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成纤维细胞的增殖和活化引起的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的累积是肺纤维化的主要病理基础[1]。肺纤维化治疗难度大，且发展到晚期纤维化过程不可逆转，而一些药物的长期使用会提高肺纤维化的发生风险，对于这临床的一类并发症应格外重视。来氟米特（leflunomide，LEF）是治疗类风湿性关节炎的常用药物，但是有临床报道称，长期服用LEF可能提高肺纤维化的发生风险，但是也有研究认为LEF对肺纤维化影响不大[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）长度约为18~22个核苷酸，虽然不具备编码功能，但是可通过识别和碱基配对的方式与靶基因信使RNA（message RNA，mRNA）的3'非翻译区（3'UTR）结合，从而参与基因表达的调控[3]。miR-449a具有抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡的作用[4]，并且最新研究发现miR-449a可能与肺纤维化有关，在二氧化硅诱导的肺纤维化模型中，miR-449a可通过调节自噬缓解纤维化[5]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是调节细胞增殖、凋亡和分化的重要蛋白，其磷酸化后可通过信号转导调控细胞生物学行为[6]。本文发现了miR-449a的过表达会显著缓解由LEF引起的肺成纤维细胞的增殖，而沉默miR-449a对细胞的影响相反，这可能是LEF引起肺纤维化的机制之一，报道如下。
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人肺成纤维细胞MRC-5购自美国ATCC；LEF（苏州长征-欣凯制药有限公司，国药准字H20000550）；RPMI-1640培养基以及血清购自美国Gibco公司；miR-449a mimic和inhibitor质粒由Genepharma公司构建；
LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）；荧光显微镜（Olympus BX51）；Model 680酶标仪（Bio-Rad，美国）；流式细胞仪（BD FACScanto II，Becton Dickinson，美国）。CCK-8试剂盒（武汉华美公司）；凋亡试剂盒（美国Thermo Fisher）；PVDF膜（美国Bio-Rad公司）；抗体购自美国Abcam公司，逆转录试剂盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM实时PCR试剂盒购自TaKaRa（日本）。
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MRC-5细胞在RPMI-1640培养基中培养，温度为37 ℃，CO2浓度为5%。细胞被分为6组，即对照组、LEF组、LEF+mimic组、mimic组、LEF+inhibitor组和inhibitor组。其中LEF+mimic组和mimic组通过转染miR-449a mimic质粒过表达miR-449a的水平，LEF+inhibitor组和inhibitor组通过转染miR-449a inhibitor质粒使miR-449a的水平降低。对照组转染空载质粒。LEF组、LEF+mimic组和LEF+inhibitor组分别在5 mg/L LEF的条件下培养48 h。
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将细胞裂解后收集总RNA并检测纯度，通过逆转录试剂盒合成cDNA，然后进行PCR反应，步骤如下：95 ℃下2 min，95 ℃下15 s，60 ℃下25 s和72 ℃下60 s，共进行40个循环。以U6作为内参，使用2-ΔΔCT法分析miR-449a水平。引物序列如下（5′-3′），miR-449a上游引物：TGCGGTGGCAGTGTATTGTTAGC，下游引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT；U6上游引物：GGGCAGGAAGAGGGCCTAT，下游引物：TATGGCTAGCATGACTGGT。
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将细胞调节至2×104个细胞/ml的密度，接种于96孔板中，100 μl/孔。再培养24、48和72 h后将10 μl的CCK-8试剂加入至每孔中，37 ℃下培养2 h。在酶标仪上测量450 nm处的吸光度（A），计算相对细胞活力。
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分别将各组细胞200个细胞在6孔板中培养，每3天补充一次培养基，培养2周。用PBS洗涤细胞并加入甲醇固定15 min，加入使用结晶紫染色30 min，在显微镜下观察克隆形成的数目，≥50个细胞的集落为一个克隆形成。
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将细胞洗涤后重悬于结合缓冲液中，使细胞浓度为2.5×105个/ml。根据试剂盒说明书将试剂加入细胞中，并通过流式细胞术分析细胞凋亡情况。
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通过免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）和胶质蛋白I（collagen I，Col I）的表达情况分析细胞的表型和细胞外基质。然后将细胞在4 ℃下使用α-SMA的抗体染色过夜，用异硫氰酸四甲基罗丹明的山羊抗兔抗体染色30 min。然后再于避光条件下利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对细胞核染色10 min，通过荧光显微镜观察。
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通过Western blot检测JNK和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白的水平。将细胞裂解、离心收集总蛋白并检测蛋白浓度。使用10%的SDS-PAGE凝胶用于电泳分离蛋白，电泳后使用PVDF膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。分别加入一抗（稀释1:1 000）室温震荡2 h，后在4 ℃孵育过夜，加入二抗（稀释1:5 000），孵育3 h。通过Quantity One软件分析条带的灰度值并以GAPDH为参照计算目标蛋白质的表达量。
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实验数据采用SPSS 19软件进行处理，实验结果以平均值±标准偏差（SD）表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，统计学显著性表示为P<0.05。
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使用qPCR检测各组细胞中miR-449a表达水平。结果显示mimic组miR-449a水平显著高于对照组，inhibitor组的miR-449a表达水平显著低于对照组（P<0.05），说明转染实验成功。LEF组的miR-449a水平显著低于对照组（P<0.05），并且LEF+mimic组的miR-449a的表达水平显著高于LEF组，LEF+inhibitor组的miR-449a显著低于LEF组（P<0.05）。表明LEF可抑制人成纤维细胞中miR-449a的表达，见表1。
