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近年来,随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加,侵袭性真菌感染(IFIs)的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌,并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中,白念珠菌(Candida. albicans)是院内血液感染最常见的致病菌原体,其在重症监护病房(ICU)患者中致病率超过17%,病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括:多烯类(两性霉素B)、核酸类(5-氟胞嘧啶)、唑类(氟康唑)和棘白菌素类(卡泊芬净)药物(图1)[6-7]。然而,由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用,IFIs的治疗效果相当有限。因此,迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰(包括组蛋白乙酰化和去乙酰化)是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除,对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向,且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道,真菌中的HDACs,如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此,抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节,其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用,这可能与真菌对各种环境(包括药物)的应激反应有关[16]。此外,已有研究报道,HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如,HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此,本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂(图2)进行体外协同抗真菌活性测试,筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性,以及对正常细胞的毒性作用,以期为抗真菌药物的研发提供依据。
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表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明,8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性(MIC80>64 μg/ml);而化合物Rocilinostat(FICI=0.039)和伏立诺他(FICI=0.125)与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中,化合物Rocilinostat的协同活性最佳,值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)
抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同,FICI值> 4表示拮抗;0.5<FICI<4表示不相关。 -
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用,挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示,Rocilinostat与FLC联合使用时,对两株耐FLC的白念珠菌(C. albicans 9173,FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5)和对FLC敏感的光滑念珠菌(C. glabrata 9073)表现出协同增效作用,而对热带念珠菌(C. tropicis)和耳道念珠菌(C. auris)没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑(VRC)联用时,对耐VRC的白念珠菌(C. albicans 10060, FICI=0.033)表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]
菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]
菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 -
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性,我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出,高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用,而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长,且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
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采用HUVEC(人脐静脉内皮细胞)对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示,化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性,IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml),相当于其发挥协同抗耐药真菌(C. albicans 0304103)活性MIC80值的44倍,表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外,我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性,结果表明,Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性(IC50=0.41 μmol/L)优于泛HDAC抑制剂伏立诺他(IC50=1.03 μmol/L)。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)
化合物 HUVEC 白念珠菌(总HDAC酶) Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。
Antifungal activity study on HDAC inhibitor Rocilinostat
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摘要:
目的 探索组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂与唑类药物联用对唑类耐药念珠菌的体外协同的抗真菌活性。 方法 根据棋盘稀释法,测试HDAC抑制剂和唑类药物联用对临床耐药株的协同抗真菌活性,通过时间-生长曲线实验和细胞毒性实验对化合物Rocilinostat的抑菌效果、毒性进行考察。 结果 化合物Rocilinostat与唑类药物联用对多种耐药白念珠菌和光滑念珠菌均表现出优秀的协同抗真菌活性,并且其在高浓度下与氟康唑联用表现出抑菌效果。此外,化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性,且对白念珠菌HDAC具有强烈的抑制活性,优于对照药伏立诺他。 结论 化合物Rocilinostat作为真菌HDAC抑制剂,具有优秀的体外协同抗真菌活性,且对真菌细胞具有较好的选择性作用。 -
关键词:
- 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 /
- 体外协同抗真菌活性 /
- 耐药 /
- 白念珠菌
Abstract:Objective To evaluate the in vitro synergistic antifungal activity of HDAC inhibitors in combination with azole drugs against azoles-resistant Candida strains. Methods The checkerboard microdilution method was used to evaluate the antifungal activity of the HDAC inhibitors in combination with azole drugs against clinically drug-resistant strains. The fungistatic activity and toxicity of Rocilinostat was determined through time-growth curve assay and cytotoxicity assay. Results The compound Rocilinostat combined with azole drugs showed excellent synergistic antifungal activity against a variety of azoles-resistant Candida albicans and Candida glabrata. The combination of high concentration Rocilinostat with FLC exhibited fungistatic effects. Very low toxicity was detected with Rocilinostat towards normal cells. Rocilinostat showed better HDAC inhibitory activity than SAHA. Conclusion As a fungi HDAC inhibitor, Rocilinostat has excellent in vitro synergistic antifungal activity and no severe toxicity to normal human cells. -
