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血管内皮细胞是沿血管腔表面排列的单层内皮细胞,将血管腔与血管平滑肌及组织分隔开,在维持血管稳态中具有重要的作用。心血管系统中复杂应激环境引起的内皮细胞整合应激反应(ISR)、炎症反应所造成的内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的病因[1-2]。与肌组织细胞线粒体相比,内皮细胞线粒体的首要功能是参与信号转导维持细胞功能的完整,其次是进行能量代谢[3-4]。线粒体氧化应激是内皮细胞线粒体损伤的重要原因,而内皮细胞线粒体损伤引起细胞内信号转导异常和代谢紊乱,导致细胞的严重损伤[5]。本文重点阐述动脉粥样硬化病理进程中线粒体氧化应激引起内皮细胞损伤的作用及其机制。
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内皮细胞有提供血液与组织间屏障和调节血管张力、血流动力学、炎症反应的功能,同时具有合成并释放血管调节因子的内分泌功能,参与维持血管结构和功能的完整及血管内环境的稳态[6]。血压的变化、血液剪切应力的变化、炎症反应和脂质累积等理化因素持续刺激内皮细胞时,血管内皮依赖性血管舒张反应受损、血管内皮完整性和通透性变化等损伤导致的内皮细胞功能障碍,是动脉粥样硬化病变的重要原因[7]。内皮细胞产生的活性氧(ROS)导致的内皮细胞损伤和功能障碍,在动脉粥样硬化的整体病理进程中起重要作用。ROS激活的ISR引起促炎细胞因子表达和炎症小体激活,促进白细胞(尤其是单核细胞)粘附并迁移到血管壁中,导致的炎症反应及内皮细胞的凋亡和脱落,是动脉粥样硬化早期病程进展的关键[2,8];ROS引起的内皮细胞通透性改变和屏障功能障碍,导致血液中活性物质侵入内皮细胞和血管平滑肌细胞中,刺激血管平滑肌细胞迁移、胶原沉积和纤维增生,这一过程是血管厚度增加和动脉粥样硬化斑块形成的原因;内皮细胞通透性改变导致的细胞中Ca2+释放,刺激血管平滑肌细胞钙化,加速动脉粥样硬化斑块形成[9]。此外,内皮细胞间紧密连接的损伤引起的动脉粥样硬化斑块破裂,导致血栓的形成、血管堵塞,在整体血管水平上表现为管腔直径、管壁厚度的改变[10]。
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氧化应激是细胞内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态。线粒体电子传递链的复合体I(NADH-CoQ还原酶)、复合体III(细胞色素c还原酶)泄漏未正确传递的电子至线粒体基质,而电子与O2反应产生超氧阴离子是线粒体ROS(mtROS)产生的主要原因[11]。超氧化物歧化酶(SOD)1型、2型和过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)构成抗氧化酶系统,抗氧化酶系统清除ROS的过程是细胞内的主要抗氧化途径。mtROS产生与清除的动态平衡是细胞维持线粒体稳态的重要机制,这种动态平衡被打破导致的线粒体损伤称为线粒体氧化应激[12]。
生理状态下,内皮细胞的线粒体电子传递链将大部分电子传递至氧化磷酸化产生ATP,这一过程中,仅产生少量的mtROS作为信号分子调节细胞的功能[13]。但动脉粥样硬化相关病理因素通过诱导内皮细胞mtROS的大量产生,导致线粒体氧化应激(图1)。异常的血流剪切力上调血脂代谢相关前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的表达,抑制呼吸链复合体III的亚基泛醇-细胞色素c还原酶核心蛋白1(UQCRC1)的表达,导致线粒体呼吸产生的电子不能正常传递,大量泄漏至线粒基质,诱导大量mtROS的产生[14]。胞外蛋白因子通过激活内皮细胞膜上的骨形态发生蛋白4(BMP4)和Toll样受体4(TLR4)增加mtROS的产生[15]。动脉粥样硬化的重要病因之一是脂质代谢异常,而大量脂质聚集在内皮细胞时,线粒体内膜中铁转运蛋白2(Mfrn2)的表达增加,Mfrn2将胞质中Fe2+转运至线粒体参与Fenton反应,增加mtROS的产生[16];同时,脂质中的低密度脂蛋白(LDL)被mtROS氧化修饰形成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)并进一步累积在内皮细胞导致大量mtROS的产生,形成的恶性循环导致线粒体氧化应激[17]。
