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成纤维细胞的增殖和活化引起的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的累积是肺纤维化的主要病理基础[1]。肺纤维化治疗难度大，且发展到晚期纤维化过程不可逆转，而一些药物的长期使用会提高肺纤维化的发生风险，对于这临床的一类并发症应格外重视。来氟米特（leflunomide，LEF）是治疗类风湿性关节炎的常用药物，但是有临床报道称，长期服用LEF可能提高肺纤维化的发生风险，但是也有研究认为LEF对肺纤维化影响不大[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）长度约为18~22个核苷酸，虽然不具备编码功能，但是可通过识别和碱基配对的方式与靶基因信使RNA（message RNA，mRNA）的3'非翻译区（3'UTR）结合，从而参与基因表达的调控[3]。miR-449a具有抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡的作用[4]，并且最新研究发现miR-449a可能与肺纤维化有关，在二氧化硅诱导的肺纤维化模型中，miR-449a可通过调节自噬缓解纤维化[5]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是调节细胞增殖、凋亡和分化的重要蛋白，其磷酸化后可通过信号转导调控细胞生物学行为[6]。本文发现了miR-449a的过表达会显著缓解由LEF引起的肺成纤维细胞的增殖，而沉默miR-449a对细胞的影响相反，这可能是LEF引起肺纤维化的机制之一，报道如下。
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人肺成纤维细胞MRC-5购自美国ATCC；LEF（苏州长征-欣凯制药有限公司，国药准字H20000550）；RPMI-1640培养基以及血清购自美国Gibco公司；miR-449a mimic和inhibitor质粒由Genepharma公司构建；
LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）；荧光显微镜（Olympus BX51）；Model 680酶标仪（Bio-Rad，美国）；流式细胞仪（BD FACScanto II，Becton Dickinson，美国）。CCK-8试剂盒（武汉华美公司）；凋亡试剂盒（美国Thermo Fisher）；PVDF膜（美国Bio-Rad公司）；抗体购自美国Abcam公司，逆转录试剂盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM实时PCR试剂盒购自TaKaRa（日本）。
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MRC-5细胞在RPMI-1640培养基中培养，温度为37 ℃，CO2浓度为5%。细胞被分为6组，即对照组、LEF组、LEF+mimic组、mimic组、LEF+inhibitor组和inhibitor组。其中LEF+mimic组和mimic组通过转染miR-449a mimic质粒过表达miR-449a的水平，LEF+inhibitor组和inhibitor组通过转染miR-449a inhibitor质粒使miR-449a的水平降低。对照组转染空载质粒。LEF组、LEF+mimic组和LEF+inhibitor组分别在5 mg/L LEF的条件下培养48 h。
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将细胞裂解后收集总RNA并检测纯度，通过逆转录试剂盒合成cDNA，然后进行PCR反应，步骤如下：95 ℃下2 min，95 ℃下15 s，60 ℃下25 s和72 ℃下60 s，共进行40个循环。以U6作为内参，使用2-ΔΔCT法分析miR-449a水平。引物序列如下（5′-3′），miR-449a上游引物：TGCGGTGGCAGTGTATTGTTAGC，下游引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT；U6上游引物：GGGCAGGAAGAGGGCCTAT，下游引物：TATGGCTAGCATGACTGGT。
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将细胞调节至2×104个细胞/ml的密度，接种于96孔板中，100 μl/孔。再培养24、48和72 h后将10 μl的CCK-8试剂加入至每孔中，37 ℃下培养2 h。在酶标仪上测量450 nm处的吸光度（A），计算相对细胞活力。
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分别将各组细胞200个细胞在6孔板中培养，每3天补充一次培养基，培养2周。用PBS洗涤细胞并加入甲醇固定15 min，加入使用结晶紫染色30 min，在显微镜下观察克隆形成的数目，≥50个细胞的集落为一个克隆形成。
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将细胞洗涤后重悬于结合缓冲液中，使细胞浓度为2.5×105个/ml。根据试剂盒说明书将试剂加入细胞中，并通过流式细胞术分析细胞凋亡情况。
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通过免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）和胶质蛋白I（collagen I，Col I）的表达情况分析细胞的表型和细胞外基质。然后将细胞在4 ℃下使用α-SMA的抗体染色过夜，用异硫氰酸四甲基罗丹明的山羊抗兔抗体染色30 min。然后再于避光条件下利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对细胞核染色10 min，通过荧光显微镜观察。
