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雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中大鼠的治疗作用

董雅芬 王建 陈业 李姝姝 刘河龙 邱彦

丁华敏, 郭羽晨, 秦春霞, 宋志兵, 孙莉莉. 消风止痒颗粒通过降低白三烯水平对小鼠特应性皮炎急性瘙痒的治疗作用研究[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 211-216. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202306031
引用本文: 董雅芬, 王建, 陈业, 李姝姝, 刘河龙, 邱彦. 雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中大鼠的治疗作用[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(1): 40-44, 49. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202111111
DING Huamin, GUO Yuchen, QIN Chunxia, SONG Zhibing, SUN Lili. Therapeutic effect of Xiaofeng Zhiyang granules on acute itching in mice with atopic dermatitis by decreasing leukotriene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 211-216. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202306031
Citation: DONG Yafen, WANG Jian, CHEN Ye, LI Shushu, LIU Helong, QIU Yan. Therapeutic effects of estrogen-intervened EPCs transplantation on diabetic ischemic stroke rats[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(1): 40-44, 49. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202111111

雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中大鼠的治疗作用

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202111111
基金项目: 浦东新区卫生健康委员会领先人才培养项目(PRWL2020-08); 上海市浦东新区人民医院科技项目(E17-04)
详细信息
    作者简介:

    董雅芬,主管药师,研究方向:临床药学,Tel:13916459623,Email:dongyafen7y@126.com

    通讯作者: 邱 彦,主任药师,研究方向:临床药理,Tel:13918439781,Email:qiuyan2189@163.com

Therapeutic effects of estrogen-intervened EPCs transplantation on diabetic ischemic stroke rats

  • 摘要:   目的   探讨雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中的治疗作用。  方法   制备大鼠糖尿病缺血性脑卒中模型,24 h后通过尾静脉移植经PKH26标记的糖尿病EPCs和雌激素干预的糖尿病EPCs。移植3 d后测定各组大鼠脑缺血体积、大鼠行为学变化、缺血部位血管新生及EPCs的归巢情况。  结果   与糖尿病脑缺血大鼠相比,雌激素干预的糖尿病EPCs移植能降低脑缺血体积、改善行为学评分和缺血部位的血管新生及促进EPCs归巢到损伤部位(P<0.05)。  结论   雌激素干预的糖尿病EPCs移植,通过促进EPCs归巢和血管新生对糖尿病缺血性脑卒中有较好的治疗作用。
  • 放射性核素是指不稳定原子核自发地放出射线通过衰变形成稳定的核素,能够通过皮肤伤口、呼吸道及消化道吸收进入体内,增加了肿瘤、畸变、遗传性病变发生率,严重影响人体健康。放射性材料在诸如核工业、能源生产、研究和开发以及医学等各种领域中的使用越来越多,而产生的放射性废物对人类具有严重危害。自2011年福岛第一核电站事故以来,公众对长期暴露于该核电站释放辐射造成的健康一直高度关注[1]。因此,如何进行核辐射的有效防护一直是研究难点和重点。

    有效清除放射性核素的常用手段包括螯合剂或吸附剂,其中多糖是近年发展起来的具有优良吸附作用的分子。多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链,是至少超过10个单糖组成的聚合糖,也是高分子碳水化合物。其中天然多糖,如海藻酸盐、壳聚糖、纤维素等,分子链上具有多种官能团,通过物理和化学相互作用与多种分子结合,也可以通过共混、接枝或与具有额外官能团的各种纳米材料混合的形式引入额外的功能基团,从而增强其吸附能力。多糖的吸附性能不仅与吸附剂上特定官能团的类型和数量有关,还受吸附剂比表面积和吸附位点暴露程度的影响。

    本综述概括了主要放射性核素类型及其对人体的危害,总结了多糖在放射性核素清除方面的最新研究进展。多糖作为核战争、核事故等突发核事件中放射性核素有效吸附分子,应用前景广阔。