内皮细胞内的一些分子信号通路,通过直接减少mtROS的产生或者上调抗氧化酶活性间接减少mtROS,防止线粒体氧化应激,维持细胞稳态(如图1)。研究发现,甲硫氨酸被氧化时,甲硫氨酸亚砜还原酶A(MsrA)的激活,通过增加核因子E2相关因子2(Nrf2)的磷酸化,抑制Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)的表达,上调CAT、SOD2的活性[18]。而大量脂质聚集在内皮细胞时,内皮细胞部分稳态调控机制激活,其中环状RNA(circRNA)通过调节microRNA(miRNA)与mRNA相应位点的结合,实现对氧化和抗氧化相关蛋白质的调控,达到抑制mtROS产生的作用,是新的研究热点。内皮细胞的circNOL12通过竞争性抑制miR-6873-3p,上调成纤维生长因子受体底物2(FRS2)的表达,抑制mtROS的产生[19];内皮细胞的circDIP2C通过竞争性抑制miR-556-5p,上调甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)的表达,抑制mtROS的产生[20];内皮细胞的circ0003204通过竞争性抑制miR-942-5p,下调诱导mtROS产生的组蛋白去乙酰化酶9(HDAC9)的表达[21];内皮细胞的circBPTF通过竞争性抑制miR-384,上调保守RNA结合蛋白LIN-28同源物B(Lin28B)的表达,抑制mtROS的产生[22]。由此可见,内皮细胞受病理因素刺激时,通过复杂的信号调节网络维持mtROS产生与清除的动态平衡,防止mtROS的过量产生,达到调控线粒体氧化应激的目的。
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研究表明,内皮细胞的线粒体氧化应激直接引起线粒体结构和功能的严重损伤,进而导致细胞的损伤甚至死亡;而线粒体氧化应激中释放到胞浆的ROS通过诱导能量代谢异常、线粒体自噬、炎症反应、细胞凋亡、一氧化氮减少和细胞间紧密连接的损伤,形成复杂的作用网络(图2),导致内皮细胞功能的损伤,同时增加内皮细胞的代谢需求,导致线粒体损伤的持续积累。
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线粒体中的生物大分子容易受到mtROS的氧化损伤。线粒体磷脂膜被mtROS氧化时,流动性降低及通透性增加,导致线粒体膜电位丧失,线粒体失去完整性,mtROS及其他内容物释放到胞质中[23];线粒体呼吸链中的蛋白质组分被ROS氧化时,导致氧化磷酸化减少,引起线粒体的功能障碍[24];ROS引起缺少组蛋白保护的线粒体DNA(mtDNA)链断裂和突变的增加,减少线粒体功能性蛋白质的表达及线粒体相关的分子信号的变化,导致线粒体功能障碍[25]。研究还发现,mtROS能上调调节线粒体相关内质网膜形成的锚定蛋白磷酸尿苷酸性簇分类蛋白2(PACS2)的表达,通过增加线粒体与内质网的接触引起内质网内Ca2+持续性向线粒体的转运,导致线粒体渗透性转换孔(mPTP)开放、线粒体膜电位的下降,线粒体失去结构完整性[26]。有研究发现,mtROS能上调参与线粒体分裂的动力相关蛋白-1(Drp-1)的表达,导致线粒体由细长杆形、高度互通的网状结构变成小尺寸椭圆形,嵴变得不明显,线粒体整体结构受到破坏[27]。
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能量代谢将化合物中的能量转移至ATP,为内皮细胞的生理活动提供能量储备。内皮细胞ATP的80%~85 %来自糖酵解,15%~20 %来自线粒体氧化磷酸化。mtROS通过直接损伤参与能量代谢的生物大分子抑制细胞能量代谢,而且还通过一系列反应间接调控代谢的进行。研究发现,内皮细胞内活化的沉默信息调节因子2相关酶家族(SIRT)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)非依赖性脱乙酰酶,通过上调转录因子表达和酶脱乙酰化,在细胞能量代谢中发挥关键作用[28]。