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通过Western blot检测JNK和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白的水平。将细胞裂解、离心收集总蛋白并检测蛋白浓度。使用10%的SDS-PAGE凝胶用于电泳分离蛋白，电泳后使用PVDF膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。分别加入一抗（稀释1:1 000）室温震荡2 h，后在4 ℃孵育过夜，加入二抗（稀释1:5 000），孵育3 h。通过Quantity One软件分析条带的灰度值并以GAPDH为参照计算目标蛋白质的表达量。
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实验数据采用SPSS 19软件进行处理，实验结果以平均值±标准偏差（SD）表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，统计学显著性表示为P<0.05。
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使用qPCR检测各组细胞中miR-449a表达水平。结果显示mimic组miR-449a水平显著高于对照组，inhibitor组的miR-449a表达水平显著低于对照组（P<0.05），说明转染实验成功。LEF组的miR-449a水平显著低于对照组（P<0.05），并且LEF+mimic组的miR-449a的表达水平显著高于LEF组，LEF+inhibitor组的miR-449a显著低于LEF组（P<0.05）。表明LEF可抑制人成纤维细胞中miR-449a的表达，见表1。
表 1 各组miR-449a表达水平比较
组别 miR-449a 对照组 1.16±0.08 LEF组 0.58±0.05* LEF+mimic组 2.04±0.16# mimic组 6.32±0.63* LEF+inhibitor组 0.41±0.06# inhibitor组 0.77±0.07* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
使用CCK-8法检测各组细胞的相对细胞活力。结果显示在第48小时和第72小时，LEF组和inhibitor组的细胞活力显著高于对照组（P<0.05），而mimic组的细胞活力显著低于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的细胞活力显著低于LEF组，LEF+inhibitor组的细胞活力显著高于LEF组（P<0.05），过表达miR-449a可部分逆转LEF对促进人成纤维细胞的细胞活力的作用，而降低miR-449a的水平会进一步促进细胞活力，见表2。
表 2 各组细胞的相对细胞活力比较（%）
组别 24 h 48 h 72 h 对照组 100.07±1.83 100.76±2.07 100.16±1.96 LEF组 103.67±2.06 110.83±2.15* 121.17±2.65* LEF+mimic组 99.98±2.14 98.57±2.11# 97.37±2.01# mimic组 97.54±1.97 91.79±2.35* 81.77±1.78* LEF+inhibitor组 107.68±2.08 118.67±3.07# 132.84±2.07# inhibitor组 104.31±1.79 111.38±2.67* 119.35±2.18* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
LEF组和inhibitor组的克隆形成数目显著高于对照组而细胞凋亡率低于对照组（P<0.05），mimic组的克隆形成数目显著低于对照组而细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的克隆形成数目显著低于LEF组而细胞凋亡率显著高于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组的克隆形成数目在LEF的基础上进一步升高而细胞凋亡率进一步降低（P<0.05）。过表达miR-449a可逆转LEF促进肺成纤维细胞增殖和抑制凋亡的作用，而低表达miR-449a会加剧LEF的作用，见表3。
表 3 各组细胞增殖和凋亡情况比较
组别 克隆形成数目（个） 细胞凋亡率（%） 对照组 54.32±4.36 5.53±0.94 LEF组 87.66±7.24* 3.11±0.76* LEF+mimic组 60.82±6.06# 6.73±1.26# mimic组 31.12±3.78* 17.32±3.28* LEF+inhibitor组 119.35±5.08# 2.14±0.62# inhibitor组 92.71±7.89* 3.45±0.83* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
本次研究通过免疫荧光技术检测了各组α-SMA的水平来分析细胞向肌细胞转化情况，检测Col I的水平来分析ECM水平。其中蓝色荧光为细胞核，红色荧光为α-SMA或Col I蛋白。LEF组和inhibitor组的荧光强度显著高于对照组（P<0.05），而mimic组的相对荧光强度低于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的相对荧光强度显著低于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组的相对荧光强度显著高于LEF组（P<0.05）。过表达miR-449a可部分逆转LEF对促进人成纤维细胞α-SMA和Col I表达的促进作用，见图1、图2和表4。
图 1 免疫荧光检测各组细胞中α-SMA的表达水平（×400）
图 2 免疫荧光检测各组细胞中Col I的表达水平（×400）
表 4 各组细胞α-SMA相对荧光强度比较
组别 α-SMA Col I 对照组 1.02±0.11 1.24±0.14 LEF组 2.36±0.47* 2.57±0.38* LEF+mimic组 1.53±0.34# 1.89±0.25# mimic组 0.47±0.05* 0.45±0.06* LEF+inhibitor组 3.25±0.18# 4.13±0.54# inhibitor组 2.48±0.15* 3.11±0.39* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
LEF组和inhibitor组的p-JNK/JNK水平高于对照组，mimic组的p-JNK/JNK水平显著低于对照组（P<0.05），并且LEF+mimic组中p-JNK/JNK水平显著低于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组中p-JNK/JNK水平显著高于LEF组（P<0.05）。过表达miR-449a可逆转LEF促进JNK蛋白磷酸化的作用，见表5。