    铀是一种重金属放射性核素,可作为核反应燃料。肾、肝、肺、脑、中枢神经是铀毒性累积的靶向组织[2]。铀污染会诱发行为障碍,影响神经化学和神经生理特性,还会导致肾小管上皮细胞间隙增大、上皮细胞肿胀和坏死、间质纤维化,引起尿素氮和血肌酐升高。在长期接触贫铀的情况下,易发生免疫毒性、胚胎毒性和肝毒性,罹患肿瘤风险增加[3]

    镉半衰期长达10~30年,不易被生物清除,从而导致其易在生物体内累积[4]。镉暴露可破坏中枢神经系统功能,对另一靶器官肾的主要损伤部位是近端小管,可导致线粒体电子传递链功能障碍和活性氧产生[5]。在单一暴露分析中,单独暴露于镉会显著增加患肾结石的风险,尿镉、钴与肾结石的风险呈正相关,此关联在老年人中尤为显著[6]。对于肥胖、高脂血症、代谢综合征等慢性病患者,镉暴露会进一步增加慢性肾病和肾衰竭风险[7]

    在切尔诺贝利事故患者中出现的几种心血管损伤可能与钴暴露有关。钴暴露引起的心肌小病灶损伤和血流动力学变化可能会导致心律和血管紧张度紊乱[8]。钴还可能对神经系统造成影响,钴接触工人表现出与注意力和语言记忆困难有关的明显认知缺陷,还会增加精神类疾病和视力下降风险[9, 10]

    氡是一种比空气重、具有放射性的气体,是镭衰变的结果。氡主要通过吸入进入人体,且氡衍生物是引发肺癌的第二危险因素,仅次于吸烟[11]。2010年室内氡暴露导致的肺癌死亡人数占韩国肺癌死亡总数的12.5%~24.7%[12];2012年,66个国家因氡导致的肺癌死亡总数为226 057例[13]。欧洲和北美地下矿井工人由于长期接触氡气,肿瘤发病率大幅增加,其中以肺癌风险最高[14]

    镭的所有同位素都具有强烈的放射性,易诱发儿童和成人的骨肿瘤、生长障碍、骨软骨瘤和白内障等。镭与儿童恶性骨肿瘤发病率密切相关,年龄越小,影响越严重[15]

    碘主要供给甲状腺激素合成。I131半衰期较长,大剂量I131会导致甲状腺肿大,甲状腺结节或萎缩,最终导致甲状腺癌发生率增加,且I131导致的甲状腺机能亢进患者中,60%会出现房颤现象[16]

    图  1  常见放射性核素对人体的危害

    放射性核素清除最常使用的螯合剂是二乙基三胺五乙酸(DTPA),但由于其选择性差,易与体内 Ca2+、Zn2+等有益金属离子发生配位反应,导致肾毒性、致畸性、胚胎毒性等多种副作用,目前已很少应用[17]。多糖多为天然来源,不仅能通过吸附清除放射性核素,还具有安全性好、生物相容性、清除率高等优点,是极具潜力的放射性核素清除剂。可用于有效清除放射性核素的多糖包括以下几种。

    壳聚糖来源于甲壳质的脱乙酰化,由于分子内和分子间氢键的存在,使其具有规则的线性分子链和良好的结晶性能。壳聚糖还具有价廉、资源丰富、吸附能力强、可再生、抗拉强度高、生物降解性和抗菌性能好等优点,被认为是绿色吸附剂[18]图2A)。壳聚糖吸附机制可能包括配位作用、阳离子交换和静电吸附,壳聚糖的羟基团和氨基团还能与铯形成稳定配位键。影响壳聚糖吸附效果的因素主要为pH、温度和吸附时间等。当pH>2时,壳聚糖吸附效率随pH升高而提高;除铜在pH=8时吸附效率最高之外,壳聚糖对铯、铕、铜在pH=8时达到最大吸附效率。在弱酸性条件下吸附效率高可能是因为低浓度H+和H3O+降低了与阳离子壳聚糖的竞争,增加了壳聚糖的吸附位点。