SIRT3参与了线粒体ATP的生成、电子传递、调节线粒体呼吸链和去乙酰化激活SOD2等线粒体的大多数生物过程。同时有研究表明,SIRT3通过调节磷酸果糖激酶(PFK)的表达和活性,在内皮细胞糖酵解中发挥重要作用[29],而过度产生的mtROS会降低SIRT3的表达和活性,抑制细胞的能量代谢[30]。SIRT1通过正向调节过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)的表达和活性,维持线粒体膜电位、线粒体动力学和氧化磷酸化的稳定,而过度产生的mtROS通过影响SIRT1/PGC-1α信号通路,抑制线粒体能量代谢[31]。内皮细胞能量代谢受抑制时,ATP生成减少导致内皮细胞生理活动的减少,引起内皮细胞的严重损伤和功能障碍。
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自噬是细胞内通过溶酶体降解受损细胞器的过程。线粒体氧化应激能够通过内皮细胞的相关信号通路,启动和调节细胞内的线粒体自噬,清除受损线粒体,维持细胞稳态。研究表明,mtROS降低线粒体膜电位,导致PTEN诱导激酶1(PINK1)无法进入线粒体内膜与目标蛋白结合,而线粒体外膜稳定存在的PINK1通过多种调节途径引起线粒体自噬:激活并促进Tax1结合蛋白1(TAX1BP1)与细胞内自噬相关因子微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ型(LC-3Ⅱ)的结合,诱导自噬小体定向吞噬线粒体[32];磷酸化激活E3泛素连接酶parkin(也称为p62),诱导自噬小体膜与线粒体膜的结合[33]。PINK1受mtROS影响大量存在于线粒体外膜时,生理调节途径异常活化,导致线粒体自噬的过度激活,不止受损线粒体,功能正常的线粒体同样被自噬清除,同时激活自噬相关途径的细胞死亡,引发内皮细胞的严重损伤和功能障碍[32-34]。另有研究表明,mtROS通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)轴,激活Beclin 1介导的内皮细胞线粒体自噬。在这一过程中,敲除细胞内凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1),会抑制细胞内的线粒体自噬,提示LOX-1有促进线粒体自噬的作用[35]。
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细胞凋亡又称程序性死亡,是基因控制的细胞自主有序的死亡方式。炎症反应是血管系统应对损伤因子刺激时引起的以防御为主的反应,是损伤修复的过程。动脉粥样硬化病理过程中,内皮细胞是炎症反应发生时最先受损的部位,而且研究发现内皮细胞线粒体氧化应激同时导致炎症反应和细胞凋亡[25]。受mtROS激活的DNA损伤反应调节因子1(REDD1)作为炎症始动因子,激活下游硫氧还原蛋白相互作用蛋白(TXNIP),TXNIP是一种ROS敏感蛋白质,可以直接与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体结合并促进其活化[36],受mtROS激活的ISR信号也参与NLRP3的激活[2];NLRP3通过募集并激活凋亡因子caspase和促炎细胞因子IL-1β、IL-18等,诱导细胞炎症反应和凋亡,同时抑制SOD2的活性,导致严重的细胞损伤[37-38]。mtROS引起mtDNA泄露到胞浆,激活细胞内识别未甲基化CpG二核苷酸的toll样受体9(TLR-9),TLR-9诱导核转录因子Kappa-B(NF-κB)的激活和核转移,导致炎症反应的发生[39];mtROS激活线粒体内膜的单胺氧化酶A型(MAO-A),MAO-A催化5-HT降解的过程,也参与TLR-9的激活[40]。mtROS导致内质网内Ca2+泄露到胞浆并激活钙蛋白酶1(calpain-1),calpain-1诱导细胞色素c从线粒体释放到胞浆,进入胞浆的细胞色素c激活caspase-3,同时促进促凋亡蛋白Bax的激活及移位到线粒体,导致细胞凋亡的发生[41];mtROS激活的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)也参与Bax、caspase-3的激活[40]。研究发现,mtROS还通过直接诱导线粒体内细胞色素c、凋亡诱导因子(AIF)向胞浆释放,引发炎症反应,同时激活线粒体途径凋亡因子caspase-9,导致细胞凋亡[42-43]。炎症反应引起内皮细胞的凋亡,从整个血管内皮结构上脱落,导致内皮细胞屏障功能和调节功能的失效异常。
