环孢素注射液在肾移植患者中的血药浓度与基因多态性的相关性研究

张艳霞; 陈泉金; 宋洪涛

doi:10.12206/j.issn.1006-0111.201911107

环孢素注射液在肾移植患者中的血药浓度与基因多态性的相关性研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911107

中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院药学科，福建福州 350025

详细信息

作者简介:
张艳霞，硕士，药师，研究方向：药物基因组学，Email：2463084798@qq.com

通讯作者: 陈泉金，主管药师，研究方向：药物基因组学; 宋洪涛，主任药师，研究方向：药物基因组学，Email：sohoto@vip.163.com

中图分类号: R915

Study on correlation between plasma concentration of cyclosporine injection and gene polymorphism in renal transplant patients

Department of Pharmacy, No. 900 Hospital of Joint Logistic Support Force of the PLA, Fuzhou 350025, China

摘要: 目的观察环孢素注射液在肾移植患者亚临床或临界排斥反应治疗中的临床疗效，研究与环孢素药动学相关的9个单核苷酸多态性（SNPs）和环孢素注射液剂量校正谷浓度（C₀/D′）的相关性，建立环孢素注射液的个体化给药模型。方法收集并记录144例使用环孢素注射液的成年肾移植患者的血液样本及临床资料，对患者的CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1(C1236T、G2677T/A、C3435T)、POR*28、PXR(C5705T、C39823T)以及NFKB1-94 ins/del ATTG等9个SNPs进行基因分型，比较不同基因型患者之间C₀/D′的差异，并应用多重回归分析方法建立基于基因多态性的个体化给药方案。结果环孢素注射液可使68.8%发生亚临床或临界排斥反应的肾移植患者血肌酐水平得到改善，稳态血药浓度为（189.50±38.56）ng/ml。CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液的C₀/D′具有显著相关性，*1/*1基因型患者的C₀/D′显著高于*18B/*18B基因型患者；CYP3A5*3、ABCB1 （C1236T、G2677T/A、C3435T）、PXR（C5705T、C39823T）、NFKB1-94 ins/del ATTG及POR*28基因多态性均与环孢素注射液的C₀/D′无显著相关性。在最终回归模型中，血红蛋白和CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液C₀/D′显著相关。结论环孢素注射液可有效改善发生亚临床或临界排斥反应的肾移植患者的血肌酐水平；CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液的C₀/D′显著相关。
- 肾移植 /
- 环孢素注射液 /
- 基因多态性 /
- CYP3A4 /
- 个体化给药
Abstract: Objective To investigate the clinical efficacy of cyclosporine injection in subclinical or critical treatment of renal transplant patients, and to establish an individualized dosage regimen of cyclosporine injection by studying the effects of nine single nucleotide polymorphisms related to the pharmacokinetics of cyclosporine on the dose-adjusted trough concentration (C₀/D′) of cyclosporine injection. Methods Blood samples and clinical data of 144 adult renal transplant patients who used cyclosporine injection were collected and recorded, then, their genotypes of CYP3A4*18B, CYP3A5*3, ABCB1 (C1236T, G2677T/A, C3435T), POR*28, PXR (C5705T, C39823T) and NFKB1-94 ins/del ATTG were determined by Sequenom MassARRAY^® SNP methods. Then, the discrepancies of cyclosporine injection’s C₀/D′ among the patients with different genotypes was compared and an individualized dosage regimen based on gene polymorphism of cyclosporine injection was established by using multivariate regression analysis. Results Cyclosporine injection improved serum creatinine level by 68.8% in renal transplant patients with subclinical or critical rejection, and the steady-state plasma concentration was (189.50±38.56) ng/ml. The CYP3A4*18B gene polymorphism was significantly correlated to C₀/D' of cyclosporine injection, and the C₀/D' of patients with *1/*1 genotype was significantly higher than patients of *18B/*18B genotype; but CYP3A5*3, ABCB1(C1236T, G2677T/A, C3435T), PXR C5705T, PXR C39823T, NFKB1-94 ins/del ATTG and POR*28 gene polymorphisms were not significantly correlated to C₀/D' of cyclosporine injection. In the final regression model, hemoglobin and CYP3A4*18B gene polymorphisms were significantly correlated to C₀/D' of cyclosporine injection. Conclusion Cyclosporine injection can effectively improve the serum creatinine level in patients with subclinical or critical rejection; CYP3A4*18B gene polymorphism is significantly correlated to C₀/D' of cyclosporine injection.
- renal transplant /
- cyclosporine injection /
- gene polymorphisms /
- CYP3A4 /
- individualized medication