表 5 各组p-JNK/JNK相对水平比较
组别 p-JNK JNK p-JNK/JNK 对照组 2.04±0.18 2.16±0.16 0.94±0.09 LEF组 2.87±0.31 1.05±0.10 2.73±0.18* LEF+mimic组 1.67±0.19 2.24±0.21 0.75±0.07# mimic组 0.96±0.11 3.11±0.28 0.31±0.04* LEF+inhibitor组 3.04±0.24 1.10±0.10 2.76±0.25# inhibitor组 3.78±0.34 1.02±0.09 3.71±0.31* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
肺纤维化是一种慢性进行性肺部疾病，但是临床上尚无治疗肺纤维化的特效方法和药物，目前用于进行性肺纤维化的唯一有效治疗方法是肺移植[7]，若患者未接受肺移植，通常在诊断后的3至5年内出现肺功能丧失导致呼吸衰竭和死亡。肺纤维化的病理特征包括纤维增生和ECM沉积过多，但是这个过程较为漫长，并且在早期症状不明显，也缺乏相应的诊断手段，在患者确诊为肺纤维化时再采取治疗效果有限。因此虽然LEF是否会引起肺纤维化尚无定论，但是由于肺纤维化的恶性预后和致死率，LEF治疗过程中的肺纤维化风险仍是临床重点关注的问题。研究LEF促进肺纤维化的机制是寻找诊断和治疗肺纤维化新方法的重要途径。
LEF是一种调节免疫的药物，其作用机制通过抑制二氢乳清酸脱氢酶来抑制T淋巴细胞和其他类型细胞的细胞周期进程[8]。LEF引起的肺纤维化并导致患者死亡的病例随着LEF使用时间的增加而升高[9]。一项长期的调查随访报告指出，在5911例使用LEF治疗的患者中，共出现了80例间质性肺病，其中有27例患者死亡，并且结果判定其中有18例患者的死亡是由于LEF直接导致[10-11]。在肺纤维化的过程中，成纤维细胞向成肌纤维细胞转化和ECM的累积是两大特点[12]。因此本文主要分析了LEF对人肺成纤维细胞的影响，结果显示LEF可显著促进成纤维细胞的细胞活力和增殖，抑制其凋亡，并诱导细胞表达大量的α-SMA蛋白和ECM累积。α-SMA是上皮细胞向间质细胞转化的检测指标之一，也是体外研究肺纤维化的最常用指标，而Col I是ECM的主要成分[13]。作者提示了LEF可通过活化成纤维细胞和促进其增殖参与肺纤维化。
为进一步分析LEF调节肺成纤维细胞增殖和表达α-SMA的机制，我们检测了miR-449a在其中的作用。miR-449a是近年来新发现的一种miRNA，研究已经证实了其可通过靶向并诱导靶基因mRNA降解，抑制肺癌细胞的增殖、上皮间充质转化[14-15]。本次研究结果显示LEF可抑制miR-449a的表达水平，并且过表达miR-449a可抑制成纤维细胞的细胞活力、细胞增殖能力，抑制α-SMA和Col I蛋白的表达，并促进其凋亡。过表达miR-449a会逆转由LEF引起的细胞活化、增殖以及α-SMA和Col I蛋白的表达，而抑制miR-449a的水平会进一步加剧LEF的促纤维化作用。Zhang等[16]的研究结果也显示miR-449a具有调节α-SMA蛋白表达的作用。通过进一步的研究我们还发现LEF可促进JNK的磷酸化，过表达miR-449a会抑制JNK磷酸化水平并显著逆转LEF促进JNK磷酸化的作用。JNK的活化在促进肺癌发生和发展中的作用已经被广泛证实，此外，JNK可活化可能通过活化肝星状细胞引起肝纤维化[17]。Yang等[18]的研究结果显示阻断JNK途径可抑制成纤维细胞样滑膜细胞的活性，并抑制迁移和侵袭。Shingyochi等[19]的研究结果也显示了激活JNK通路会促进成纤维细胞的增殖和迁移。这提示LEF可能通过miR-499a促进JNK蛋白的磷酸化，从而促进肺成纤维细胞的活化和增殖，并促进细胞向肌纤维细胞转化和ECM的累积，进而引起肺纤维化。
综上所述，LEF可能通过抑制肺成纤维细胞中miR-449a的表达激活JNK途径，促进α-SMA的表达和ECM的累积，从而诱导成纤维细胞的活化和增殖，抑制其凋亡，从而引起肺纤维化。但是，关于LEF调节miR-449a的机制和miR-449a在JNK途径中的作用仍需要进一步的研究。
Mechanism of leflunomide in regulating pulmonary fibrosis by regulating miR-449a
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摘要:
目的 探究来氟米特（leflunomide，LEF）通过调节微小RNA（microRNA，miR）-449a在肺纤维化中的机制研究。 方法 将人肺成纤维细胞MRC-5分为6组，即对照组、LEF组、LEF+mimic组、mimic组、LEF+inhibitor组和inhibitor组。通过质粒转染miR-449a mimic或inhibitor来过表达或沉默miR-449a，在5 mg/L LEF的条件下培养48 h。分别通过CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测各组细胞活力、细胞增殖能力和凋亡率。使用免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）胶质蛋白I（collagen I，col I）。分别使用qPCR和Western blot检测miRNA和蛋白的水平。 结果 mimic组miR-449a水平显著高于对照组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的miR-449a水平显著低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的miR-449a的表达水平显著高于LEF组，LEF+inhibitor组的miR-449a水平显著低于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的细胞活力和细胞增殖能力显著高于对照组（P<0.05）。