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内皮细胞合成和释放的一氧化氮(NO)是血管内皮依赖性舒张功能的主要调节因子。此外,NO还具有抑制血小板聚集和粘附、预防血栓形成、调节血管平滑肌细胞增殖的功能[44]。内皮细胞中NO的合成依赖于偶联形式的内皮型一氧化氮合酶(eNOS),mtROS能显著降低eNOS表达和磷酸化,减少NO的生成[45]。此外,mtROS能够与NO迅速反应生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)消耗已生成的NO,而且这一反应通过竞争性抑制SOD2与mtROS的反应过程拮抗SOD2的活性,导致mtROS的清除减少,产生恶性循环持续降低内皮细胞的NO。而ONOO-诱导作为eNOS辅助因子的四氢生物蝶呤(BH4)氧化,导致eNOS解偶联并转化为促氧化剂,反过来刺激ROS的产生,对细胞造成损伤[46]。mtROS还能通过多种通路间接影响NO的生成,激活C-Jun氨基末端激酶(JNK)/ p38 MAPK通路的磷酸化,抑制eNOS表达与活性[47];降低非对称性二甲基精氨酸(ADMA)的表达,增加下游二甲基精氨酸二甲胺水解酶Ⅱ(DDAH Ⅱ)的表达和活性,抑制eNOS磷酸化[48];抑制烟酰胺核苷酸转氢酶(NNT)活性,抑制eNOS的磷酸化[49]。NO浓度降低,引起的血管内皮舒张功能障碍,加重血液剪切应力引起的内皮细胞结构和功能的损伤;还加速血小板的聚集和血管平滑肌细胞的增殖,促进了动脉粥样硬化斑块的形成。
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mtROS导致细胞间紧密连接异常是血管内皮屏障功能障碍的主要原因之一。研究发现,mtROS激活的NF-κB诱导炎症反应的同时,还诱导基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达,mtROS经细胞色素c途径激活的caspase也能诱导MMP9的表达,而MMP9切割VE-钙粘蛋白(VE-cadherin),破坏细胞间紧密连接[50]。还有研究发现,mtROS促进Nrf2从细胞质移位到细胞核,上调血红素加氧酶1(HO-1)的表达,HO-1能上调抗氧化酶活性,同时还通过诱导血管内皮生长因子A(VEGF-A,也称为血管通透性因子)的分泌,引起细胞膜上VE-cadherin /VEGF Receptor 2复合物的解离,导致细胞间紧密连接的不连续[51]。内皮细胞间紧密连接的损伤,在动脉粥样硬化早期导致血液中物质侵入血管平滑肌细胞,引发炎症和组织钙化;在斑块形成之后,内皮细胞间紧密连接的损伤导致斑块的不稳定和破裂,导致血栓的形成。
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综上所述,线粒体氧化应激作为初始损伤因素,通过多种机制的共同作用诱导炎症反应、细胞凋亡、过度自噬等损伤事件,导致血管内皮功能障碍。对这一病理过程所涉及损伤事件的深入研究,越来越多的线粒体氧化应激诱导内皮细胞损伤的相关分子信号通路和内皮细胞对线粒体氧化应激的调控机制被阐明,有助于增加对线粒体氧化应激损伤内皮细胞机制的认识和理解动脉粥样硬化发病过程,并为从初始损伤因素缓解动脉粥样硬化病理进程提供有益的参考。但是深入研究线粒体氧化应激损伤内皮细胞机制的同时,针对线粒体的抗氧化研究则略显不足,目前临床使用的通过抗氧化作用改善内皮细胞氧自由基产生的药物有普罗布考和维生素,为数不多。仍需进一步研究通过抑制ROS大量产生或者激活细胞内固有抗氧化系统进而缓解线粒体氧化应激、并维持内皮细胞结构和功能完整性的治疗策略,将线粒体氧化应激作为临床治疗动脉粥样硬化的重要靶点,减少内皮细胞的初始损失并降低动脉粥样硬化患者的发病率。