松科(Pinaceae)植物马尾松(Pinusmassoniana Lamb.)主要产于江苏、安徽、河南、陕西及长江中下游各省区，资源丰富^[1]。松叶“味苦，温；暖，无毒”，具有祛风燥湿、杀虫、止痒之功用。水煎、浸酒以外用或内服^[2]用于治风湿痿痹、跌打损伤、湿疮、疥癣、慢性气管炎等症以及预防感冒、流脑。文献报道马尾松叶中的主要化学成分为挥发油、黄酮、多糖、木脂素和树脂等，现代药理研究表明马尾松叶提取物具有抗氧化、抗衰老、抑菌等多方面活性^[3-15]。

近年来由于抗生素的滥用、器官移植、免疫抑制剂以及HIV患者的增多，深部真菌感染发病率逐年上升，其中白念珠菌是最主要的致病菌。氮唑类药物氟康唑是临床上首选的抗白念珠菌(Candida albicans)感染药物。但是长期和重复给药导致白念珠菌对氟康唑耐药越来越强。目前联合用药是恢复耐药真菌对治疗药物的敏感度，提高耐药菌对氟康唑的敏感性，治疗深部耐药菌感染的一种有效的治疗途径。从天然活性成分中寻找与现有的抗真菌药物联合发挥协同作用的小分子化合物是近年来的研究方向之一^[16-20]。本文选用接近“传统水煎或浸酒法”的传统中药提取方法，用乙醇加热提取后，石油醚再萃取的方法得到马尾松叶低极性部位，通过测定马尾松叶低极性部位协同氟康唑抗耐药白念珠菌的MIC₈₀值，同时，采用气相色谱-质谱的方法对低极性部位的化学成分进行分析鉴定，初步探究其联合氟康唑的体外抗真菌活性。

1. 材料

1.1 试剂与设备

Thermo Trace GC Ultra气相色谱、Thermo DSQ Ⅱ质谱、Xcalibur工作站(美国赛默飞世尔公司）；马尾松叶(浙江东阳市，经海军军医大学黄宝康教授鉴定为马尾松Pinusmassoniana Lamb.)；所有试剂均为分析纯；水为重蒸水；载气为高纯氦气。

氟康唑注射液（上海信谊金朱药业有限公司）；黄芩素（上海历鼎生物技术有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，中国医药集团上海化学试剂公司）；白念珠菌103（Candida albicans103，海军军医大学长海医院真菌室提供）。

1.2 马尾松叶低极性部位的制备

取干燥马尾松叶，粉碎，称取二份，每份50.0 g，分别用150 ml石油醚和80%乙醇加热回流提取1h，滤过；滤渣再分别用150 ml石油醚和80%乙醇加热回流提取1 h，滤过。分别合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，得石油醚提取物（简称醚提取物）2.5 g和80%乙醇提取物（简称醇提取物）8.0 g。取干燥后的醇提取物5.0 g，加入水100 ml混溶，获得混悬液。混悬液用50 ml石油醚萃取3次，合并浓缩石油醚萃取液，获得石油醚浸膏（简称醚浸膏）即马尾松叶低极性部位0.8 g。取125 mg醚浸膏，置于100 ml量瓶中，加入80%甲醇，超声、加热使其几近完全溶解，放置、冷却；再加入80%甲醇定容，摇匀、放置；吸取1 ml定容后的浸膏液，微孔滤膜过滤后待测。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱TR - 35MS石英毛细管（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升温，起始温度40 ℃，保持2 min后以10 ℃/min的速度升至300 ℃并保持5 min；汽化温度250 ℃，进样量1 μl；分流比10∶1。载气为高纯氦气，流速1.0 ml/min。离子源：EI源；离子源温度为250 ℃；电子能量：70 eV；扫描范围：50～650 m/z。

