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糖尿病脑血管并发症是其致死致残的常见原因。鉴于内皮祖细胞(EPCs)在血管形成中的重要作用，近年来在心脑血管方面的研究越来越受到重视。多项研究证实EPCs移植治疗对脑缺血性疾病有改善作用[1-2]。然而糖尿病可影响EPCs功能[3]，单纯EPCs移植治疗的效果并不理想。前期研究证实雌激素体外孵育可改善糖尿病大鼠的EPCs的功能。因此，本研究通过分离培养糖尿病大鼠EPCs，经雌激素孵育后对糖尿病缺血性脑卒中大鼠进行移植治疗并评价治疗的效果，为临床治疗糖尿病脑血管并发症提供新的思路。
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雄性Wistar大鼠，体重(180±10)g（上海斯莱克实验动物有限公司）。动物房保持室温在22 ℃左右，相对湿度70%左右。所有实验动物均符合实验动物伦理学要求。
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雌激素 (Abcam公司)；链脲佐菌素(Sigma aldrich公司)； EGM-2 培养基(LON-ZA 公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC, Sigma Aldrich)；水合氯醛、甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司)。
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Wistar雄性大鼠，10～12周，适应性地喂养1周后，连续7 d空腹腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）55 mg/（kg·d），对照组大鼠腹腔注射等体积枸橼酸钠缓冲液。7 d后测空腹血糖(禁食12 h)，将血糖值为(13.5～25) mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠进行实验。
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分离收集大鼠骨髓，采用密度梯度离心法获取骨髓单核细胞。将单核细胞重悬于培养基EGM-2并调整细胞浓度至1×106个/ml并接种于预先包被好纤维连接蛋白的细胞培养皿，置于细胞培养箱37 ℃和5%CO2条件下培养。培养3 d后洗去未贴壁细胞，继续培养至7 d。PBS洗去未贴壁细胞，贴壁细胞供实验用。
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将消化下来的细胞悬液置于无菌离心管中，加入M199培养基离心后弃掉上清液。加入1 ml稀释液C重悬细胞。PKH26染料用稀释液C稀释。将细胞悬液加入到PKH26稀释液中，立即用吸管混匀样本，在25 ℃孵育2～5 min，并定时轻轻的颠倒离心管保证充分混匀。加入等量血清孵育1 min终止染色反应。细胞清洗3次后用PBS重悬备用。
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1.5%异氟烷在氮气/氧气（70/30）吸入式麻醉后，大鼠手术期间置于保温垫上维持体温在（37±0.5） ℃，在体视显微镜下分离出左侧颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈外及颈总动脉，从一侧颈总动脉插入线栓经颈内动脉至大脑中动脉并阻断其血流，手术期间应用激光散斑仪实时监测小鼠大脑皮层血流量的变化情况。
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实验分3组：①对照组和②糖尿病组：M199培养基；③雌激素组：含雌激素10 nmol/L的M199培养基。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h 后进行实验。
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实验动物分4组：①正常雄性Wistar大鼠脑缺血组（CI）；②糖尿病大鼠脑缺血组（DM+CI）；③接受糖尿病大鼠EPCs移植治疗的糖尿病大鼠组（DM+CI+EPCs）；④接受经雌激素体外干预糖尿病EPCs移植治疗的糖尿病大鼠（DM+CI+EPCs+estrogen）。所有大鼠行脑缺血术后24 h，③和④组大鼠经尾静脉注入相应的经PKH26标记的EPCs悬液（1×106个细胞，悬于PBS中），①和②组经尾静脉注入等体积PBS。术后3 d进行实验。