Mitochondrial oxidative stress in vascular endothelial cell and atherosclerosis
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摘要: 血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化病理过程的起始环节。线粒体氧化应激与血管内皮细胞功能密切相关,线粒体氧化应激通过诱导线粒体自噬、一氧化氮生成减少、炎症反应、细胞代谢失衡和凋亡,导致血管内皮细胞的功能障碍。同时,血管内皮细胞也通过调控线粒体氧化应激维持自身稳态。本文旨在综述动脉粥样硬化病理过程中线粒体氧化应激诱发血管内皮细胞损伤的主要分子信号通路,为后续研究两者间的分子机制提供参考。Abstract: The injury of vascular endothelial cell function is the beginning of the pathological process of atherosclerosis. Mitochondrial oxidative stress is closely related to vascular endothelial cell function, which causes the dysfunction of vascular endothelial cell by inducing mitophagy, reducing nitric oxide production, inflammation, cellular metabolic imbalance and apoptosis. Meanwhile, vascular endothelial cell could also maintain their homeostasis by regulating mitochondrial oxidative stress. The molecular signaling pathways of the vascular endothelial cell injury caused by mitochondrial oxidative stress in the pathological process of atherosclerosis were outlined in this review, which provided reference for further research on the molecular mechanism between mitochondrial oxidative stress and endothelial damage.
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药物利用研究(DUR)是促进用药安全、有效和经济的重要手段[1]。随机对照临床试验(RCT)作为评价药物安全性、有效性的金标准,在外推至日常诊疗环境时往往面临挑战。作为RCT的重要补充,真实世界研究(RWS)考察日常诊疗环境中产生的真实世界数据(RWD),注重评价药物使用的“安全性”和“有效性”,已经成为药物利用研究的热点[2]。RWS着眼于应用到医疗实践环境中,大大缩短了试验周期、降低了成本,真实世界实效性临床研究更加易于获取全面的病例数据,使其结果更具有可靠性及可行性[3]。应当正确认识两者关系,将两者作为互补且相辅相成的研究方法和手段来为药物利用评价和监管评价等方面提供循证支持[4-7]。
随着医院管理信息系统(HIS)的高速发展以及高新传感器技术在生物医疗领域探索运用,使得逐步精准化、数字化患者的各项检查及健康诊疗数据成为现实,并进一步完善患者诊疗、实验室检查以及用药信息等全生命周期的医疗记录,且便于追溯及交互关联[2]。尽管数据库技术及大数据挖掘服务于药物安全性、有效性等方面研究成为现实,但应用于DUR尚缺乏具体的技术指导方案、自然流程等。本研究借鉴国内外RWS在药品器械上市后适应证开发及安全性评价方面的做法,梳理DUR中RWS有效技术手段和方法路径,为RWS更好的服务于DUR提供借鉴和参考。
1. 相关概念