    图  2  常见用于吸附放射性核素多糖的化学结构式
    A. 壳聚糖;B. 果胶;C. 羧甲基纤维素;D. 海藻酸钠;E. 魔芋葡甘聚糖

    壳聚糖可通过制备成凝胶、静电纺丝、微球等剂型来吸附核素。目前大多数壳聚糖吸附剂呈颗粒状,不利于官能团的暴露,减少了吸附位点,降低了吸附效率。通过制备成微球、无定形粉末、纤维等剂型,可大大增加表面积、暴露更多吸附位点以提高吸附性能。采用湿法纺丝制备的均匀纤维状壳聚糖吸附剂,比颗粒状壳聚糖具有吸附容量高、吸附速率快、比表面积大、机械强度优良等优点,纤维状壳聚糖对Co2+的吸附效率为4.3 mg/g,明显高于颗粒状壳聚糖(2.3 mg/g)[19]

    壳聚糖的实际应用受制于其酸性降解和热稳定性差、机械强度低、比表面积低等缺点,通过化学修饰可克服上述缺点,拓宽其实用价值。羧甲基壳聚糖是壳聚糖经羧甲基化后得到的一种线形水溶性高分子,因分子内含有大量的乙二胺四乙酸式结构而对金属离子具有很好的螯合吸附性能。与壳聚糖水凝胶相比,羧甲基壳聚糖超分子水凝胶在保湿能力、水溶性、生物降解性、生物相容性、抗氧化活性、抗菌性能等方面表现出更明显的优势。同时由于其具有更多的螯合基团,结合其本身吸附能力,因此对放射性核素清除效率更高[20]。壳聚糖与DTPA联用形成的纳米粒对吸入不溶性贫铀粒子具有明显吸附作用;结合肺灌洗,壳聚糖还能帮助DTPA进入细胞内,提高肺组织中贫铀的清除率[21]

    海藻酸盐由1,4-β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸组成(图2D),它可与二价、三价阳离子配位,是一种无毒、可生物降解的低成本天然多糖[22]

    海藻酸盐吸附核素离子有两种方式:物理吸附和化学吸附。物理吸附主要基于静电吸附;化学吸附则分为两种:一种是阳离子之间的离子交换,另一种是核素与海藻酸盐的羟基和羧基产生配位反应,形成配位物[23]。海藻酸盐的吸附效率显著受pH变化的影响。由于其含有大量的羧基和羟基官能团,在低pH溶液中,吸附位点逐渐被质子化,这会导致官能团的螯合作用减弱,并且离子之间产生的静电斥力进一步降低了吸附能力[24-25]。海藻酸盐吸附还依赖温度变化,温度通过影响海藻酸盐表面化学结构来控制吸附。由于吸附过程是吸热过程,适当提高温度可提高吸附容量;但高温也会导致孔径变大,从而使脱吸附率比吸附率高,降低吸附效率[26]

    海藻酸盐可与其他螯合剂联用发挥清除作用。聚丙烯酰胺、海藻酸钠和二乙烯三胺五乙酸混合后制备水凝胶,可有效清除小鼠皮肤创面的放射性锶,并能有效阻止放射性锶通过皮肤创面的吸收。此外,水凝胶剂型还可有效促进放射性核素污染伤口中的肉芽组织形成,促进创面愈合[27]

    不同多糖联用,可通过不同机制协同发挥核素清除作用,提高清除效率。如将海藻酸盐与浒苔多糖复合,为海藻酸钠凝胶引入了更多的活性吸附位点,提高了对重金属的吸附效率[28]

    纤维素经羧甲基化后可得到羧甲基纤维素(CMC)(图2C),其结构中含有丰富的羟基和羧基,被称为超吸附材料。同时CMC具有亲水性、生物黏附性、pH敏感性等优点,常用于药物递送和其他生物医学研究[29]