表 1 各组miR-449a表达水平比较
组别 miR-449a 对照组 1.16±0.08 LEF组 0.58±0.05* LEF+mimic组 2.04±0.16# mimic组 6.32±0.63* LEF+inhibitor组 0.41±0.06# inhibitor组 0.77±0.07* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
使用CCK-8法检测各组细胞的相对细胞活力。结果显示在第48小时和第72小时，LEF组和inhibitor组的细胞活力显著高于对照组（P<0.05），而mimic组的细胞活力显著低于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的细胞活力显著低于LEF组，LEF+inhibitor组的细胞活力显著高于LEF组（P<0.05），过表达miR-449a可部分逆转LEF对促进人成纤维细胞的细胞活力的作用，而降低miR-449a的水平会进一步促进细胞活力，见表2。
表 2 各组细胞的相对细胞活力比较（%）
组别 24 h 48 h 72 h 对照组 100.07±1.83 100.76±2.07 100.16±1.96 LEF组 103.67±2.06 110.83±2.15* 121.17±2.65* LEF+mimic组 99.98±2.14 98.57±2.11# 97.37±2.01# mimic组 97.54±1.97 91.79±2.35* 81.77±1.78* LEF+inhibitor组 107.68±2.08 118.67±3.07# 132.84±2.07# inhibitor组 104.31±1.79 111.38±2.67* 119.35±2.18* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
LEF组和inhibitor组的克隆形成数目显著高于对照组而细胞凋亡率低于对照组（P<0.05），mimic组的克隆形成数目显著低于对照组而细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的克隆形成数目显著低于LEF组而细胞凋亡率显著高于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组的克隆形成数目在LEF的基础上进一步升高而细胞凋亡率进一步降低（P<0.05）。过表达miR-449a可逆转LEF促进肺成纤维细胞增殖和抑制凋亡的作用，而低表达miR-449a会加剧LEF的作用，见表3。
表 3 各组细胞增殖和凋亡情况比较
组别 克隆形成数目（个） 细胞凋亡率（%） 对照组 54.32±4.36 5.53±0.94 LEF组 87.66±7.24* 3.11±0.76* LEF+mimic组 60.82±6.06# 6.73±1.26# mimic组 31.12±3.78* 17.32±3.28* LEF+inhibitor组 119.35±5.08# 2.14±0.62# inhibitor组 92.71±7.89* 3.45±0.83* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
本次研究通过免疫荧光技术检测了各组α-SMA的水平来分析细胞向肌细胞转化情况，检测Col I的水平来分析ECM水平。其中蓝色荧光为细胞核，红色荧光为α-SMA或Col I蛋白。LEF组和inhibitor组的荧光强度显著高于对照组（P<0.05），而mimic组的相对荧光强度低于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的相对荧光强度显著低于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组的相对荧光强度显著高于LEF组（P<0.05）。过表达miR-449a可部分逆转LEF对促进人成纤维细胞α-SMA和Col I表达的促进作用，见图1、图2和表4。
图 1 免疫荧光检测各组细胞中α-SMA的表达水平（×400）
图 2 免疫荧光检测各组细胞中Col I的表达水平（×400）
表 4 各组细胞α-SMA相对荧光强度比较
组别 α-SMA Col I 对照组 1.02±0.11 1.24±0.14 LEF组 2.36±0.47* 2.57±0.38* LEF+mimic组 1.53±0.34# 1.89±0.25# mimic组 0.47±0.05* 0.45±0.06* LEF+inhibitor组 3.25±0.18# 4.13±0.54# inhibitor组 2.48±0.15* 3.11±0.39* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
LEF组和inhibitor组的p-JNK/JNK水平高于对照组，mimic组的p-JNK/JNK水平显著低于对照组（P<0.05），并且LEF+mimic组中p-JNK/JNK水平显著低于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组中p-JNK/JNK水平显著高于LEF组（P<0.05）。过表达miR-449a可逆转LEF促进JNK蛋白磷酸化的作用，见表5。
表 5 各组p-JNK/JNK相对水平比较
组别 p-JNK JNK p-JNK/JNK 对照组 2.04±0.18 2.16±0.16 0.94±0.09 LEF组 2.87±0.31 1.05±0.10 2.73±0.18* LEF+mimic组 1.67±0.19 2.24±0.21 0.75±0.07# mimic组 0.96±0.11 3.11±0.28 0.31±0.04* LEF+inhibitor组 3.04±0.24 1.10±0.10 2.76±0.25# inhibitor组 3.78±0.34 1.02±0.09 3.71±0.31* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
肺纤维化是一种慢性进行性肺部疾病，但是临床上尚无治疗肺纤维化的特效方法和药物，目前用于进行性肺纤维化的唯一有效治疗方法是肺移植[7]，若患者未接受肺移植，通常在诊断后的3至5年内出现肺功能丧失导致呼吸衰竭和死亡。肺纤维化的病理特征包括纤维增生和ECM沉积过多，但是这个过程较为漫长，并且在早期症状不明显，也缺乏相应的诊断手段，在患者确诊为肺纤维化时再采取治疗效果有限。因此虽然LEF是否会引起肺纤维化尚无定论，但是由于肺纤维化的恶性预后和致死率，LEF治疗过程中的肺纤维化风险仍是临床重点关注的问题。研究LEF促进肺纤维化的机制是寻找诊断和治疗肺纤维化新方法的重要途径。
LEF是一种调节免疫的药物，其作用机制通过抑制二氢乳清酸脱氢酶来抑制T淋巴细胞和其他类型细胞的细胞周期进程[8]。LEF引起的肺纤维化并导致患者死亡的病例随着LEF使用时间的增加而升高[9]。一项长期的调查随访报告指出，在5911例使用LEF治疗的患者中，共出现了80例间质性肺病，其中有27例患者死亡，并且结果判定其中有18例患者的死亡是由于LEF直接导致[10-11]。在肺纤维化的过程中，成纤维细胞向成肌纤维细胞转化和ECM的累积是两大特点[12]。因此本文主要分析了LEF对人肺成纤维细胞的影响，结果显示LEF可显著促进成纤维细胞的细胞活力和增殖，抑制其凋亡，并诱导细胞表达大量的α-SMA蛋白和ECM累积。α-SMA是上皮细胞向间质细胞转化的检测指标之一，也是体外研究肺纤维化的最常用指标，而Col I是ECM的主要成分[13]。作者提示了LEF可通过活化成纤维细胞和促进其增殖参与肺纤维化。