DUR是按照预定的标准,评价、分析和解释一个给定的医疗卫生制度下药物利用的模式、质量、影响因素和结果,着重于药物的市场销售、分配、处方和使用情况,强调由此产生的医疗、社会和经济方面的结果。广泛应用于药物流行病学、抗菌药物管理、药物监测、药物警戒等方面的研究。2020年4月,国家药监局发布《真实世界证据支持药物研发与审评的指导原则(试行)》[8],对RWD、真实世界证据(RWE)以及RWS等概念做了相关阐述[8-9]。RWS作为实现从RWD到RWE的有效手段,是连接两者的桥梁[10]。然而,大规模的数据并不一定就能产生有价值的证据,只有通过适用性评估的RWD、分析得出医疗产品的使用和潜在收益或风险的临床证据时才有可能使数据转变为证据[11-12]。数据适用性即从数据使用者角度出发,评价数据满足使用者需求的程度[13],强调数据质量在开展相应RWS方面的可应用程度[14]。
2. 真实世界药物利用研究现状
2.1 真实世界研究与药物利用研究结合现状
国家药品监督管理局自2014年起就陆续出台多项措施,支持RWS用于医疗器械评价、药物审评、研发及监管决策,完善医疗器械不良事件监测和再评价制度,并联合高校、医联体推进多项试点工作的开展,出台了《真实世界研究支持儿童药物研发与审评的技术指导原则(试行)》[15]等法规文件以推进RWS。目前RWS主要集中在以下3个方面:①药物治疗效果[16-17],RWS在药物疗效、不良事件、安全可靠方面的结果研究,以满足药物对人类临床应答的解释以及推广方面应用;②指南或临床实践[18-20],国内外权威的指南是临床实践的重要参考依据,RWS也可用于协助制定和修订患者治疗方案,而RWE有利于指南更加科学性和具有实践性。此外,RWS还可以用于协助政府部门管理的指导性文件的制定;③经济效益[21-23],RWS应用于卫生经济学中筛选研究和治疗选择等方面,帮助医师制定最优的药物治疗方案,并提供合理的经济成本。此外,RWS在帮助制定个性化医疗政策方面也具有很大的潜力。
2.2 真实世界研究体系现状
国际上,随着药品审评和监管标准的不断提高,越来越多的研究者重视RWS,目前已经形成了良好的研究体系,比如美国的以患者为中心的结局研究所(PCORI)和欧盟临床试验公共注册和结果数据库(EUPAS)。RWS主要集中于:①在研究用药的随机对照试验、观察性研究及实践指南中的应用;②在疾病的发病风险评估、医疗健康保险的应用。目前国内的RWS主要涉及:①在中医方面的应用研究[24-26],包括中药的药物疗效及不良反应的研究;②基于医院信息数据库疾病及其合并疾病的用药特征的分析;③在医疗大数据及循证医学方面的应用[27-29]。
RWS的研究设计和方法学也不断完善,近年来不少国家或国际组织都陆续出台关于RWS的指南以及指导原则,提高了RWS的质量和可靠性,比如美国 FDA[30-31]、欧洲EMA[32],英国NICE[33]。
3. 真实世界研究在药物利用研究中的应用
3.1 真实世界药物利用研究的方法
3.1.1 数据来源及研究问题
RWS收集真实诊疗数据或者基于已经存在的研究型数据库或数据研究平台,建立登记数据库,针对具体研究问题,运用循证医学方法,开展数据分析,从而回答验证假设[34-36]。RWD通常来自于以上一个或多个数据库,包含需要主动收集的数据以及常规诊疗行为产生的临床数据。随着医学大数据的快速发展,一些研究型数据库或数据研究平台也逐步拓展,目前,国内外利用公共数据库如SEER、MIMIC等进行相关研究已成为RWS的重要发展方向。
RWS通常基于研究目的建立研究数据库或数据集,研究要素一般包含目标患者人口学特征、用药信息、门诊、住院信息、实验室检查、治疗转归与结局,以及其他研究目的所涉及到的临床治疗、护理、手术处置等信息。如果数据来自多个不同数据库,还必须通过如患者身份证号码、住院号/检查号、姓名等患者唯一标识码进行辨识和数据关联。如果研究的资料内容涉及到患者的个人信息等情况,还要注意取得伦理学审核以及保护患者隐私[37-41]。真实世界DUR的药品数据通常通过ATC编码来规范,采用用药依从性,限定日剂量(DDD)、平均治疗天数(ATD)、总DDD数、处方年费用等DUR指标[42]。基于药物效果和安全性研究、经济学和药物政策、多个疾病和多个治疗方案的复杂病情分析是当前真实世界药物利用研究的一个热点。