    载普鲁士蓝羧甲基纤维素大孔纳米纤维膜能有效吸附铯,这主要是由于羧甲基纤维素钠纳米纤维膜具有表面积大和高度多孔的结构,增加了吸附位点,提高了吸附容量[30]。通过植酸改性的CMC对137Cs具有特异吸附性,且能大大提高137Cs吸附速率[31]。在Cu(Ⅱ)离子交联法制备的羧甲基纤维素水凝胶中引入聚乙二醇6 000以增加水凝胶羟基数量。该水凝胶在吸水溶胀后,其内部孔隙和表面积显著增加,从而暴露了更多吸附位点,提高了整体吸附效果[32]。羧甲基纤维素钠温敏水凝胶可实现低温吸附、高温脱吸附,其吸附UO22+的主要机制是含氧基团和U(Ⅵ)之间能形成复合物[33]

    葡甘聚糖主要来源于自然界广泛存在的魔芋,因此又称为魔芋葡甘聚糖(KGM)。KGM具有良好的持水能力、稳定性、成膜性、增稠性、乳化性等。KGM主链的化学结构是由D-葡萄糖和D-甘露糖缩合形成的共聚物,具有丰富的羧基和羟基[34]。魔芋葡甘聚糖通过羧甲基化可得到羧甲基魔芋葡甘聚糖,能获得更大的吸附容量。其吸附过程主要是通过离子交换和吸附剂表面羟基的配位完成,是一个吸热和自发的过程。KGM带有负电荷,能通过静电作用和氢键提高吸附力;引入结冷胶后,能形成双网络凝胶微球,该凝胶微球具有极高的机械强度,在强酸条件下仍稳定性良好,对铀的最大吸附容量可达到98.10 mg/g[35]。一氯乙酸改性魔芋葡甘聚糖可吸附重金属离子,且羧甲基取代度越高,越有利于吸附。羧甲基魔芋葡甘聚糖可重复使用,且不会明显改变其吸附容量[36]

    果胶是一种天然多糖,也可作为可溶性膳食纤维。果胶聚合物链主要通过1,4-α-半乳糖醛酸单元构成。果胶吸附核素主要通过其结构中的羟基,酯化度较低的果胶具有较强的吸附能力。儿童服用果胶后放射性铯含量降低了33%,也可显著降低对铀的吸收[37]

    将果胶和普鲁士蓝制备成珠状杂化吸附剂,可有效吸附铯,其吸附容量可达(36.5±0.8)mg/g,该杂化吸附剂具有明显协同作用,吸附效率显著高于预期。可能普鲁士蓝粉末的存在改变了果胶结构,增加了吸附位点的暴露,使更多铯离子能被捕获和吸附[38]

    多糖清除核素的机制是主要通过其结构中的羟基和羧基等基团与核素发生配位、阳离子交换和静电吸附等作用。除上述多糖之外,甲壳素、木薯淀粉等通过静电作用或螯合作用也可发生吸附,但因其溶解性差、弱机械性能而限制了应用[39, 40]

    核技术在军事、医学等领域的广泛应用,给人们带来便捷的同时,也增加了核辐射暴露的风险。尤其是近期福岛核电站废水的排放更是给我国生态环境、人民健康带来了巨大的安全隐患和挑战。目前,放射性核素清除面临着品种少、清除效率低、副作用大等问题,对螯合剂、吸附剂、促排剂等的深入广泛研究将为清除放射性核素提供更高效、安全的方案。多糖具有安全、生物相容性好、吸附效率高等优势,将其与凝胶、纳米粒、纳米纤维、多孔微球等剂型有机结合,将进一步提高放射性核素吸附效率,为核战争、核事故等紧急条件下高效、安全清除核素提供新策略。