为进一步分析LEF调节肺成纤维细胞增殖和表达α-SMA的机制，我们检测了miR-449a在其中的作用。miR-449a是近年来新发现的一种miRNA，研究已经证实了其可通过靶向并诱导靶基因mRNA降解，抑制肺癌细胞的增殖、上皮间充质转化[14-15]。本次研究结果显示LEF可抑制miR-449a的表达水平，并且过表达miR-449a可抑制成纤维细胞的细胞活力、细胞增殖能力，抑制α-SMA和Col I蛋白的表达，并促进其凋亡。过表达miR-449a会逆转由LEF引起的细胞活化、增殖以及α-SMA和Col I蛋白的表达，而抑制miR-449a的水平会进一步加剧LEF的促纤维化作用。Zhang等[16]的研究结果也显示miR-449a具有调节α-SMA蛋白表达的作用。通过进一步的研究我们还发现LEF可促进JNK的磷酸化，过表达miR-449a会抑制JNK磷酸化水平并显著逆转LEF促进JNK磷酸化的作用。JNK的活化在促进肺癌发生和发展中的作用已经被广泛证实，此外，JNK可活化可能通过活化肝星状细胞引起肝纤维化[17]。Yang等[18]的研究结果显示阻断JNK途径可抑制成纤维细胞样滑膜细胞的活性，并抑制迁移和侵袭。Shingyochi等[19]的研究结果也显示了激活JNK通路会促进成纤维细胞的增殖和迁移。这提示LEF可能通过miR-499a促进JNK蛋白的磷酸化，从而促进肺成纤维细胞的活化和增殖，并促进细胞向肌纤维细胞转化和ECM的累积，进而引起肺纤维化。
综上所述，LEF可能通过抑制肺成纤维细胞中miR-449a的表达激活JNK途径，促进α-SMA的表达和ECM的累积，从而诱导成纤维细胞的活化和增殖，抑制其凋亡，从而引起肺纤维化。但是，关于LEF调节miR-449a的机制和miR-449a在JNK途径中的作用仍需要进一步的研究。
Mechanism of leflunomide in regulating pulmonary fibrosis by regulating miR-449a
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摘要:
目的 探究来氟米特（leflunomide，LEF）通过调节微小RNA（microRNA，miR）-449a在肺纤维化中的机制研究。 方法 将人肺成纤维细胞MRC-5分为6组，即对照组、LEF组、LEF+mimic组、mimic组、LEF+inhibitor组和inhibitor组。通过质粒转染miR-449a mimic或inhibitor来过表达或沉默miR-449a，在5 mg/L LEF的条件下培养48 h。分别通过CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测各组细胞活力、细胞增殖能力和凋亡率。使用免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）胶质蛋白I（collagen I，col I）。分别使用qPCR和Western blot检测miRNA和蛋白的水平。 结果 mimic组miR-449a水平显著高于对照组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的miR-449a水平显著低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的miR-449a的表达水平显著高于LEF组，LEF+inhibitor组的miR-449a水平显著低于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的细胞活力和细胞增殖能力显著高于对照组（P<0.05）。mimic组的细胞活力和细胞增殖能力显著低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的细胞活力和细胞增殖能力显著低于LEF组而LEF+inhibitor组的细胞活力显著高于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的细胞凋亡率低于对照组（P<0.05），mimic组的细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的细胞凋亡率显著高于LEF组而LEF+inhibitor组的凋亡率显著低于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的α-SMA和Col I蛋白的荧光强度显著高于对照组（P<0.05），mimic组的相对荧光强度低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的α-SMA和Col I蛋白相对荧光强度显著低于LEF组，LEF+inhibitor组的α-SMA和Col I蛋白相对荧光强度显著高于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的p-JNK/JNK水平高于对照组（P<0.05），mimic组的p-JNK/JNK水平显著低于对照组（P<0.05），LEF+mimic组中p-JNK/JNK水平显著低于LEF组而LEF+inhibitor组的p-JNK/JNK水平显著高于LEF组（P<0.05）。 结论 LEF可能通过抑制肺成纤维细胞中miR-449a的表达激活JNK途径，从而诱导成纤维细胞的活化和增殖，抑制其凋亡，从而引起肺纤维化。 -
关键词:
- 来氟米特 /
- 肺纤维化 /
- 成纤维细胞 /
- α平滑肌肌动蛋白 /
- 微小RNA-449a /
- c-Jun氨基末端激酶
Abstract:Objective To investigate the mechanism of leflunomide (LEF) in regulating pulmonary fibrosis by regulating microRNA (miR)-449a. Methods Human lung fibroblasts MRC-5 were divided into 6 groups: control group, LEF group, LEF+mimic group, mimic group, LEF+inhibitor group and inhibitor group. MiR-449a was overexpressed or silenced by plasmid transfection with miR-449a mimic or inhibitor and ncubate for 48 h at 5 mg / L LEF. The cell viability, cell proliferation ability and apoptotic rate of each group were measured by CCK-8 method, clone formation experiment and flow cytometry. Immunofluorescent staining was used to detect α smooth muscle actin (α-SMA) and collagen I (col I). The levels of miRNA and protein were detected using qPCR and Western blot, respectively. Results The miR-449a level in the mimic group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The