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移植后3 d，大鼠麻醉处死取脑，将各组大鼠脑组织切为厚约3 mm的切片并浸入1% TTC中，37 ℃染色30 min。正常脑组织TTC染色为鲜红色，而缺血区脑组织为白色，拍照并计算脑缺血体积。
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移植后3 d，取各组大鼠脑组织做冰冻切片，160倍荧光显微镜下观察并获取图像，计数PKH26标记的细胞数并统计分析。同时进行VEGFR2免疫组化，每张切片取5个不同视野在160倍荧光显微镜下观察计数新生小管数。
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与CI组比较，DM+CI组脑梗死体积明显增加(P<0.01)；经EPCs移植治疗后糖尿病大鼠的脑缺血体积明显减小且经雌激素体外干预后的EPCs移植能进一步减少脑缺血梗死体积，说明雌激素干预可能加强了EPCs对脑卒中大鼠脑部缺血损伤的治疗作用(P<0.05, P<0.01,与 DM+CI组比较; P<0.05, 与 CI组比较)，见图1。
图 1 雌激素干预糖尿病EPCs移植降低大鼠脑缺血体积
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水迷宫实验结果显示， DM+CI组大鼠游泳路程和总时间相较于CI组明显增加(P<0.05)，平均速度和潜伏时间则无明显变化（P>0.05）；与DM+CI组比较，DM+CI+EPCs组以及DM+CI+EPCs+ estrogen组游泳总时间明显缩短(P<0.05)，平均速度均明显提高(P<0.05)，游泳总路程则无明显变化（P>0.05）；但只有DM+CI+EPCs+ estrogen组潜伏期明显降低(P<0.01)，见图2和表1。
图 2 各组大鼠水迷宫游泳轨迹图
表 1 不同处理组大鼠Morris迷宫实验指标对比（
$\bar x $ +s）组别(n=8) 总时间(s) 总路程(mm) 平均速度(mm/s) 潜伏期(s) CI 30.71±18.28 6721.56±4838.88 198.36±78.74 26.34±21.20 DM+CI 35.15±15.29* 7855.55±4262.89* 197.49±59.9 27.93±20.36 DM+CI+EPCs 29.49±13.46# 7459.41±4829.74 236.85±56.49# 25.14±16.04 DM+CI+EPCs+estrogen 28.80±13.75## 8477.04±5226.29 269.68±94.16## 22.41±14.16## *P<0.05，与CI组比较；#P<0.01,##P<0.01，与DM+CI组比较。 -
免疫荧光结果显示，与CI组比较，DM+CI组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显降低(P<0.01)；而DM+CI+EPCs组以及DM+CI+EPCs+ estrogen组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显增加(P<0.01)，且DM+CI+EPCs+ estrogen新生血管数量高于CI组（P<0.05），见图3。
图 3 雌激素干预糖尿病EPCs移植改善缺血区血管新生功能
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EPCs移植后第3天，取大鼠脑组织，切片后观察EPCs归巢情况。与CI组比较，DM+CI组大鼠脑组织缺血区域EPCs数量明显降低；而EPCs移植组大鼠脑组织梗死区域EPCs数量均明显增加，其中经过雌激素干预的EPCs移植组显示出梗死区域有更多数量的EPCs（图4）。
图 4 PKH26染色观察脑缺血区域EPCs细胞归巢