RWS作为一项非随机、开放性、不使用安慰剂的研究。为了挖掘真实的临床医疗环境产生的诊疗数据,应把质量控制作为全局指标来进行把握,并从研究伊始就建立起全面的数据质量控制方案并严格遵守。同时,在研究中详细记录异常情况[43],还要注意数据清洗以及混杂因素的控制,如此才能保证研究证据的质量及等级[44]。
3.1.2 研究人群及纳排标准
RWS人群纳入条件较为宽松,但仍在研究中需要明确与研究目的相关或可能影响研究的因素,以及纳入及排除标准的研究时间段和制定日期。研究通常通过WHO国际疾病分类(ICD-9/10)筛选研究人群。研究人群通常为患有特定疾病的患者、药物使用者(罕见病、孕妇、儿童等)以及患有多种疾病的复杂病例或有多种伴随症状的人群。有时候为解决研究对象以往接受过某种治疗措施可能导致的选择偏倚,还需要考虑遵照首次用药人群的设计[45]。最后,研究者需谨慎纳入和排除标准,以免直接影响研究结果的外推。
研究者应当严格参照PICOTS原则明确的6个关键点(总体、干预、比较对象、结果、时间和场所),同利益相关者一同提出针对研究问题可利用的科学方法[46]。
3.1.3 真实世界药物利用研究设计
观察性研究设计是RWS中广泛使用的设计类型之一[44],常见的有前瞻性观察研究[47]、回顾性队列研究[18,48]、Meta分析[49]等。根据不同的研究目的和研究对象,可以选择适合的研究方法和样本来源,通常需要开展大规模、跨学科的合作,以确保研究结果的可靠性和科学性。RWS设计时要结合研究目的来具体确定研究要素,综合考虑年龄、混杂偏倚和特殊人群、药品ATC编码,以及病历等非结构化数据。设计通常包括以下几个阶段:①定义问题:在研究开始之前明确研究的目的和问题,确定研究的对象、变量和数据采集方式。需要考虑研究的可行性、科学性和意义。②研究设计:根据定义的问题,制定设计方案。明确设计类型、样本容量、数据采集方式、结局指标以及数据分析方法等。③招募研究对象:确定研究对象的选择标准,并依照这些标准进行样本招募。④数据收集和管理:采集所需的研究数据,将收集到的数据进行规范化、清洗、质量控制和审查等处理。⑤数据分析:使用统计学方法进行数据分析,包括描述性统计、回归分析、生存分析和成本效益分析等。⑥结果解释和推广:将研究结果进行整合、解释和推广,发表研究报告和文章,向目标受众,如医师、政策制定者、患者和公众等,传达研究结论和建议。
3.1.4 特征变量及评价指标
RWS设计阶段应该充分了解现有数据的优缺点,并恰当合理的定义并描述暴露因素,尽可能的收集与暴露相关的特征指标。RWS结局指标是评估一种治疗或干预措施在真实医疗实践中的效果和安全性以及相关临床和经济结果的指标。
通常有以下几种结局指标:①主要疗效结局:主要的成果、结果或效果指标。例如,治疗效果、复发率、临床终点事件;②次要疗效结局:主要疗效结局之外的其他疗效结果或事件。如总体存活率(OS)、无进展生存期(PFS)、无病生存期(DFS)、疾病进展时间(TTP)、治疗失败时间(TTF)、死亡率,住院时间等[50];③安全性结局[12,51]:一般采用药物不良反应(ADR)、不良反应发生率(IRs,通常以1000人/年表示)[12]、危险性信号、药物相互作用等;④经济学结局[52-53]:包括成本效益和成本效用评估、日均费用、医疗保险、社会资源利用及患者的自付费用等。
选取结局指标时需要根据研究目的和研究对象,进行目标导向和可行性评估。常规首选应该是临床意义明确和易于全面评估的主要疗效结局,同时可以考虑次要疗效结局和安全性结局作为辅助评估。为综合评估治疗效果和成本并获得系统的经济评估结果,相关经济学方面的评价指标也应该考虑进来。
3.2 统计及敏感性分析
通常对目标患者群体和治疗模式进行描述性统计分析,分析各分类变量的频率、百分比,以及在连续区间尺度上测量的变量平均值、标准差、中位数及范围,有学者应用Kaplan-Meier(KM)生存函数进行相关生存分析[54]。针对研究目标确定分析要素,选用合适的统计分析方法,如卡方检验、logistic回归和多元线性回归等,对治疗结局、暴露因素、协变量数据类型及分布情况进行校正分析。由于所有研究结果基于假设提出,而这些假设往往是推论真实性的依据。研究者需对数据的局限性和问题本质有清晰认识,研究过程中对假设进行调整,评价观察结果对特定假设的敏感度或方向大小上的一致性。
3.3 混杂因素及偏倚控制
3.3.1 混杂因素