level of miR-449a in LEF group and inhibitor group was significantly lower than that in control group (P<0.05). The expression level of miR-449a in LEF+mimic group was significantly higher than that in LEF group, and the level of miR-449a in LEF+inhibitor group was significantly lower than that in LEF group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the LEF group and inhibitor group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the mimic group were significantly lower than those of the control group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the LEF+mimic group were significantly lower than those of the LEF group, while the cell viability of the LEF+inhibitor group was significantly higher than that of the LEF group (P<0.05). The apoptosis rate of LEF group and inhibitor group was lower than that of control group (P<0.05). The apoptosis rate of mimic group was significantly higher than that of control group (P<0.05). The apoptosis rate of LEF+mimic group was significantly higher than that of LEF group, while the apoptosis rate of LEF+inhibitor group was significantly lower than that of LEF group (P<0.05). The fluorescence intensity of α-SMA and Col I proteins in LEF group and inhibitor group were significantly higher than those in control group (P<0.05). The relative fluorescence intensity of mimic group was lower than that of control group (P<0.05). The relative fluorescence intensities of α-SMA and Col I proteins in LEF+mimic group were significantly lower than those in LEF group, while the relative fluorescence intensities of α-SMA and Col I protein in LEF+inhibitor group were significantly higher than those in LEF group (P<0.05). The levels of p-JNK / JNK in LEF group and inhibitor group were higher than those in control group (P<0.05). The p-JNK / JNK level in the mimic group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). The level of p-JNK / JNK in LEF+mimic group was significantly lower than that in LEF group, while the level of p-JNK / JNK in LEF+inhibitor group was significantly higher than that in LEF group (P<0.05). Conclusion LEF may activate the JNK pathway by inhibiting the expression of miR-449a in lung fibroblasts, thereby inducing fibroblast activation and proliferation, inhibiting apoptosis, and causing pulmonary fibrosis. -
Key words:
- leflunomide /
- pulmonary fibrosis /
- fibroblasts /
- alpha smooth muscle actin /
- microRNA-449a /
- c-Jun N-terminal kinase
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在中医，脑卒中属于中风范畴，“气虚血瘀、痰瘀互结、毒损脑络”是中风的核心病机[1]。雷公藤系卫矛科雷公藤属藤本植物，又名震龙根、水莽子、断肠草、红紫根，以根茎入药，首载于《神农本草经》，味苦性寒，具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血等功效，常用于免疫和炎性疾病的治疗。现代医学研究发现，炎症反应及缺血半暗带神经元凋亡在脑缺血再灌注损伤（CIRI）进展中发挥着重要作用，可作为防治CIRI新药研究的靶点[2-4]。雷公藤甲素为雷公藤的主要活性成分之一，化学结构属于二萜内酯类化合物，具有抗炎、抗凋亡等药理学作用[5-6]。Toll样受体4/核转录因子-κB（TLR4/NF-κB）通路是CIRI后炎症反应及神经元凋亡的重要调控机制[7]。有文献[8-9]报道雷公藤甲素能够抑制TLR4/NF-κB通路对大鼠类风湿关节炎、鼻炎具有一定抑制作用。然而，雷公藤甲素是否能够通过调控TLR4/NF-κB通路抑制CIRI仍需深入研究。因此，本实验将探讨雷公藤甲素对大鼠CIRI的影响及其机制，以期为雷公藤甲素应用于CIRI防治提供理论依据。
1. 材料
1.1 动物
清洁级健康雄性7周龄Wistar大鼠144只，体质量210~240 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（浙）2019-0004。饲养环境维持室温23~25 ℃、相对湿度45%~65%，自由饮水进食。动物实验遵守实验动物福利伦理审查指南。
1.2 实验药物与试剂