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糖尿病是脑卒中的独立风险因素，且糖尿病脑缺血具有高致死及致残率的特点。但受到目前治疗条件的限制，急需新的治疗手段。内皮祖细胞(EPCs)为一种来源于骨髓并能分化为内皮细胞的前体细胞。在适当条件下（如缺血、缺氧）能从骨髓动员、迁移并归巢到受损部位，分化为内皮细胞，参与受损血管内皮的再内皮化及受损部位的血管新生[11]。研究表明，通过外源性的补充内皮祖细胞，外源的内皮祖细胞可以归巢于损伤部位，促进受损部位的血管新生及组织的修复[12]。Wang[13]等通过制造小鼠颈动脉球囊损伤模型并采用EPCs移植治疗，结果显示EPCs移植后附着在受伤的动脉内膜上能促进受伤部位的再内皮化和抑制新内膜增生。Huang[14]等的研究显示，EPCs移植通过增加循环中的EPCs数量和脑微血管密度可以恢复全脑放疗对血脑屏障和脑部毛细血管造成的损害。Garbuzova-Davis[8]等将人骨髓内皮祖细胞（hBMEPCs）系统移植至G93A小鼠，改善肌受损的萎缩性脊髓炎的血脊髓屏障的同时明显改善疾病结局。此外， EPCs移植治疗可有效改善心肌梗死、冠心病、糖尿病肾病及脑缺血等缺血性疾病[2, 15-17]。因此，鉴于EPCs移植在心脑血管疾病中的良好治疗作用，EPC移植有可能成为治疗糖尿病脑血管并发症的重要措施。然而高龄及疾病可导致自身内皮祖细胞数量减少及功能降低[3]，单纯EPCs移植治疗的效果将大打折扣。若通过药物改善糖尿病EPCs功能，将使EPCs移植治疗达到事半功倍的效果。
雌激素在激发女性第二性征的出现及维持中发挥不可替代的作用，并参与机体脂肪、水盐及肌肉蛋白质的合成与代谢。雌激素对心脑血管具有保护作用，可能与其增强EPCs的功能相关[18-19]。本课题组前期研究结果显示雌激素体外孵育能改善糖尿病大鼠的EPCs的功能。Ying等研究表明雌激素通过改善糖尿病小鼠的EPCs功能进而促进其伤口处血管新生和伤口愈合[20]。但雌激素干预后的EPCs移植治疗糖尿病脑卒中的研究较少。
本研究采用EPCs对糖尿病脑卒中大鼠进行移植治疗，并采用TTC染色法对各组大鼠的脑组织染色以比较不同EPCs移植后大鼠脑梗死体积的变化。结果显示，糖尿病大鼠脑缺血梗死体积较正常大鼠相比明显增加，EPCs移植能明显减小脑梗死体积。与单独移植EPCs相比，雌激素干预的EPCs移植能进一步降低大鼠的脑梗死体积。同时水迷宫实验结果显示，雌激素干预EPCs移植明显提高脑卒中大鼠平均游泳速度、游泳总时间和明显缩短潜伏期，说明雌激素干预的EPCs移植对糖尿病脑卒中大鼠的脑缺血损伤有治疗作用。
研究表明EPCs通过促进缺血部位的血管新生在改善缺血性疾病预后中发挥重要作用[21-23]。为探讨EPCs移植治疗降低脑缺血体积是否与促进缺血部位血管新生相关，本实验采用免疫荧光法观察脑缺血部位的血管新生情况。结果发现与对照组大鼠相比，糖尿病组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显降低，而EPCs移植组以及雌激素干预的EPCs移植组大鼠脑梗死区域新生血管数量明显增加，且雌激素干预的EPCs移植组新生血管数量最多并高于对照组，说明雌激素干预的EPCs移植通过促进缺血部位血管新生改善糖尿病脑卒中大鼠的脑缺血损伤。
研究发现移植的EPCs可以归巢于损伤部位促进血管新生[24-25]。为了解移植的EPCs是否归巢于脑缺血部位，我们利用荧光染料PKH26标记EPCs并将标记的EPCs移植入脑卒中大鼠体内，快速冰冻切片后置于荧光显微镜下观察。结果显示，糖尿病组大鼠脑组织缺血区域EPCs归巢数量较少；而EPCs移植组大鼠脑组织梗死区域EPCs归巢数量明显增加，且经雌激素干预的EPCs移植组显示出梗死区域有最多数量的EPCs归巢，说明雌激素能促进EPCs的归巢。
综上所述，雌激素体外孵育的糖尿病EPCs移植对糖尿病大鼠缺血性脑卒中有治疗作用，作用机制可能与雌激素促进EPCs归巢于缺血部位并促进缺血部位血管新生相关。该研究结果为糖尿病缺血性脑卒中提供了潜在的治疗手段。
Therapeutic effects of estrogen-intervened EPCs transplantation on diabetic ischemic stroke rats
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摘要:
目的 探讨雌激素干预的EPCs移植对糖尿病缺血性脑卒中的治疗作用。 方法 制备大鼠糖尿病缺血性脑卒中模型，24 h后通过尾静脉移植经PKH26标记的糖尿病EPCs和雌激素干预的糖尿病EPCs。移植3 d后测定各组大鼠脑缺血体积、大鼠行为学变化、缺血部位血管新生及EPCs的归巢情况。 结果 与糖尿病脑缺血大鼠相比，雌激素干预的糖尿病EPCs移植能降低脑缺血体积、改善行为学评分和缺血部位的血管新生及促进EPCs归巢到损伤部位(P<0.05)。 结论 雌激素干预的糖尿病EPCs移植，通过促进EPCs归巢和血管新生对糖尿病缺血性脑卒中有较好的治疗作用。 Abstract:Objective To explore the therapeutic effects of estrogen-intervened endothelial progenitor cells( EPCs) transplantation on diabetic ischemic stroke rats. Methods PKH26-labeled diabetic EPCs and estrogen-intervened diabetic EPCs were injected into rats via the tail vein 24 h after cerebral ischemia. Cerebral ischemic volume, behavioral changes, ischemic site vascularization and homing of EPCs were measured 3 d after EPCs injection. Results Compared with diabetic ischemic rats, estrogen-intervened EPCs transplantation had reduced infarct volumes, improved behavioral scores and ischemic site revascularization and promoted homing of EPCs to sites of injury(P<0.05). Conclusion Estrogen-intervened EPCs transplantation had a better therapeutic effect on diabetic ischemic stroke by promoting EPCs homing to injury site and EPCs-medicated neovascularization . -
Key words:
- estrogen /
- EPCs transplantation /
- diabetic ischemic stroke /
- neovascularization /
- homing
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聚合物囊泡(PSs) 是由两亲嵌段共聚物自组装形成的囊泡状“壳-核”结构微纳米载体，其结构类似脂质体(liposomes)[1]，常用的聚合物材料包括聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）、聚己内酯（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚体（PLGA）等，作为生物膜模型、药物控释和基因转染的载体而被广泛研究。脂质体制备过程中，其稳定性受磷脂酰胆碱和胆固醇的比例、温度和pH等因素的影响，一定范围内磷脂酰胆碱含量高，高温和酸性环境都会破坏脂质体的稳定性。聚合物囊泡具有更加稳定和可控的结构特点，熵值较小，比脂质和表面活性剂更稳定，在化学修饰、生物分子偶联和物理结构等方面具有更好的稳定性和灵活性[2, 3]，对（113.7±18.5）nm水的渗透性较低，可抵抗更大的压力[4]。聚合物囊泡既可以携带水溶性药物 (如氨基酸、多肽、蛋白类药物)，将药物包封在内水相内，也可以携带脂溶性药物，将药物增溶在膜层中。根据聚合物的链长和分子量差异得到不同膜层厚度的聚合物囊泡，可提高疏水性药物在囊泡中的包封率[5]。聚合物囊泡的特殊结构和性质决定其可用于生物膜模拟、药物释放、催化、提供反应的微环境等，因此，在分子封装和控释领域有很大的潜在应用价值。作为药物载体，具有改变药物在体内的分布、防止药物降解失活、延长作用时间以及降低毒副作用等特点[6, 7]。