RWD来源包含电子病历、医保数据库、生命体征记录、医学图像等,存在许多复杂的混杂因素。混杂因素可能的类型包括个体基线特征、随时间变化的特征、医疗诊断和治疗、环境因素。常见的混杂控制策略包括随机对照、匹配分析、协变量校正、倾向值和剂量反应模型等。除此之外,在实施RWS时,还要注意有代表性的样本选择,对数据质量和分析偏倚进行评估和控制,以获得准确和可靠的研究结论。
3.3.2 偏倚控制
RWS是在真实临床环境下进行的研究,目标人群的治疗措施因非随机分配影响内部真实性,虚弱个体治疗措施与结局之间的关联性等,使得其研究结果可能存在一定的偏倚,这些偏倚可能影响研究的可靠性和有效性。常见的偏倚类型包括选择性偏倚、信息偏倚[55]、报告偏倚、记忆偏倚等,常见的偏倚控制方法有模拟试验、设计分层、倾向值匹配、重复量表、级联分析等。
4. 展望
真实世界DUR作为一种新兴的药物评价方法,可将从真实世界环境下收集和分析的大量数据利用起来,通过实效性、回顾性研究使得过往产生的既有诊疗数据进一步提炼成RWE而二次利用。通过研究分析获得的循证医学证据,可以为DUR提供有价值的依据,帮助优化药物使用、个体化医疗、提高患者结局、降低医疗费用、促进医学的健康发展;也可采用前瞻性研究大样本或特殊人群,为其更好、更安全有效用药提供证据。
同时,RWS也是评价药物滥用的有效手段。随着大数据和医疗技术的不断发展,RWS将会成为药物治疗效果、患者治疗策略和临床实践方面重要的研究领域,并将不断地推动医药的创新、优化和进步。
值得注意的是,RWS是一项复杂的研究工作,需要具备较强的统计、数据挖掘和医学知识背景,同时也面临着数据质量、缺失值、样本匹配和结果影响因素多等问题。因此,在实施RWS时,需要有效的科学设计、广泛报告,同时进行敏感度分析和可能存在的偏差分析,为制定更加科学和有效的药物治疗方案提供科学支持。
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[1] KAI H H, WU Q Y, YIN R H, et al. LncRNA NORAD promotes vascular endothelial cell injury and atherosclerosis through suppressing VEGF gene transcription via enhancing H3K9 deacetylation by recruiting HDAC6[J]. Front Cell Dev Biol,2021,9:701628. doi: 10.3389/fcell.2021.701628 [2] FUSTER J J. Integrated stress response inhibition in atherosclerosis[J]. J Am Coll Cardiol,2019,73(10):1170-1172. doi: 10.1016/j.jacc.2019.01.015 [3] ZENG J F, TAO J, XIA L Z, et al. Melatonin inhibits vascular endothelial cell pyroptosis by improving mitochondrial function via up-regulation and demethylation of UQCRC1[J]. Biochem Cell Biol,2021,99(3):339-347. doi: 10.1139/bcb-2020-0279 [4] KLUGE M A, FETTERMAN J L, VITA J A. Mitochondria and endothelial function[J]. Circ Res,2013,112(8):1171-1188. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.111.300233 [5] DYMKOWSKA D. The involvement of autophagy in the maintenance of endothelial homeostasis: The role of mitochondria[J]. 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