雷公藤甲素（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%）；丁苯酞氯化钠注射液（恩必普药业有限公司，规格100 ml∶25 mg，国药准字H20100041）；生理盐水（石家庄四药有限公司，规格500 ml，国药准字H13023200）；注射用异戊巴比妥钠（上海上药新亚药业有限公司，规格0.1 g，国药准字H21021725）；红四氮唑（TTC）、伊文思蓝（EB）（北京博奥森生物技术有限公司）；4%多聚甲醛溶液（北京索莱宝生物技术公司）；末端标记法（TUNEL）染色试剂盒和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；甲酰胺（天津科密欧化学试剂有限公司）；TLR4、NF-κB、p-NF-κB、激活型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、β-actin抗体和IgG二抗（北京博奥森生物技术有限公司）；二喹啉甲酸法（BCA）蛋白浓度检测试剂盒、增强化学发光液（ECL）（武汉三鹰生物技术有限公司）。
1.3 主要仪器
TKY-BMB型石蜡包埋机（湖北康泰医疗设备有限公司）；S7220型石蜡切片机（沈阳恒松科技有限公司）；JY300C型电泳仪（美国Wealtec公司）；Semi-Day型转膜仪（美国Bio-Rad公司）；FluorChem HD2型凝胶成像仪（美国Protein Simple公司）；BioTek Epoch型全波长酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；BX53型显微镜（日本Olympus日立公司）。
2. 方法
2.1 分组、给药与CIRI大鼠模型制备
将144只Wistar大鼠按照随机数字表法平均分为假手术组、模型组、雷公藤甲素低、中、高剂量组（0.2、0.4、0.8 mg/kg）[10]和丁苯酞组（6 mg/kg）[11]，每组24只。造模前3 d开始1次/d腹腔注射（ip）给药，假手术组和模型组ip给予生理盐水，注射体积均为5 ml/kg。除假手术组外，其余5组均参照杨丽等[12]报道方法构建CIRI大鼠模型。
2.2 神经功能缺失评分和脑梗死率检测
再灌注24 h后，分别随机取各组6只大鼠，参照文献[13]报道的方法进行神经功能缺失评分，无症状为0分、前肢不能伸展为1分、行走时转圈为2分、行走时跌倒为3分、不能行走或意识丧失为4分。ip戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉后，颈椎脱臼处死，取大脑组织、-20 ℃冻存15 min后均匀厚度切为5片，2% TTC溶液恒温37 ℃避光染色30 min，每5 min翻转一次，正常组织呈红色、梗死组织呈苍白色，通过图像分析软件计算脑梗死率。
2.3 血脑屏障（BBB）通透性检测[14]
分别随机取各组6只大鼠，经尾静脉注射2% EB溶液4 ml/kg，30 min后实施麻醉，开胸后经“左心室-右心耳”灌注生理盐水至流出液清亮，取脑称重，1 ml/100 mg加入甲酰胺后60 ℃水浴24 h，4 ℃匀浆后15000 rpm离心20 min取上清液，通过酶标仪检测620 nm处吸光度值，对照标准曲线测定EB含量。
2.4 缺血半暗带皮层神经元病理学改变的观察
分别随机取各组6只大鼠，ip戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉后，颈椎脱臼处死，取缺血侧大脑皮层组织，经4%多聚甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、切片、烤片等处理后，按照HE试剂盒和TUNEL试剂盒操作说进行染色处理后，通过光学显微镜观察缺血半暗带皮层神经元病理学改变。显微镜下计数TUNEL染色切片5个视野内细胞数和凋亡细胞数，计数缺血半暗带皮层神经元凋亡率。
2.5 缺血侧大脑皮层组织生化指标检测
取各组剩余的6只大鼠，ip戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉后，颈椎脱臼处死，剥取缺血侧大脑皮层组织。①取部分缺血侧大脑皮层组织，加入5倍量4 ℃生理盐水研磨匀浆，3 500 r/min离心5 min分离上清液，按照试剂盒操作说明通过ELISA法检测缺血侧大脑皮层组织TNF-α、IL-1β含量。②取剩余部分缺血侧大脑皮层组织，加入适量蛋白裂解液后研磨匀浆，冰上静置30 min使其充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心25 min分离上清液，检测总蛋白浓度并配平后，30 μg等量上样，经10 % SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白、转膜和5%脱脂牛奶封闭1.5 h后，加入一抗稀释液TLR4（1∶800）、NF-κB（1∶1000）、p-NF-κB（1∶1000）、cleaved Caspase-3（1∶800）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）和内参β-actin（1∶1500）4 ℃避光孵育过夜，洗膜后二抗稀释液（1∶3 000）室温孵育1.5 h，洗膜后ECL显影，通过Image J软件分析蛋白条带灰度值。
2.6 统计学分析
运用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，计量资料符合正态分布以(
$ \bar x \pm s $ )表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时两两比较采用Dunnett's T3检验，P<0.05为差异有统计学意义。3. 结果
3.1 各组大鼠神经功能缺失评分和脑梗死率的比较
与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺失评分和脑梗死率显著升高（P<0.05）。与模型组比较，雷公藤甲素中、高剂量组和丁苯酞组神经功能缺失评分和脑梗死率显著降低（P<0.05）。与丁苯酞组比较，雷公藤甲素高剂量组神经功能缺失评分和脑梗死率显著降低（P<0.05）。见图1、表1。
表 1 各组大鼠神经功能缺失评分、脑梗死率、BBB通透性的比较（$ \bar x \pm s $ ，n=6）组别 神经功能缺失
评分（分）脑梗死率
（%）EB含量
（μg/g）假手术组 0.00±0.00 0.00±0.00 0.49±0.06 模型组 2.84±0.39* 48.17±7.39* 1.54±0.27* 丁苯酞组 1.31±0.17△ 16.28±2.15△ 0.79±0.09△ 雷公藤甲素低剂量组 2.50±0.34 42.93±5.74 1.42±0.23 雷公藤甲素中剂量组 1.85±0.26△ 27.54±3.48△ 1.10±0.16△ 雷公藤甲素高剂量组 1.09±0.15△# 11.38±1.65△# 0.70±0.08△# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与丁苯酞组比较；△P<0.05，与模型组比较。 3.2 各组大鼠BBB通透性的比较
与假手术组比较，模型组大鼠脑组织EB含量显著升高（P<0.05）。与模型组比较，雷公藤甲素中、高剂量组和丁苯酞组脑组织EB含量显著降低（P<0.05）。与丁苯酞组比较，雷公藤甲素高剂量组脑组织EB含量显著降低（P<0.05）。见表1。
3.3 各组大鼠缺血半暗带皮层神经元病理学改变的比较
假手术组大鼠皮层神经元呈圆形或椭圆形，形态饱满，着色均匀，胞核居中。模型组大鼠缺血半暗带皮层神经元呈现形态不规则，胞体萎缩呈空泡样变，着色较深，核膜边界不清，炎性细胞浸润等病理学改变。与模型组比较，雷公藤甲素各剂量组和丁苯酞组缺血半暗带皮层神经元明显改善，其中雷公藤甲素高剂量组效果优于雷公藤甲素低、中剂量组和丁苯酞组，见图2。
图 2 各组大鼠缺血半暗带皮层神经元病理学改变的比较（HE，×400）A. 假手术组；B. 模型组；C. 丁苯酞组；D. 雷公藤甲素低剂量组；E. 雷公藤甲素中剂量组；F. 雷公藤甲素高剂量组3.4 各组大鼠缺血半暗带皮层神经元凋亡率的比较