聚合物囊泡的膜稳定性好，但用于药物包载时可能影响药物的释放速率，达到药物作用有效浓度时间长，影响治疗效果[8]。不同嵌段聚合物制备的聚合物囊泡具有不同的膜厚度以及渗透特性。H+分子小、极性强、对囊泡膜的渗透性弱，Wu等[6, 9]的研究将H+的透膜性能作为考察囊泡膜壁的指标，通过考察H+的跨膜特性评估囊泡膜的渗透性，进一步模拟研究囊泡内外可否形成H+跨膜梯度，为囊泡的主动载药提供依据，同时发现1,4-二氧六环可对膜渗透特性进行调节，有利于药物包载。8-羟基-1,3,6-三磺酸芘钠盐（HPTS）是一种pH响应性的荧光探针，特定波长下的荧光强度随着溶液的pH值发生变化，可用于监测溶液的酸碱性。因此，本文采用H+跨膜转运考察聚合物囊泡的渗透性，对几种不同聚合物材料制备的囊泡和脂质体进行比较 ，以 pH敏感荧光探针HPTS对载药相关的透膜性能以及1,4-二氧六环对聚合物囊泡膜的透过性影响进行了考察[9]，并与脂质体进行对比。
1. 材料和方法
1.1 实验仪器和材料
紫外分光光度仪（UV-2401PC，Shimadzu，日本），粒度/Zeta电位测量仪， （NICOMPTM 380 ZLS，NICOMP，美国），荧光分光光度仪（LS55 Luminescence spectroscopy，Perkin Elmer，英国），旋转蒸发仪（R-200，Buchi，德国），Satoris Mettler AE200天平（Satoris，德国），PHS-3TC pH计（上海天达仪器，中国），葡聚糖凝胶（Sepharose CL-4B, Pharmacia，瑞典），8-羟基-1,3,6-三磺酸芘钠盐(8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt，HPTS，Acros，美国），大豆卵磷脂（上海爱康精细化工有限公司，中国），胆固醇（上海如吉生物科技发展有限公司，中国），MPEG-PLGA（实验室自合成），PBD-b-PEO（聚氧乙烯-聚丁二烯，Polymer Source, 加拿大）， PS-b-PEO （聚氧乙烯-聚苯乙烯，复旦大学高分子科学系黄骏廉教授惠赠），1,4-二氧六环（1,4-dioxane，AR，上海诺泰化工有限公司），其余试剂均为分析纯（中国医药集团上海化学试剂公司，中国）。
1.2 聚合物囊泡及脂质体的制备
以开环聚合法合成PEG-PLGA，将20 mg PEG-PLGA溶于2 ml丙酮，缓慢注入PBS缓冲液（0.01 mol/L）中自组装制备聚合物囊泡（PSs-PLGA），超滤浓缩备用。薄膜分散法制备脂质体及两种聚合物囊泡（PBD-b-PEO、PS-b-PEO），将15 mg大豆磷脂与5 mg胆固醇混合溶于10 ml二氯甲烷中，20 mg PBD-b-PEO、20 mg PS-b-PEO分别溶于10 ml二氯甲烷中，3种载体材料分别采用旋转挥发法成膜，减压干燥24 h后用PBS缓冲液（0.01 mol/L）水化，冰浴探头超声得到脂质体、PSs-PBD和PSs-PS，超滤浓缩备用[10]。
1.3 聚合物囊泡的稳定性
取适量已制备的脂质体和3种聚合物囊泡，在4 ℃恒温箱内静置，测量并记录时间t为0、2、4、8、15、20、30 d时的粒径，观察溶液分层和沉淀情况。同上，另取一组上述溶液，在40 ℃恒温箱内静置，重复上述实验。
1.4 聚合物囊泡的膜渗透性
在聚合物囊泡对药物的包载释放中，囊泡膜壁的组成成分和渗透性起着重要作用。研究者将H+的透膜性能作为考察囊泡膜壁的指标，研究H+的跨膜转运可用于囊泡膜的渗透性研究。本文采用H+跨膜渗透考察囊泡的膜渗透性，对几种不同聚合物材料制备的囊泡和脂质体做出对比。
1.4.1 HPTS作为pH敏感荧光探针
HPTS是pH响应性的荧光探针，荧光强度随着溶液pH值变化而发生变化，用于监测溶液的酸碱性。HPTS的激发波长（λex）分别是403 nm和454 nm，发射波长（λem）是 509 nm，激发波长的强度之比（I454/I403）与HPTS溶液体系的pH相关，而发射波长与HPTS溶液体系的pH无关。根据这些性质，HPTS作为pH敏感的荧光探针可用于测定聚合物囊泡外水相的pH值变化[6]。
配制一系列不同pH值梯度的缓冲溶液，分别加入适量HPTS（浓度为2.5 µmol/L），检测并记录激发光波长在403 nm和454 nm的荧光强度I403和I454，分别将I403/I454和I454/I403与pH值按Boltzmann函数进行曲线拟合，得到I403/I454和I454/I403与pH值的相关关系。
1.4.2 聚合物囊泡外水相的pH测定