mimic组的细胞活力和细胞增殖能力显著低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的细胞活力和细胞增殖能力显著低于LEF组而LEF+inhibitor组的细胞活力显著高于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的细胞凋亡率低于对照组（P<0.05），mimic组的细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的细胞凋亡率显著高于LEF组而LEF+inhibitor组的凋亡率显著低于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的α-SMA和Col I蛋白的荧光强度显著高于对照组（P<0.05），mimic组的相对荧光强度低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的α-SMA和Col I蛋白相对荧光强度显著低于LEF组，LEF+inhibitor组的α-SMA和Col I蛋白相对荧光强度显著高于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的p-JNK/JNK水平高于对照组（P<0.05），mimic组的p-JNK/JNK水平显著低于对照组（P<0.05），LEF+mimic组中p-JNK/JNK水平显著低于LEF组而LEF+inhibitor组的p-JNK/JNK水平显著高于LEF组（P<0.05）。 结论 LEF可能通过抑制肺成纤维细胞中miR-449a的表达激活JNK途径，从而诱导成纤维细胞的活化和增殖，抑制其凋亡，从而引起肺纤维化。 -
关键词:
- 来氟米特 /
- 肺纤维化 /
- 成纤维细胞 /
- α平滑肌肌动蛋白 /
- 微小RNA-449a /
- c-Jun氨基末端激酶
Abstract:Objective To investigate the mechanism of leflunomide (LEF) in regulating pulmonary fibrosis by regulating microRNA (miR)-449a. Methods Human lung fibroblasts MRC-5 were divided into 6 groups: control group, LEF group, LEF+mimic group, mimic group, LEF+inhibitor group and inhibitor group. MiR-449a was overexpressed or silenced by plasmid transfection with miR-449a mimic or inhibitor and ncubate for 48 h at 5 mg / L LEF. The cell viability, cell proliferation ability and apoptotic rate of each group were measured by CCK-8 method, clone formation experiment and flow cytometry. Immunofluorescent staining was used to detect α smooth muscle actin (α-SMA) and collagen I (col I). The levels of miRNA and protein were detected using qPCR and Western blot, respectively. Results The miR-449a level in the mimic group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The level of miR-449a in LEF group and inhibitor group was significantly lower than that in control group (P<0.05). The expression level of miR-449a in LEF+mimic group was significantly higher than that in LEF group, and the level of miR-449a in LEF+inhibitor group was significantly lower than that in LEF group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the LEF group and inhibitor group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the mimic group were significantly lower than those of the control group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the LEF+mimic group were significantly lower than those of the LEF group, while the cell viability of the LEF+inhibitor group was significantly higher than that of the LEF group (P<0.05). The apoptosis rate of LEF group and inhibitor group was lower than that of control group (P<0.05). The apoptosis rate of mimic group was significantly higher than that of control group (P<0.05). The apoptosis rate of LEF+mimic group was significantly higher than that of LEF group, while the apoptosis rate of LEF+inhibitor group was significantly lower than that of LEF group (P<0.05). The fluorescence intensity of α-SMA and Col I proteins in LEF group and inhibitor