与假手术组比较，模型组大鼠缺血半暗带皮层神经元凋亡率显著升高（P<0.05）。与模型组比较，雷公藤甲素中、高剂量组和丁苯酞组凋亡率显著降低（P<0.05）。与丁苯酞组比较，雷公藤甲素高剂量组凋亡率显著降低（P<0.05），见表2。
表 2 各组大鼠缺血半暗带皮层神经元凋亡率的比较（$ \bar x \pm s $ ，n=6）组别 凋亡率（%） 假手术组 2.68±0.35 模型组 53.07±8.42* 丁苯酞组 17.69±2.90△ 雷公藤甲素低剂量组 45.93±7.67 雷公藤甲素中剂量组 31.52±5.08△ 雷公藤甲素高剂量组 12.88±1.74△# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与丁苯酞组比较；△P<0.05，与模型组比较。 3.5 各组大鼠缺血侧大脑皮层组织TNF-α、IL-1β含量的比较
与假手术组比较，模型组缺血侧大脑皮层组织TNF-α、IL-1β含量显著升高（P<0.05）。与模型组比较，雷公藤甲素中、高剂量组和丁苯酞组TNF-α、IL-1β含量显著降低（P<0.05）。与丁苯酞组比较，雷公藤甲素高剂量组TNF-α、IL-1β含量显著降低（P<0.05）。见表3。
表 3 各组大鼠缺血侧大脑皮层组织TNF-α、IL-1β含量的比较（$ \bar x \pm s $ ，n=6）组别 TNF-α（ng/g） IL-1β（pg/g） 假手术组 1.41±0.22 37.06±4.81 模型组 2.76±0.35* 68.42±7.79* 丁苯酞组 1.85±0.23△ 46.93±5.62△ 雷公藤甲素低剂量组 2.54±0.32 63.81±6.54 雷公藤甲素中剂量组 2.07±0.25△ 55.74±5.91△ 雷公藤甲素高剂量组 1.62±0.21△# 40.27±5.39△# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与丁苯酞组比较；△P<0.05，与模型组比较。 3.6 各组大鼠缺血侧大脑皮层组织TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达的比较
与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧大脑皮层组织TLR4、p-NF-κB蛋白相对表达量和p-NF-κB/NF-κB比值显著升高（P<0.05）。与模型组比较，雷公藤甲素中、高剂量组和丁苯酞组TLR4、p-NF-κB蛋白相对表达量和p-NF-κB/NF-κB比值显著降低（P<0.05）。与丁苯酞组比较，雷公藤甲素高剂量组TLR4、p-NF-κB蛋白相对表达量和p-NF-κB/NF-κB比值显著降低（P<0.05），见图3、表4。
图 3 各组大鼠缺血侧大脑皮层组织TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达的比较A. 假手术组；B. 模型组；C. 丁苯酞组；D. 雷公藤甲素低剂量组；E. 雷公藤甲素中剂量组；F. 雷公藤甲素高剂量组表 4 各组大鼠缺血侧大脑皮层组织TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达及p-NF-κB/NF-κB比值的比较（$\bar x \pm s$ ，n=6）组别 TLR4/β-actin NF-κB/β-actin p-NF-κB/β-actin p-NF-κB/NF-κB 假手术组 0.08±0.02 0.83±0.15 0.10±0.02 0.12±0.03 模型组 1.03±0.21* 0.78±0.14 0.81±0.15* 1.04±0.22* 丁苯酞组 0.20±0.04△ 0.84±0.15 0.29±0.06△ 0.35±0.08△ 雷公藤甲素低剂量组 0.87±0.16 0.79±0.16 0.68±0.13 0.86±0.18 雷公藤甲素中剂量组 0.65±0.13△ 0.78±0.15 0.35±0.07△ 0.45±0.10△ 雷公藤甲素高剂量组 0.16±0.03△# 0.74±0.14 0.14±0.03△# 0.19±0.04△# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与丁苯酞组比较；△P<0.05，与模型组比较。 3.7 各组大鼠缺血侧大脑皮层组织cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的比较
与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧大脑皮层组织cleaved Caspase-3、Bax蛋白相对表达量显著升高，Bcl-2相对表达量显著降低，Bax/Bcl-2比值显著升高（P<0.05）。与模型组比较，雷公藤甲素中、高剂量组和丁苯酞组cleaved Caspase-3、Bax相对表达量显著降低，Bcl-2相对表达量显著升高，Bax/Bcl-2比值显著降低（P<0.05）。与丁苯酞组比较，雷公藤甲素高剂量组cleaved Caspase-3、Bax相对表达量显著降低，Bcl-2相对表达量显著升高，Bax/Bcl-2比值显著降低（P<0.05）。见图4、表5。
图 4 各组大鼠缺血侧大脑皮层组织cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的比较A. 假手术组；B. 模型组；C. 丁苯酞组；D. 雷公藤甲素低剂量组；E. 雷公藤甲素中剂量组；F. 雷公藤甲素高剂量组表 5 各组大鼠缺血侧大脑皮层组织cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2比值的比较（$ \bar x \pm s $ ，n=6）组别 cleaved Caspase-3/
β-actinBcl-2/β-actin Bax/β-actin Bax/Bcl-2 假手术组 0.09±0.02 0.92±0.19 0.15±0.03 0.16±0.03 模型组 0.61±0.11* 0.18±0.04* 0.97±0.18* 5.39±1.07* 丁苯酞组 0.16±0.03△ 0.29±0.06△ 0.20±0.04△ 0.69±0.10△ 雷公藤甲素
低剂量组0.55±0.09 0.21±0.04 0.88±0.16 4.19±0.75△ 雷公藤甲素
中剂量组0.42±0.08△ 0.32±0.06△ 0.47±0.09△ 1.47±0.20△ 雷公藤甲素
高剂量组0.12±0.02△# 0.56±0.11△# 0.26±0.5△# 0.46±0.07△# *P<0.05，与假手术组比较；#P<0.05，与丁苯酞组比较；△P<0.05，与模型组比较。 4. 讨论
线栓法是CIRI动物模型制备的经典方法，具有操作简便、重复率高、与人类临床病理接近等优点。本实验结果显示，CIRI模型大鼠呈现明显的神经功能障碍，BBB通透性异常升高，缺血半暗带大脑皮层神经元呈现形态不规则、胞体萎缩呈空泡样变、着色较深、核膜边界不清、炎性细胞浸润等病理学改变，与杨欢欢等[15]研究结果一致。本研究发现，经雷公藤甲素中、高剂量或丁苯酞预处理能够明显改善CIRI大鼠神经功能，降低脑梗死率和BBB通透性，改善缺血半暗带大脑皮层神经元病变并降低其凋亡率，并且雷公藤甲素高剂量组效果优于丁苯酞组；而雷公藤甲素低剂量组上述作用并不显著。说明雷公藤甲素具有抑制大鼠CIRI的作用，该作用具有一定的剂量依赖性。