制备聚合物囊泡和脂质体，方法同“1.2”项。用0.2 mol/L的柠檬酸缓冲溶液（pH值 4.0）代替pH值7.4的PBS溶液（0.01 mol/L）。将聚合物囊泡或脂质体过Sepharose CL-4B柱，生理盐水洗脱。将上述聚合物囊泡或脂质体混悬液中加入适量HPTS（浓度为2.5 µmol/L），检测并记录激发光波长在403 nm和454 nm的荧光强度I403和I454。根据I454/I403与pH值的相关性计算囊泡外水相的pH值与H+浓度。
1.4.3 H+跨膜速率的计算
根据Fick’s第一定律，H+从单个聚合物囊泡扩散到外水相的速率为：
$$ \frac{{dM}}{{dt}} = \frac{{ADK\Delta C}}{L} $$ (1) 式中，M为H+由聚合物囊泡传播至外水相的量，A为聚合物囊泡的表面积，K为H+在聚已内酯（囊泡的膜层）与水中的分配系数，D为H+的传播系数，L为聚合物囊泡的膜厚，△C为囊泡的内水相H+浓度（Cin）和外水相H+浓度(Cout)之差。因此，囊泡外水相中H+浓度为：
$$ \frac{{d{C_{out}}}}{{dt}} = \frac{{N{V_{in}}ADK}}{{{V_{out}}L}}[{C_{in}} - {C_{out}}] $$ (2) 式中，Vin为囊泡内腔体积，Vout为外水相体积。单个囊泡内腔体积Vin根据公式
$ {V_{in}} = 4/3 \text{π} {(D/2 - L)^3} $ 计算，其中，D为囊泡的粒径的平均数。由于K值未知，所以可用表观扩散系数D*代替DK。而由于Cin为定值0.1 mmol/L，因此方程（2）可转化为：$$ \ln ({C_i}_n - {C_{out}}) = \frac{{N{V_{in}}AD*}}{{{V_{out}}L}}t $$ (3) 参考文献[9]进行推导，同时囊泡外水相中H+浓度与时间可按方程
$ {C_{out}} + {C_{in}} = A\sqrt {t + B} $ 拟合，其中：$$ A = {C_{in}}\sqrt {\frac{{2N{V_{in}}AD*}}{{{V_{out}}L}}} \text{，} B = \frac{{\left( {2\ln {C_{in}} + 1} \right){V_{out}}L}}{{2N{V_{in}}AD*}} $$ 由于实验中t（s）>>B，表明聚合物囊泡外水相中H+浓度（pH值）与t1/2成正比，因此方程（3）最终可转化为：
$$ \frac{{d{C_{out}}}}{{d{t^{1/2}}}} \approx {C_i}_n\sqrt {\frac{{N{V_{in}}AD*}}{{{V_{out}}L}}} $$ (4) 将聚合物囊泡外水相中H+浓度（pH值）和时间按方程（4）拟合后，可求算H+在聚合物囊泡跨膜转运过程中的表观扩散系数D*。
2. 实验结果
2.1 聚合物囊泡及脂质体的制备
嵌段共聚物在溶液中自组装形成聚合物囊泡的行为与共聚物疏水链段与亲水链段的比例有关，当亲水端比例为20%～40％时为囊泡的形成区域。PEG与PLGA以25∶75（w/w）的比例合成PEG-PLGA，以溶剂注入法在溶液中自组装制备PSs-PLGA，囊泡呈明显的圆形囊壁状结构，外壁厚度d约为10 nm，粒径为（113.7±18.5）nm [10, 11]。以薄膜挥发法制备了PSs-PBD和PSs-PS及脂质体，粒径分别为（139.2±13.1）、（128.0±12.54）、（132.1 ±10.5）nm。
2.2 聚合物囊泡的稳定性
粒径稳定性试验结果见图1，与脂质体相比，3种聚合物囊泡在4 ℃放置的粒径变化均更小，不易出现沉淀和分层，而且随着放置时间的延长，这种趋势仍保持，说明聚合物囊泡相较脂质体更稳定。随着时间延长，在40 ℃条件下，脂质体出现结构的破坏无法测定粒径，PSs-PLGA也逐渐显示结构的破坏，而PSs-PBD和PSs-PS的粒径相对保持较好，聚合物囊泡的结构稳定性优于脂质体。
2.3 聚合物囊泡的膜渗透性
2.3.1 HPTS作为pH值敏感的荧光探针
图2为HPTS在不同pH值的缓冲液中的荧光激发光谱图。如图2所示，HPTS的荧光激发光光谱有明显的pH值依赖性。pH 值10.0时，HPTS在454 nm的荧光强度最高，而在403 nm荧光强度最低，表明HPTS的大部分-OH离子化。随着pH的降低，HPTS的-O-质子化逐渐增多，HPTS在454 nm的荧光强度逐渐降低，而在403 nm的荧光强度逐渐升高。当pH 值< 6.0，454 nm峰基本消失，而403 nm峰强度随着pH值的降低继续逐渐升高。