2. 方法

2.1 抑菌实验方法

菌株选用临床分离耐药菌株白念珠菌103（氟康唑的MIC₈₀>128.0 μg/ml）。采用美国临床和实验室标准协会（CLSI）提出的RPMI1640 培养基微量稀释法，取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640液体培养基100 μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100 μl，菌液浓度范围为（1～5）×10³cfu/ml；2号孔分别加菌液160 μl和受试药物溶液40 μl；12号孔不含药物，只加菌液100 μl作阳性生长对照。2～11号孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物（醚提取物、醇提取物和醚浸膏）浓度分别为250.0、125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98和0.49 μg/ml，对照品黄芩素浓度分别为128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1%，氟康唑溶液的终浓度为8.0 μg/ml。96孔板于30℃恒温培养箱培养24 h后取出，读取受试药物与氟康唑（8.0 μg/ml）联用时的MIC₈₀值。微量稀释法测试结果见表1。

表 1 马尾松叶3种提取物与氟康唑联用对体外白念珠菌103活性(MIC₈₀)试验结果

化合物	MIC₈₀		联合抑菌浓度分数指数（FICI）	联合作用
化合物	单用(μg/ml)	与氟康唑联用(μg/ml)*	联合抑菌浓度分数指数（FICI）	联合作用
醚提取物	>250.0	>250.0	1.031	无关
醇提取物	>250.0	7.81	0.047	协同
醚浸膏	>250.0	31.25	0.094	协同
黄芩素	16.0	4.0	0.281	协同
氟康唑	>128.0	−	−	−
*与8 μg/ml 氟康唑联合使用

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协同药效的判定采用联合抑菌浓度分数指数（FICI），即联用抑菌时每种药物所需最低抑菌浓度（MIC）与单用这种药物抑菌时所需MIC的比值的和。当FICI≤0.5时，两种药物的相互作用效果被定义为具有协同作用；当FICI>0.5时，认为两种药物无相互作用。

2.2 色谱-质谱分析方法

按“1.3”项下实验条件对马尾松叶低极性部位进行分析，25 min得到马尾松叶低极性化学成分的总离子流图（图1）。共检测出30个峰，通过检索NIST08光谱数据库，按60%以上匹配率（SI和RSI均大于600，最大值1 000），并结合质谱裂解规律确定其化学成分。运用峰面积归一法通过Xcalibur化学工作站数据处理系统，测得各个化学成分在石油醚部位中的质量百分数。

图 1 马尾松叶低极性化学成分总离子流图

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3. 结果与分析

由表1可见，各受试药物单用时，对照品黄芩素的MIC₈₀为16.0 μg/ml，提示了其具有一定的抗菌活性，其他的化合物的MIC₈₀均大于250 μg/ml。各受试药物与氟康唑（8.0 μg/ml）联用后，对照品黄芩素、醇提取物及醚浸膏的MIC₈₀降至4.0～31.25 μg/ml，相应的FICI值均小于0.5，显示黄芩素、醇提取物、醚浸膏分别与氟康唑联用对耐药白念珠菌均具有协同活性，但醇提取物和醚浸膏的协同活性不及对照品黄芩素，醚浸膏协同活性小于醇提取物。醚提取物单用及与氟康唑联用的MIC₈₀均大于250 μg/ml，FICI大于0.5，显示其单用及与氟康唑联用均没有协同氟康唑抗耐药白念珠菌活性。

如表2所示，本次GC-MS检测出30种成分，鉴定出17个化合物。统计出本次所测马尾松叶的低极性化学成分中含有烷烃4个（6.1%），甾烷类5个（4%），脂肪酸1个（0.75%），二萜5个（53.99%），其他峰均提示为聚硅氧烷（35.16%），其中含量较高的化学成分是：玛瑙酸（8.38%，见图2）、脱氢枞酸甲酯（8.41%，见图3）。