  • 图  1  雌激素干预糖尿病EPCs移植降低大鼠脑缺血体积

    A.各组大鼠脑切片TTC染色;B.各组大鼠脑缺血体积组间比较。*P<0.05,**P<0.01,与CI组比较;#P<0.05, ##P<0.01,与DM+CI组比较。

    图  2  各组大鼠水迷宫游泳轨迹图

    图  3  雌激素干预糖尿病EPCs移植改善缺血区血管新生功能

    A.缺血部位的VEGFR2免疫荧光染色;B.新生血管计数分析。每个样本随机选取5个视野计算新生血管数量,并计算平均值。*P<0.05,**P<0.01,与 CI组比较;##P<0.01,与 DM+CI组比较。

    图  4  PKH26染色观察脑缺血区域EPCs细胞归巢

    注:DAPI:细胞DNA染料。

    表  1  不同处理组大鼠Morris迷宫实验指标对比($\bar x $+s

    组别(n=8)总时间(s)总路程(mm)平均速度(mm/s)潜伏期(s)
    CI30.71±18.286721.56±4838.88198.36±78.7426.34±21.20
    DM+CI35.15±15.29*7855.55±4262.89*197.49±59.927.93±20.36
    DM+CI+EPCs29.49±13.46#7459.41±4829.74236.85±56.49#25.14±16.04
    DM+CI+EPCs+estrogen28.80±13.75##8477.04±5226.29269.68±94.16##22.41±14.16##
    *P<0.05,与CI组比较;#P<0.01,##P<0.01,与DM+CI组比较。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-11-30
  • 修回日期:  2022-04-19
  • 网络出版日期:  2023-07-14
  • 刊出日期:  2023-01-25

雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中大鼠的治疗作用

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202111111
    基金项目:  浦东新区卫生健康委员会领先人才培养项目(PRWL2020-08); 上海市浦东新区人民医院科技项目(E17-04)
    作者简介:

    董雅芬,主管药师,研究方向:临床药学,Tel:13916459623,Email:dongyafen7y@126.com

    通讯作者: 邱 彦,主任药师,研究方向:临床药理,Tel:13918439781,Email:qiuyan2189@163.com

摘要:   目的   探讨雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中的治疗作用。  方法   制备大鼠糖尿病缺血性脑卒中模型,24 h后通过尾静脉移植经PKH26标记的糖尿病EPCs和雌激素干预的糖尿病EPCs。移植3 d后测定各组大鼠脑缺血体积、大鼠行为学变化、缺血部位血管新生及EPCs的归巢情况。  结果   与糖尿病脑缺血大鼠相比,雌激素干预的糖尿病EPCs移植能降低脑缺血体积、改善行为学评分和缺血部位的血管新生及促进EPCs归巢到损伤部位(P<0.05)。  结论   雌激素干预的糖尿病EPCs移植,通过促进EPCs归巢和血管新生对糖尿病缺血性脑卒中有较好的治疗作用。

English Abstract

丁华敏, 郭羽晨, 秦春霞, 宋志兵, 孙莉莉. 消风止痒颗粒通过降低白三烯水平对小鼠特应性皮炎急性瘙痒的治疗作用研究[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(5): 211-216. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202306031
引用本文: 董雅芬, 王建, 陈业, 李姝姝, 刘河龙, 邱彦. 雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中大鼠的治疗作用[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(1): 40-44, 49. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202111111
DING Huamin, GUO Yuchen, QIN Chunxia, SONG Zhibing, SUN Lili. Therapeutic effect of Xiaofeng Zhiyang granules on acute itching in mice with atopic dermatitis by decreasing leukotriene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 211-216. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202306031
Citation: DONG Yafen, WANG Jian, CHEN Ye, LI Shushu, LIU Helong, QIU Yan. Therapeutic effects of estrogen-intervened EPCs transplantation on diabetic ischemic stroke rats[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(1): 40-44, 49. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202111111
  • 糖尿病脑血管并发症是其致死致残的常见原因。鉴于内皮祖细胞(EPCs)在血管形成中的重要作用,近年来在心脑血管方面的研究越来越受到重视。多项研究证实EPCs移植治疗对脑缺血性疾病有改善作用[1-2]。然而糖尿病可影响EPCs功能[3],单纯EPCs移植治疗的效果并不理想。前期研究证实雌激素体外孵育可改善糖尿病大鼠的EPCs的功能。因此,本研究通过分离培养糖尿病大鼠EPCs,经雌激素孵育后对糖尿病缺血性脑卒中大鼠进行移植治疗并评价治疗的效果,为临床治疗糖尿病脑血管并发症提供新的思路。