将I454/I403或I403/I454对pH值作图，如图3所示，I454/I403随pH值升高而增加。将I454/I403或I403/I454对pH值按Boltzmann函数回归，即可得到I454/I403或I403/I454与pH值的相关关系。在特定pH范围内，可通过I403/I454与pH值的关系来测定聚合物囊泡外水相pH值。
I454/I403与pH值：
$ y = \displaystyle\frac{{5.236 + (0.032 - 1.548)}}{{1 + \exp \left[ {(x - 6.565)/0.473} \right]}} $ ，R=0.997I403/I454与pH值：
$ y = \displaystyle \frac{{0.08107 + (406.852 - 0.147)}}{{1 + \exp \left[ {(x - 4.265)/0.323} \right]}} $ ，R=0.9952.3.2 聚合物囊泡外水相的pH测定和H+跨膜速率的计算
聚合物囊泡或脂质体外水相pH值测定结果见表1。将囊泡外水相中H+浓度[H+]（Y）对t1/2(X)作图（图4），结果表明囊泡外水相中H+浓度与t1/2呈线性相关。
表 1 聚合物囊泡和脂质体外水相中的氢离子浓度和pH值(n=3)时间
（t/h）Liposomes PSs-PLGA PSs-PBD PSs-PS pH值 [H+]×
10−8 mol/LpH值 [H+]×
10−8 mol/LpH值 [H+]×
10−8 mol/LpH值 [H+]×
10−8 mol/L0 9.27±0.08 0.054±0.002 9.52±0.06 0.030±0.001 9.46±0.02 0.035±0.001 9.52±0.03 0.030±0.001 1 9.14±0.08 0.072±0.001 9.52±0.02 0.030±0.003 9.44±0.05 0.036±0.002 9.52±0.07 0.030±0.001 2 8.52±0.11 0.302±0.015 9.39±0.06 0.041±0.002 9.40±0.06 0.040±0.004 9.52±0.03 0.030±0.001 4 8.23±0.07 0.589±0.005 9.34±0.14 0.046±0.003 9.31±0.15 0.049±0.001 9.52±0.05 0.030±0.002 8 7.90±0.07 1.259±0.004 9.17±0.08 0.068±0.002 9.15±0.13 0.071±0.006 9.52±0.04 0.030±0.003 24 7.56±0.04 2.754±0.011 9.01±0.08 0.098±0.003 8.83±0.22 0.148±0.007 9.52±0.05 0.031±0.003 36 7.46±0.09 3.467±0.013 8.86±0.12 0.138±0.003 8.79±0.16 0.162±0.006 9.52±0.05 0.031±0.001 48 7.38±0.14 4.169±0.015 8.74±0.10 0.182±0.002 8.64±0.09 0.229±0.005 9.51±0.04 0.031±0.001 96 — — 8.62±0.08 0.240±0.001 8.49±0.05 0.324±0.007 9.50±0.07 0.032±0.002 注：“—”表示未检测。 脂质体：Y = 0.6464X－0.4423（R= 0.989）；PSs -PLGA：Y = 0.0288X + 0.0087 （R = 0.984）；PSs-PBD：Y = 0.0311X + 0.001（R = 0.983）；PSs-PS：Y = 0.0002X + 0.03（R = 0.958）
从回归方程的斜率可知，脂质体中H+的释放速度远远大于囊泡中H+的释放，而3种聚合物囊泡相比，PSs-PLGA的释放速率大于PSs-PS，与PSs-PBD没有显著差异，PSs-PS在测定时间内几乎没有H+透膜现象发生，这与材料的属性密切相关。将上述脂质体和PSs -PLGA两直线的斜率代入方程（10）：
$$ \frac{{d{C_{out}}}}{{d{t^{1/2}}}} \approx {C_i}_n\sqrt {\frac{{N{V_{in}}AD*}}{{{V_{out}}L}}} $$ 求得H+的表观扩散系数。其中Cin = 0.1 mmol/L，Vout =2 ml，计算结果见表2。结果表明，H+在脂质体的表观扩散系数D*=8.39×10−4 cm2/s，是H+在PSs-PLGA的表观扩散系数D*=3.51×10−8 cm2/s的2.39×104倍。囊泡膜壁对H+的渗透性远远低于脂质体。这一性质将既有利于囊泡内被包封药物的保存，又表明囊泡内外可以建立H+跨膜梯度，为囊泡的主动载药提供依据。