表 2 马尾松叶低极性化学成分分析结果

序号	保留时间(min)	相似度SI值	相似度RSI值	化合物	含量(%)
1	10.30	821	850	正十五烷	1.52
2	13.15	797	840	2,6,11,15-四甲基-十六烷	2.23
3	15.68	781	822	2,6,10-三甲基-十四烷	1.37
4	17.95	709	727	3-乙基-5-（2-乙基丁基）-十八烷	0.98
5	19.03	661	770	泪柏醚	0.68
6	19.96	641	684	1-单烯丙基甘油三甲基硅醚	0.75
7	20.00	639	670	3,3-亚乙基二氧基-5β-胆甾烷	1.00
8	20.78	688	700	玛瑙酸/贝壳杉萘甲酸	8.38
9	20.88	621	690	N-[24-氧代-3α-（三甲基硅氧基）-5β-胆安-24-基]甘氨酸甲酯	0.51
10	20.96	636	739	24, 25-二羟基维生素D3 / 24R, 25-二羟胆钙化醇	1.11
11	21.16	609	633	17-乙酰氧基-4,4,10,13-四甲基-7-氧代-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊烷(a)菲-3-基,乙酸	0.61
12	21.38	777	915	隐青霉酸甲酯 / 山莨菪碱酸甲酯 /海松酸甲酯	4.62
13	21.45	626	636	3-羟基-2,5,5,8a-四甲基-1,4,4a,5,6,7,8,8a-八氢萘-1-羧酸，2-三甲基硅乙基酯	31.90
14	21.79	645	662	3,11,18-三乙酰氧基-3,19:14,15-二环氧孕烷-20-酮	0.77
15	21.87	625	765	1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-十六甲基八硅氧烷	1.50
16	22.09	841	889	脱氢枞酸甲酯	8.41
17	22.29	676	788	1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13-十四甲基七硅氧烷	1.30

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图 2 玛瑙酸/贝壳杉萘甲酸

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图 3 脱氢枞酸甲酯

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4. 讨论

近年来研究发现马尾松叶提取物具有抗真菌活性：马尾松叶石油醚、氯仿等溶剂的提取物以及不同比例的乙醇水提取物可以抑制曲霉、青霉、啤酒酵母的生长；马尾松叶乙醇提取物对枯萎病、灰霉菌有显著的抑菌活性；马尾松叶水提物对白色念珠菌有较弱抑菌性^[21-25]。但马尾松叶提取物对氟康唑耐药白念珠菌的协同抗菌活性未见报道。

本研究发现，马尾松叶的醇提取物和醚浸膏单独使用时均不及黄芩素，没有抗耐药白念珠菌活性，但联用氟康唑（8 μg/ml）后，醇提取物和醚浸膏均表现出协同活性，醇提取物的活性更好，而醚提取物无论是单独使用还是联用氟康唑都没有抗耐药白念珠菌活性。醚浸膏与醚提取物相比，提取方法的改变，导致了提取物抑菌效果的有无。醚浸膏的活性应该源于乙醇加热提取获得的更丰富、含量更高的化学成分，尽管醚浸膏的主要成分也是低极性成分，但与醚提取物相比无论在含量和组成上均应不同。醚提取物含有更丰富的挥发油等低极性成分，但是可能缺少了一些重要的活性抗真菌成分，导致其没有协同抗耐药真菌作用。我们进一步对活性部位醚浸膏进行了GC-MS化学成分分析，结果表明，其化学成分与文献报道的采用水蒸气和超临界CO₂提取法获得的马尾松叶挥发油成分相比差异大。活性部位醚浸膏中化合物结构类型和数量比文献报道的直接提取的挥发油少，且没有以蒎烯、莰烯为主的单萜和以石竹烯等为主的倍半萜，仅有烷烃类少量化合物重合^[26-31]。活性部位醚浸膏采用了乙醇加热提取后，再经石油醚萃取得到，加热提取可能导致了蒎烯、莰烯、石竹烯等低沸点萜类化合物的丢失，但分子量更大的二萜类化学成分含量升高（53.99%）。二萜类化学成分中脱氢枞酸甲酯、海松酸甲酯是主要化学成分，两者也是松香酸的主要成分。有文献报道松香酸具有抗赤霉菌、灰霉菌等多种抗真菌活性^[32-35]。因此，醚浸膏中的二萜类化合物可能是其协同氟康唑抗耐药白念珠菌作用的重要活性成分，值得进一步研究。此外，Zuzana研究发现云杉提取物中的β-谷甾醇抑制微生物生长，同时低浓度的脱氢枞酸甲酯破坏细胞壁，两者相互协同可能是云杉提取物对青霉菌、链格孢菌、米根霉的抑菌活性的关键^[36]。本研究获得的醚浸膏中也含有丰富的树脂酸（13.03%）和甾烷（4%）。树脂酸和甾烷的协同可能也是醚浸膏具有协同氟康唑抗耐药白念珠菌活性的原因，这一点也值得进一步研究。