    • 雄性Wistar大鼠,体重(180±10)g(上海斯莱克实验动物有限公司)。动物房保持室温在22 ℃左右,相对湿度70%左右。所有实验动物均符合实验动物伦理学要求。

    • 雌激素 (Abcam公司);链脲佐菌素(Sigma aldrich公司); EGM-2 培养基(LON-ZA 公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC, Sigma Aldrich);水合氯醛、甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司)。

    • Wistar雄性大鼠,10~12周,适应性地喂养1周后,连续7 d空腹腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)55 mg/(kg·d),对照组大鼠腹腔注射等体积枸橼酸钠缓冲液。7 d后测空腹血糖(禁食12 h),将血糖值为(13.5~25) mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠进行实验。

    • 分离收集大鼠骨髓,采用密度梯度离心法获取骨髓单核细胞。将单核细胞重悬于培养基EGM-2并调整细胞浓度至1×106个/ml并接种于预先包被好纤维连接蛋白的细胞培养皿,置于细胞培养箱37 ℃和5%CO2条件下培养。培养3 d后洗去未贴壁细胞,继续培养至7 d。PBS洗去未贴壁细胞,贴壁细胞供实验用。

    • 将消化下来的细胞悬液置于无菌离心管中,加入M199培养基离心后弃掉上清液。加入1 ml稀释液C重悬细胞。PKH26染料用稀释液C稀释。将细胞悬液加入到PKH26稀释液中,立即用吸管混匀样本,在25 ℃孵育2~5 min,并定时轻轻的颠倒离心管保证充分混匀。加入等量血清孵育1 min终止染色反应。细胞清洗3次后用PBS重悬备用。

    • 1.5%异氟烷在氮气/氧气(70/30)吸入式麻醉后,大鼠手术期间置于保温垫上维持体温在(37±0.5) ℃,在体视显微镜下分离出左侧颈总、颈内和颈外动脉,结扎颈外及颈总动脉,从一侧颈总动脉插入线栓经颈内动脉至大脑中动脉并阻断其血流,手术期间应用激光散斑仪实时监测小鼠大脑皮层血流量的变化情况。

    • 实验分3组:①对照组和②糖尿病组:M199培养基;③雌激素组:含雌激素10 nmol/L的M199培养基。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h 后进行实验。

    • 实验动物分4组:①正常雄性Wistar大鼠脑缺血组(CI);②糖尿病大鼠脑缺血组(DM+CI);③接受糖尿病大鼠EPCs移植治疗的糖尿病大鼠组(DM+CI+EPCs);④接受经雌激素体外干预糖尿病EPCs移植治疗的糖尿病大鼠(DM+CI+EPCs+estrogen)。所有大鼠行脑缺血术后24 h,③和④组大鼠经尾静脉注入相应的经PKH26标记的EPCs悬液(1×106个细胞,悬于PBS中),①和②组经尾静脉注入等体积PBS。术后3 d进行实验。

    • 移植后3 d,大鼠麻醉处死取脑,将各组大鼠脑组织切为厚约3 mm的切片并浸入1% TTC中,37 ℃染色30 min。正常脑组织TTC染色为鲜红色,而缺血区脑组织为白色,拍照并计算脑缺血体积。