group were significantly higher than those in control group (P<0.05). The relative fluorescence intensity of mimic group was lower than that of control group (P<0.05). The relative fluorescence intensities of α-SMA and Col I proteins in LEF+mimic group were significantly lower than those in LEF group, while the relative fluorescence intensities of α-SMA and Col I protein in LEF+inhibitor group were significantly higher than those in LEF group (P<0.05). The levels of p-JNK / JNK in LEF group and inhibitor group were higher than those in control group (P<0.05). The p-JNK / JNK level in the mimic group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). The level of p-JNK / JNK in LEF+mimic group was significantly lower than that in LEF group, while the level of p-JNK / JNK in LEF+inhibitor group was significantly higher than that in LEF group (P<0.05). Conclusion LEF may activate the JNK pathway by inhibiting the expression of miR-449a in lung fibroblasts, thereby inducing fibroblast activation and proliferation, inhibiting apoptosis, and causing pulmonary fibrosis. -
Key words:
- leflunomide /
- pulmonary fibrosis /
- fibroblasts /
- alpha smooth muscle actin /
- microRNA-449a /
- c-Jun N-terminal kinase
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表 1 各组miR-449a表达水平比较
组别 miR-449a 对照组 1.16±0.08 LEF组 0.58±0.05* LEF+mimic组 2.04±0.16# mimic组 6.32±0.63* LEF+inhibitor组 0.41±0.06# inhibitor组 0.77±0.07* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 
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表 2 各组细胞的相对细胞活力比较（%）
组别 24 h 48 h 72 h 对照组 100.07±1.83 100.76±2.07 100.16±1.96 LEF组 103.67±2.06 110.83±2.15* 121.17±2.65* LEF+mimic组 99.98±2.14 98.57±2.11# 97.37±2.01# mimic组 97.54±1.97 91.79±2.35* 81.77±1.78* LEF+inhibitor组 107.68±2.08 118.67±3.07# 132.84±2.07# inhibitor组 104.31±1.79 111.38±2.67* 119.35±2.18* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 3 各组细胞增殖和凋亡情况比较
组别 克隆形成数目（个） 细胞凋亡率（%） 对照组 54.32±4.36 5.53±0.94 LEF组 87.66±7.24* 3.11±0.76* LEF+mimic组 60.82±6.06# 6.73±1.26# mimic组 31.12±3.78* 17.32±3.28* LEF+inhibitor组 119.35±5.08# 2.14±0.62# inhibitor组 92.71±7.89* 3.45±0.83* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 4 各组细胞α-SMA相对荧光强度比较
组别 α-SMA Col I 对照组 1.02±0.11 1.24±0.14 LEF组 2.36±0.47* 2.57±0.38* LEF+mimic组 1.53±0.34# 1.89±0.25# mimic组 0.47±0.05* 0.45±0.06* LEF+inhibitor组 3.25±0.18# 4.13±0.54# inhibitor组 2.48±0.15* 3.11±0.39* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 5 各组p-JNK/JNK相对水平比较
组别 p-JNK JNK p-JNK/JNK 对照组 2.04±0.18 2.16±0.16 0.94±0.09 LEF组 2.87±0.31 1.05±0.10 2.73±0.18* LEF+mimic组 1.67±0.19 2.24±0.21 0.75±0.07# mimic组 0.96±0.11 3.11±0.28 0.31±0.04* LEF+inhibitor组 3.04±0.24 1.10±0.10 2.76±0.25# inhibitor组 3.78±0.34 1.02±0.09 3.71±0.31* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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