CIRI病理机制非常复杂，其中炎症损伤和神经元凋亡发挥着关键作用。熊莉等[16]报道CIRI可诱导小胶质细胞活化而释放TNF-α、IL-1β等促炎因子，引发脑组织炎症反应发生。TNF-α和IL-1β具备炎性趋化属性，其中TNF-α可刺激促炎因子大量释放，IL-1β可诱导炎性细胞浸润，加重炎症反应[17]。Bcl-2和Bax是定位于线粒体膜的两种蛋白，二者均属于bcl蛋白家族，在细胞线粒体凋亡途径中发挥着重要作用。Bax可诱导细胞色素C由线粒体通过膜孔道进入细胞质，活化位于细胞质的Caspase-3，cleaved Caspase-3能够切割破坏膜蛋白、结构蛋白等引发细胞凋亡[18]。Bcl-2能够抑制Cyt C释放而表现为抑凋亡作用，并且Bcl-2与Bax能够结合形成无活性的二聚体。TLR4是定位于小胶质细胞的一种跨膜识别受体，TLR4能够诱导NF-κB磷酸化，p-NF-κB核转位后与DNA特定位点结合而诱导TNF-α、IL-1β等炎症因子转录与表达，进而加重炎症损伤[19]。此外，p-NF-κB可通过调控Bcl-2、Bax表达而诱导细胞凋亡[20]。Zhai Y等[21]发现抑制TLR4/NF-κB通路介导的炎症反应和凋亡可减轻大鼠CIRI。本实验结果显示，经雷公藤甲素中、高剂量或丁苯酞预处理能够明显降低CIRI大鼠缺血侧大脑皮层组织TNF-α、IL-1β含量和TLR4、cleaved Caspase-3蛋白相对表达量，降低p-NF-κB/NF-κB、Bax/Bcl-2比值，并且雷公藤甲素高剂量组效果优于丁苯酞组，而雷公藤甲素低剂量组上述作用并不显著。说明雷公藤甲素对CIRI大鼠炎症反应缺血半暗带大脑皮层神经元凋亡具有抑制作用，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路活化有关，本结果与李晓蕾等[22]报道的药物抑制TLR4/NF-κB通路对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经具有保护作用的结果相似。
综上所述，雷公藤甲素能够保护BBB通透性，减轻CIRI大鼠神经功能缺失和神经元病变，降低脑梗死率，作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路及其介导的炎症反应和神经元凋亡有关。本研究结果为雷公藤甲素用于防治CIRI提供了理论依据。
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表 1 各组miR-449a表达水平比较
组别 miR-449a 对照组 1.16±0.08 LEF组 0.58±0.05* LEF+mimic组 2.04±0.16# mimic组 6.32±0.63* LEF+inhibitor组 0.41±0.06# inhibitor组 0.77±0.07* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 
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表 2 各组细胞的相对细胞活力比较（%）
组别 24 h 48 h 72 h 对照组 100.07±1.83 100.76±2.07 100.16±1.96 LEF组 103.67±2.06 110.83±2.15* 121.17±2.65* LEF+mimic组 99.98±2.14 98.57±2.11# 97.37±2.01# mimic组 97.54±1.97 91.79±2.35* 81.77±1.78* LEF+inhibitor组 107.68±2.08 118.67±3.07# 132.84±2.07# inhibitor组 104.31±1.79 111.38±2.67* 119.35±2.18* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 3 各组细胞增殖和凋亡情况比较
组别 克隆形成数目（个） 细胞凋亡率（%） 对照组 54.32±4.36 5.53±0.94 LEF组 87.66±7.24* 3.11±0.76* LEF+mimic组 60.82±6.06# 6.73±1.26# mimic组 31.12±3.78* 17.32±3.28* LEF+inhibitor组 119.35±5.08# 2.14±0.62# inhibitor组 92.71±7.89* 3.45±0.83* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 4 各组细胞α-SMA相对荧光强度比较
组别 α-SMA Col I 对照组 1.02±0.11 1.24±0.14 LEF组 2.36±0.47* 2.57±0.38* LEF+mimic组 1.53±0.34# 1.89±0.25# mimic组 0.47±0.05* 0.45±0.06* LEF+inhibitor组 3.25±0.18# 4.13±0.54# inhibitor组 2.48±0.15* 3.11±0.39* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 5 各组p-JNK/JNK相对水平比较
组别 p-JNK JNK p-JNK/JNK 对照组 2.04±0.18 2.16±0.16 0.94±0.09 LEF组 2.87±0.31 1.05±0.10 2.73±0.18* LEF+mimic组 1.67±0.19 2.24±0.21 0.75±0.07# mimic组 0.96±0.11 3.11±0.28 0.31±0.04* LEF+inhibitor组 3.04±0.24 1.10±0.10 2.76±0.25# inhibitor组 3.78±0.34 1.02±0.09 3.71±0.31* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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[1] JOSHI S, SINGH A R, WONG S S, et al. Rac2 is required for alternative macrophage activation and bleomycin induced pulmonary fibrosis; a macrophage autonomous phenotype[J]. PLoS One,2017,12(8):e0182851-e0182856. doi: 10.1371/journal.pone.0182851 [2] REN L M, LI R, CHEN L N, et al. Efficacy and safety of weekly leflunomide for the treatment of early rheumatoid arthritis: a randomized, multi-center study[J]. Int J Rheum Dis,2016,19(7):651-657. doi: 10.1111/1756-185X.12677 [3] BOCKHORN J, DALTON R, NWACHUKWU C, et al. MicroRNA-30c inhibits human breast tumour chemotherapy resistance by regulating TWF1 and IL-11[J]. Nat Commun,2013,4: 4(1):1393-1398. [4] LI J, LU M J, JIN J, et al. MiR-449a suppresses tamoxifen resistance in human breast cancer cells by targeting ADAM22[J]. Cell Physiol Biochem,2018,50(1):136-149. doi: 