    • 移植后3 d,取各组大鼠脑组织做冰冻切片,160倍荧光显微镜下观察并获取图像,计数PKH26标记的细胞数并统计分析。同时进行VEGFR2免疫组化,每张切片取5个不同视野在160倍荧光显微镜下观察计数新生小管数。

    • 与CI组比较,DM+CI组脑梗死体积明显增加(P<0.01);经EPCs移植治疗后糖尿病大鼠的脑缺血体积明显减小且经雌激素体外干预后的EPCs移植能进一步减少脑缺血梗死体积,说明雌激素干预可能加强了EPCs对脑卒中大鼠脑部缺血损伤的治疗作用(P<0.05, P<0.01,与 DM+CI组比较; P<0.05, 与 CI组比较),见图1

      图  1  雌激素干预糖尿病EPCs移植降低大鼠脑缺血体积

    • 水迷宫实验结果显示, DM+CI组大鼠游泳路程和总时间相较于CI组明显增加(P<0.05),平均速度和潜伏时间则无明显变化(P>0.05);与DM+CI组比较,DM+CI+EPCs组以及DM+CI+EPCs+ estrogen组游泳总时间明显缩短(P<0.05),平均速度均明显提高(P<0.05),游泳总路程则无明显变化(P>0.05);但只有DM+CI+EPCs+ estrogen组潜伏期明显降低(P<0.01),见图2表1

      图  2  各组大鼠水迷宫游泳轨迹图

      表 1  不同处理组大鼠Morris迷宫实验指标对比($\bar x $+s

      组别(n=8)总时间(s)总路程(mm)平均速度(mm/s)潜伏期(s)
      CI30.71±18.286721.56±4838.88198.36±78.7426.34±21.20
      DM+CI35.15±15.29*7855.55±4262.89*197.49±59.927.93±20.36
      DM+CI+EPCs29.49±13.46#7459.41±4829.74236.85±56.49#25.14±16.04
      DM+CI+EPCs+estrogen28.80±13.75##8477.04±5226.29269.68±94.16##22.41±14.16##
      *P<0.05,与CI组比较;#P<0.01,##P<0.01,与DM+CI组比较。
    • 免疫荧光结果显示,与CI组比较,DM+CI组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显降低(P<0.01);而DM+CI+EPCs组以及DM+CI+EPCs+ estrogen组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显增加(P<0.01),且DM+CI+EPCs+ estrogen新生血管数量高于CI组(P<0.05),见图3

      图  3  雌激素干预糖尿病EPCs移植改善缺血区血管新生功能

    • EPCs移植后第3天,取大鼠脑组织,切片后观察EPCs归巢情况。与CI组比较,DM+CI组大鼠脑组织缺血区域EPCs数量明显降低;而EPCs移植组大鼠脑组织梗死区域EPCs数量均明显增加,其中经过雌激素干预的EPCs移植组显示出梗死区域有更多数量的EPCs(图4)。

