
3.3.2 偏倚控制
RWS是在真实临床环境下进行的研究，目标人群的治疗措施因非随机分配影响内部真实性，虚弱个体治疗措施与结局之间的关联性等，使得其研究结果可能存在一定的偏倚，这些偏倚可能影响研究的可靠性和有效性。常见的偏倚类型包括选择性偏倚、信息偏倚[55]、报告偏倚、记忆偏倚等，常见的偏倚控制方法有模拟试验、设计分层、倾向值匹配、重复量表、级联分析等。
4. 展望
真实世界DUR作为一种新兴的药物评价方法，可将从真实世界环境下收集和分析的大量数据利用起来，通过实效性、回顾性研究使得过往产生的既有诊疗数据进一步提炼成RWE而二次利用。通过研究分析获得的循证医学证据，可以为DUR提供有价值的依据，帮助优化药物使用、个体化医疗、提高患者结局、降低医疗费用、促进医学的健康发展；也可采用前瞻性研究大样本或特殊人群，为其更好、更安全有效用药提供证据。
同时，RWS也是评价药物滥用的有效手段。随着大数据和医疗技术的不断发展，RWS将会成为药物治疗效果、患者治疗策略和临床实践方面重要的研究领域，并将不断地推动医药的创新、优化和进步。
值得注意的是，RWS是一项复杂的研究工作，需要具备较强的统计、数据挖掘和医学知识背景，同时也面临着数据质量、缺失值、样本匹配和结果影响因素多等问题。因此，在实施RWS时，需要有效的科学设计、广泛报告，同时进行敏感度分析和可能存在的偏差分析，为制定更加科学和有效的药物治疗方案提供科学支持。
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表 1 分子对接结果
活性成分 结合能（kJ / mol） MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 
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[1] KANTARJIAN H M, KEATING M J, FREIREICH E J. Toward the potential cure of leukemias in the next decade[J]. Cancer, 2018, 124(22):4301-4313. doi: 10.1002/cncr.31669 [2] BÁRCENAS-LÓPEZ D A, MENDIOLA-SOTO D K, NÚÑEZ-ENRÍQUEZ J C, et al. Promising genes and variants to reduce chemotherapy adverse effects in acute lymphoblastic leukemia[J]. Transl Oncol, 2021, 14(1):100978. doi: 10.1016/j.tranon.2020.100978 [3] ZHAO Y J, WANG Y, MA S G. Racial differences in four leukemia subtypes: comprehensive descriptive epidemiology[J]. Sci Rep, 2018, 8(1):548. doi: 10.1038/s41598-017-19081-4 [4] 王卫东, 何小花, 杨庆敏, 等. 治疗急性髓系白血病的中药活性成分研究进展[J]. 时珍国医国药, 2021, 32(6):1444-1449. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2021.06.46 [5] CHEN Y, WANG T T, DU J, et al. The critical role of PTEN/PI3K/AKT signaling pathway in shikonin-induced apoptosis and proliferation inhibition of chronic myeloid leukemia[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 47(3):981-993. doi: 10.1159/000490142 [6] 李海霞, 姚旭, 田雪飞, 等. 中医药治疗白血病的研究进展[J]. 中医药导报, 2019, 25(12):119-123. [7] 王新梅, 罗静, 田林涛, 等. 中药联合化疗治疗急性髓细胞白血病[J]. 中医学报, 2018, 33(11):2069-2071. [8] 陈珮. 黄振翘治疗慢性淋巴细胞白血病的经验[J]. 北京中医, 2004, 23(4):209-210. [9] 郑丹丹, 孙伟玲, 周永明. 定清片联合化疗治疗急性髓系白血病临床观察[J]. 陕西中医, 2016, 37(6):688-689. [10] 李昌桂, 李晓靖, 朱文伟, 等. 定清片治疗正虚毒蕴证急性髓系白血病患者的临床疗效[J]. 时珍国医国药, 2022, 33(8):1922-1924. [11] 孙伟玲, 郑丹丹, 周永明. 定清片对人急性髓系白血病HL-60细胞侵袭力的影响[J]. 西部中医药, 2018, 31(6):10-12. [12] GUO W, HUANG J H, WANG N, et al. Integrating network pharmacology and pharmacological evaluation for deciphering the action mechanism of herbal formula Zuojin pill in suppressing hepatocellular carcinoma[J]. Front Pharmacol, 2019, 10:1185. doi: 10.3389/fphar.2019.01185 [13] 王卫东, 王绮昀, 艾丽丝, 等. 急性髓系白血病发生机制研究进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2021, 43(7):1523-1535. [14] LIEBL M C, HOFMANN T G. The role of p53 signaling in colorectal cancer[J]. Cancers(Basel), 2021, 13(9):2125. [15] WANG Q H, LI M L, YANG M, et al. Analysis of immune-related signatures of lung adenocarcinoma identified two distinct subtypes: implications for immune checkpoint blockade therapy[J]. Aging, 2020, 12(4):3312-3339. doi: 10.18632/aging.102814 [16] ZENG W J, ZHANG C Y, CHENG H W, et al. Targeting to the non-genomic activity of retinoic acid receptor-gamma by acacetin in hepatocellular carcinoma[J]. Sci Rep, 2017, 7(1):348. doi: 10.1038/s41598-017-00233-5 [17] WIESE W, BARCZUK J, RACINSKA O, et al. PI3K/akt/mTOR signaling pathway in blood malignancies-new therapeutic possibilities[J]. Cancers, 2023, 15(21):5297. doi: 10.3390/cancers15215297 [18] OUYANG S, ZENG Q M, TANG N, et al. Akt-1 and Akt-2 differentially regulate the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by controlling proliferation of Thymus-derived regulatory T cells[J]. J Immunol, 2019, 202(5):1441-1452. doi: 10.4049/jimmunol.1701204 [19] XIAO J, ZHANG B, YIN S M, et al. Quercetin induces autophagy-associated death in HL-60 cells through CaMKKβ/AMPK/mTOR signal pathway[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2022, 54(9):1244-1256. [20] MARQUES M B, MACHADO A P, SANTOS P A, et al. Anti-MDR effects of quercetin and its nanoemulsion in multidrug-resistant human leukemia cells[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2021, 21(14):1911-1920. doi: 10.2174/1871520621999210104200722 [21] ZHOU X X, LI Z Y, ZHOU J F. Tumor necrosis factor α in the onset and progression of leukemia[J]. Exp Hematol, 2017, 45:17-26. doi: 10.1016/j.exphem.2016.10.005 [22] PUZZOLO M C, DEL GIUDICE I, PERAGINE N, et al. TH2/TH1 shift under ibrutinib treatment in chronic lymphocytic leukemia[J]. Front Oncol, 2021, 11:637186. doi: 10.3389/fonc.2021.637186 [23] QIAN Y C, KANG Z Z, LIU C N, et al. IL-17 signaling in host defense and inflammatory diseases[J]. Cell Mol Immunol, 2010, 7(5):328-333. doi: 10.1038/cmi.2010.27 [24] BI L X, WU J Q, YE A F, et al. Increased Th17 cells and IL-17A exist in patients with B cell acute lymphoblastic leukemia and promote proliferation and resistance to daunorubicin through activation of Akt signaling[J]. J Transl Med, 2016, 14(1):132. doi: 10.1186/s12967-016-0894-9 -
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