10.1159/000493964 [5] HAN R H, JI X M, RONG R, et al. MiR-449a regulates autophagy to inhibit silica-induced pulmonary fibrosis through targeting Bcl2[J]. J Mol Med,2016,94(11):1267-1279. doi: 10.1007/s00109-016-1441-0 [6] TANG Y N, GENG Q, CHEN D, et al. Germline proliferation is regulated by somatic endocytic genes via JNK and BMP signaling in Drosophila[J]. Genetics,2017,206(1):189-197. doi: 10.1534/genetics.116.196535 [7] HUANG Y, MA S F, ESPINDOLA M S, et al. Microbes are associated with host innate immune response in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med,2017,196(2):208-219. doi: 10.1164/rccm.201607-1525OC [8] DENG F, ZHANG P, FENG J, et al. Effect of leflunomideon inflammatory factors and immune function in rats with chronic glomerulonephritis[J]. J Sichuan Univ Med Sci Ed,2016,47(2):217-221. [9] PATEL A, ZHANG S J, PARAMAHAMSA M, et al. Leflunomide induces pulmonary and hepatic CYP1A enzymes via aryl hydrocarbon receptor[J]. Drug Metab Dispos,2015,43(12):1966-1970. doi: 10.1124/dmd.115.066084 [10] SCOTT D L. Interstitial lung disease and disease modifying anti-rheumatic drugs[J]. Lancet,2004,363(9416):1239-1240. [11] SAKAI F, NOMA S, KURIHARA Y, et al. Leflunomide-related lung injury in patients with rheumatoid arthritis: imaging features[J]. Mod Rheumatol,2005,15(3):173-179. doi: 10.3109/s10165-005-0387-9 [12] RYU C, SUN H X, GULATI M, et al. Extracellular mitochondrial DNA is generated by fibroblasts and predicts death in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med,2017,196(12):1571-1581. doi: 10.1164/rccm.201612-2480OC [13] ISHIDA Y, KIMURA A, NOSAKA M, et al. Essential involvement of the CX3CL1-CX3CR1 axis in bleomycin-induced pulmonary fibrosis via regulation of fibrocyte and M2 macrophage migration[J]. Sci Rep,2017,7(1):16833-16837. doi: 10.1038/s41598-017-17007-8 [14] LIANG L, HUIJUAN L, LIANJIANG D, et al. MiR-449a suppresses LDHA-mediated glycolysis to enhance the sensitivity of non-small cell lung cancer cells to ionizing radiation[J]. Oncol Res Feat Preclin Clin Cancer Therap,2017,26(4):547-556. [15] WU D D, LIU J, CHEN J L, et al. MiR-449a suppresses tumor growth, migration, and invasion in non-small cell lung cancer by targeting a HMGB1-mediated NF-κB signaling pathway[J]. Oncol Res,2019,27(2):227-235. doi: 10.3727/096504018X15213089759999 [16] ZHANG J, GAO F D, NI T J, et al. Linc-POU3F3 is overexpressed in in-stent restenosis patients and induces VSMC phenotypic transformation via POU3F3/miR-449a/KLF4 signaling pathway[J]. Am J Transl Res,2019,11(7):4481-4490. [17] SATO-MATSUBARA M, MATSUBARA T, DAIKOKU A, et al. Fibroblast growth factor 2(FGF2) regulates cytoglobin expression and activation of human hepatic stellate cells via JNK signaling[J]. J Biol Chem,2017,292(46):18961-18972. doi: 10.1074/jbc.M117.793794 [18] YANG Y L, YE Y J, QIU Q, et al. Triptolide inhibits the migration and invasion of rheumatoid fibroblast-like synoviocytes by blocking the activation of the JNK MAPK pathway[J]. Int Immunopharmacol,2016,41:8-16. doi: 10.1016/j.intimp.2016.10.005 [19] SHINGYOCHI Y, KANAZAWA S, TAJIMA S, et al. A low-level carbon dioxide laser promotes fibroblast proliferation and migration through activation of akt, ERK, and JNK[J]. PLoS One,2017,12(1):e0168937-e0168937. doi: 10.1371/journal.pone.0168937 -
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