表 2 脂质体和聚合物囊泡的膜表观扩散系数（D*）名称
粒径
(l/nm)Vin
(v/ml)A ×10−10
(s/cm2)N L
(l/nm)D*
(cm2/s)Liposomes 132.1 10.49×10−16 5.39 5.5×1015 3 8.39×10−4 PSs-PLGA 113.7 4.31×10−16 4.06 2.7×1015 10 3.51×10−8 PSs-PBD 139.2 8.01×10−16 6.08 1.6×1015 10 2.48×10−8 PSs-PS 128.0 2.48×10−16 5.14 1.02×1015 25 1.53×10−12 2.3.3 1,4-二氧六环对聚合物囊泡渗透性的调节作用
聚合物囊泡的膜壁较厚，而且分子间排列结构紧密，所以对分子的渗透性低。考察1,4-二氧六环对PEG-PLGA以及PBD-b-PEO，PS-b-PEO制备的囊泡的膜透过能力的影响。囊泡外水相加入1,4-二氧六环室温孵育，浓度分别是5％、15％、20％，按时间点测定H+浓度，测定结果见图5。随着囊泡外水相中1,4-二氧六环含量的增加，由5％～20％，囊泡膜层对H+的渗透能力加强。上述实验结果表明1,4-二氧六环对PEG-PLGA囊泡膜的渗透性具有很好的调节作用，其作用与囊泡外水相中的1,4-二氧六环含量成正相关（P<0.05）。1,4-二氧六环对聚合物囊泡的渗透能力有显著提高。
3. 小结与讨论
本研究采用溶液中自组装法制备PSs-PLGA，并与不同材料制备的聚合物囊泡以及脂质体进行稳定性及膜渗透特性的考察。HPTS是pH响应性的荧光探针，荧光强度随着溶液的pH值变化而发生变化，利用HPTS对pH的响应性，设计H+渗透实验评价聚合物囊泡的膜渗透性性能。结果表明，PSs-PLGA的膜渗透性较脂质体低，而比PBD-b-PEO和PS-b-PEO制备的囊泡膜渗透性高，适度的渗透性有利于囊泡中药物释放和装载。同时1,4-二氧六环可以作为PSs-PLGA的膜层增塑剂，调节膜的渗透性能，改善PSs-PLGA的载药和释药能力。FDA批准PLGA作为药用高分子材料，因其具有良好的生物降解和与分子量相关的缓释药物作用。作为一种与脂质体结构类似的纳米载体，与聚合物纳米粒不同，聚合物囊泡由于是中空壳核结构，因此其药物释放更快且载体的降解周期更短。兼具稳定性的优点，结合靶向配体的修饰以及聚合物材料合成策略，PLGA为基础的聚合物囊泡在药物靶向递送中具有广泛的研究价值[12]。
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图 1 雌激素干预糖尿病EPCs移植降低大鼠脑缺血体积
A.各组大鼠脑切片TTC染色；B.各组大鼠脑缺血体积组间比较。*P<0.05，**P<0.01,与CI组比较；#P<0.05， ##P<0.01,与DM+CI组比较。
图 3 雌激素干预糖尿病EPCs移植改善缺血区血管新生功能
A.缺血部位的VEGFR2免疫荧光染色；B.新生血管计数分析。每个样本随机选取5个视野计算新生血管数量，并计算平均值。*P<0.05，**P<0.01，与 CI组比较；##P＜0.01，与 DM+CI组比较。
表 1 不同处理组大鼠Morris迷宫实验指标对比（
$\bar x $ +s）组别(n=8) 总时间(s) 总路程(mm) 平均速度(mm/s) 潜伏期(s) CI 30.71±18.28 6721.56±4838.88 198.36±78.74 26.34±21.20 DM+CI 35.15±15.29* 7855.55±4262.89* 197.49±59.9 27.93±20.36 DM+CI+EPCs 29.49±13.46# 7459.41±4829.74 236.85±56.49# 25.14±16.04 DM+CI+EPCs+estrogen 28.80±13.75## 8477.04±5226.29 269.68±94.16## 22.41±14.16## *P<0.05，与CI组比较；#P<0.01,##P<0.01，与DM+CI组比较。 
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