      图  4  PKH26染色观察脑缺血区域EPCs细胞归巢

    • 糖尿病是脑卒中的独立风险因素,且糖尿病脑缺血具有高致死及致残率的特点。但受到目前治疗条件的限制,急需新的治疗手段。内皮祖细胞(EPCs)为一种来源于骨髓并能分化为内皮细胞的前体细胞。在适当条件下(如缺血、缺氧)能从骨髓动员、迁移并归巢到受损部位,分化为内皮细胞,参与受损血管内皮的再内皮化及受损部位的血管新生[11]。研究表明,通过外源性的补充内皮祖细胞,外源的内皮祖细胞可以归巢于损伤部位,促进受损部位的血管新生及组织的修复[12]。Wang[13]等通过制造小鼠颈动脉球囊损伤模型并采用EPCs移植治疗,结果显示EPCs移植后附着在受伤的动脉内膜上能促进受伤部位的再内皮化和抑制新内膜增生。Huang[14]等的研究显示,EPCs移植通过增加循环中的EPCs数量和脑微血管密度可以恢复全脑放疗对血脑屏障和脑部毛细血管造成的损害。Garbuzova-Davis[8]等将人骨髓内皮祖细胞(hBMEPCs)系统移植至G93A小鼠,改善肌受损的萎缩性脊髓炎的血脊髓屏障的同时明显改善疾病结局。此外, EPCs移植治疗可有效改善心肌梗死、冠心病、糖尿病肾病及脑缺血等缺血性疾病[2, 15-17]。因此,鉴于EPCs移植在心脑血管疾病中的良好治疗作用,EPC移植有可能成为治疗糖尿病脑血管并发症的重要措施。然而高龄及疾病可导致自身内皮祖细胞数量减少及功能降低[3],单纯EPCs移植治疗的效果将大打折扣。若通过药物改善糖尿病EPCs功能,将使EPCs移植治疗达到事半功倍的效果。

      雌激素在激发女性第二性征的出现及维持中发挥不可替代的作用,并参与机体脂肪、水盐及肌肉蛋白质的合成与代谢。雌激素对心脑血管具有保护作用,可能与其增强EPCs的功能相关[18-19]。本课题组前期研究结果显示雌激素体外孵育能改善糖尿病大鼠的EPCs的功能。Ying等研究表明雌激素通过改善糖尿病小鼠的EPCs功能进而促进其伤口处血管新生和伤口愈合[20]。但雌激素干预后的EPCs移植治疗糖尿病脑卒中的研究较少。

      本研究采用EPCs对糖尿病脑卒中大鼠进行移植治疗,并采用TTC染色法对各组大鼠的脑组织染色以比较不同EPCs移植后大鼠脑梗死体积的变化。结果显示,糖尿病大鼠脑缺血梗死体积较正常大鼠相比明显增加,EPCs移植能明显减小脑梗死体积。与单独移植EPCs相比,雌激素干预的EPCs移植能进一步降低大鼠的脑梗死体积。同时水迷宫实验结果显示,雌激素干预EPCs移植明显提高脑卒中大鼠平均游泳速度、游泳总时间和明显缩短潜伏期,说明雌激素干预的EPCs移植对糖尿病脑卒中大鼠的脑缺血损伤有治疗作用。

      研究表明EPCs通过促进缺血部位的血管新生在改善缺血性疾病预后中发挥重要作用[21-23]。为探讨EPCs移植治疗降低脑缺血体积是否与促进缺血部位血管新生相关,本实验采用免疫荧光法观察脑缺血部位的血管新生情况。结果发现与对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显降低,而EPCs移植组以及雌激素干预的EPCs移植组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显增加,且雌激素干预的EPCs移植组新生血管数量最多并高于对照组,说明雌激素干预的EPCs移植通过促进缺血部位血管新生改善糖尿病脑卒中大鼠的脑缺血损伤。

      研究发现移植的EPCs可以归巢于损伤部位促进血管新生[24-25]。为了解移植的EPCs是否归巢于脑缺血部位,我们利用荧光染料PKH26标记EPCs并将标记的EPCs移植入脑卒中大鼠体内,快速冰冻切片后置于荧光显微镜下观察。结果显示,糖尿病组大鼠脑组织缺血区域EPCs归巢数量较少;而EPCs移植组大鼠脑组织梗死区域EPCs归巢数量明显增加,且经雌激素干预的EPCs移植组显示出梗死区域有最多数量的EPCs归巢,说明雌激素能促进EPCs的归巢。

      综上所述,雌激素体外孵育的糖尿病EPCs移植对糖尿病大鼠缺血性脑卒中有治疗作用,作用机制可能与雌激素促进EPCs归巢于缺血部位并促进缺血部位血管新生相关。该研究结果为糖尿病缺血性脑卒中提供了潜在的治疗手段。

参考文献 (25)

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