Key words:
- HDAC inhibitors /
- in vitro synergistic antifungal activity /
- resistant /
- Candida albicans
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表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)
抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同,FICI值> 4表示拮抗;0.5<FICI<4表示不相关。 表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]
菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]
菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)
化合物 HUVEC 白念珠菌(总HDAC酶) Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 -
[1] FISHER M C, HAWKINS N J, SANGLARD D, et al. Worldwide emergence of resistance to antifungal drugs challenges human health and food security[J]. Science,2018,360(6390):739-742. doi: 10.1126/science.aap7999 [2] BROWN G D, DENNING D W, LEVITZ S M. Tackling human fungal infections[J]. Science,2012,336(6082):647. doi: 10.1126/science.1222236 [3] PFALLER M A, DIEKEMA D J. Epidemiology of invasive mycoses in North America[J]. Crit Rev Microbiol,2010,36(1):1-53. doi: 10.3109/10408410903241444 [4] PFALLER M A, DIEKEMA D J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem[J]. Clin Microbiol Rev,2007,20(1):133-163. doi: 10.1128/CMR.00029-06 [5] WISPLINGHOFF H, BISCHOFF T, TALLENT S M, et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24, 179 cases from a prospective nationwide surveillance study[J]. Clin Infect Dis,2004,39(3):309-317. doi: 10.1086/421946 [6] ODDS F C. Genomics, molecular targets and the discovery of antifungal drugs[J]. Rev Iberoam Micol,2005,22(4):229-237. doi: 10.1016/S1130-1406(05)70048-6 [7] ODDS F C, BROWN A J P, GOW N A R. Antifungal agents: mechanisms of action[J]. Trends Microbiol,2003,11(6):272-279. doi: 10.1016/S0966-842X(03)00117-3 [8] KIM J, LEE J E, LEE J S. Histone deacetylase-mediated morphological transition in Candida albicans[J]. J Microbiol,2015,53(12):805-811. doi: 10.1007/s12275-015-5488-3 [9] CUI L, MIAO J, FURUYA T, et al. Histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid causes changes in global gene expression during in vitro Plasmodium falciparum development[J]. Eukaryot Cell,2008,7(7):1200-1210. doi: 10.1128/EC.00063-08 [10] LEE I, OH J H, SHWAB E K, et al. HdaA, a class 2 histone deacetylase of Aspergillus fumigatus, affects germination and secondary metabolite production[J]. Fungal Genet Biol,2009,46(10):782-790. doi: 10.1016/j.fgb.2009.06.007 [11] LOHSE M B, JOHNSON A D. Temporal anatomy of an epigenetic switch in cell programming: the white-opaque transition of C. albicans[J]. Mol Microbiol,2010,78(2):331-343. doi: 10.1111/j.1365-2958.2010.07331.x [12] HNISZ D, SCHWARZMÜLLER T, KUCHLER K. Transcriptional loops meet chromatin: a dual-layer network controls white-opaque switching in Candida albicans[J]. Mol Microbiol,2009,74(1):1-15. doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.06772.x [13] ROBBINS N, LEACH M D, COWEN L E. Lysine deacetylases Hda1 and Rpd3 regulate Hsp90 function thereby governing fungal drug resistance[J]. Cell Rep,2012,2(4):878-888. doi: 10.1016/j.celrep.2012.08.035 [14] LIU O W, CHUN C D, CHOW E D, et al. Systematic genetic analysis of virulence in the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans[J]. Cell,2008,135(1):174-188. doi: 10.1016/j.cell.2008.07.046 [15] DUMESIC P A, HOMER C M, MORESCO J J, et al. Product binding enforces the genomic specificity of a yeast polycomb repressive complex[J]. Cell,2015,160(1-2):204-218. doi: 10.1016/j.cell.2014.11.039 [16] 黄海, 王彦, 李莹, 等. 白念珠菌的应激反应与耐药性[J]. 第二军医大学学报, 2010, 31(11):1239-1243. [17] KMETZSCH L. Histone deacetylases: Targets for antifungal drug development[J]. Virulence,2015,6(6):535-536. doi: 10.1080/21505594.2015.1049807 [18] SU S, LI X Y, YANG X M, et al. Histone acetylation/deacetylation in Candida albicans and their potential as antifungal targets[J]. Futur Microbiol,2020,15(11):1075-1090. doi: 10.2217/fmb-2019-0343 [19] PFALLER M A, MESSER S A, GEORGOPAPADAKOU N, et al. Activity of MGCD290, a Hos2 histone deacetylase inhibitor, in combination with azole antifungals against opportunistic fungal pathogens[J]. J Clin Microbiol,2009,47(12):3797-3804. doi: 10.1128/JCM.00618-09