综上所述，本文首次报道了马尾松叶乙醇提取物以及马尾松叶低极性部位具有协同氟康唑抗耐药白念珠菌作用，并首次对马尾松叶低极性部位进行了GC-MS分析，鉴别的化合物除了烷烃、脂肪酸、脱氢枞酸甲酯外其它11种成分都是首次从该植物中发现，丰富了马尾松叶的化学成分。

表 1 研究对象的一般临床资料（n=144）

指标	统计描述	百分率（%）
年龄（岁）	37.5（15）
性别（男/女，例）	109/35	75.7/24.3
体重（kg）	59.46±10.47
体表面积（m²）	1.65（0.28）
BMI（kg/ m²）	21.21±3.14
血红蛋白（g/L）	101.56±24.05
血细胞比容（%）	30.84±7.16
供体类型（尸体/亲属，例）	122/22	84.7/15.3
环孢素使用天数（d）	11（7）
是否激素冲击（是/否，例）	80/64	55.6/44.4
血肌酐是否降低（是/否，例）	112/32	77.7/22.3
注：数据以（$\bar x \pm s$）或Me（IQR）表示

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表 2 单独用药与联合用药方案的血肌酐降低幅度差异

用药方案	例数及比例(N/%)	肌酐降低例数及比例(N/%)	C₀（ng/ml）	肌酐降低幅度（%）
环孢素注射液	64（44.4）	44（68.8）	189.50±38.56	19.27（22.84）
环孢素注射液+糖皮质激素	80（55.6）	68（85.0）	172.87±44.27^*	45.25（50.38）^**
注：^P＜0.05，^*P＜0.01，与单用环孢素注射液比较

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表 3 肾移植患者中9个SNPs基因分型以及等位基因频率(n=144)

SNP（ID）	基因型频率（%）			等位基因频率（%）		χ²	P
SNP（ID）	野生/野生	野生/突变	突变/突变	野生	突变	χ²	P
CYP3A4*18B	GG（11）	GA（118B）	AA（18B18B）	G	A	0.046	0.830
rs2242480	80（55.6%）	54（37.5%）	10（6.9%）	74.3%	25.7%	0.046	0.830
CYP3A5*3	AA（11）	AG（13）	GG（33）	A	G	0.005	0.945
rs776746	11（7.6%）	57（39.6%）	76（52.8%）	27.4%	72.6%	0.005	0.945
ABCB1 C1236T	CC	CT	TT	C	T	0.985	0.321
rs1128503	14（9.7%）	70（48.6%）	60（41.7%）	34.0%	66.0%	0.985	0.321
ABCB1G 2677T/A	GG	GT+GA	TT+TA+AA	G	T+A	0.070	0.791
rs2032582	23（16.0%）	71（49.3%）	50（34.7%）	40.6%	59.4%	0.070	0.791
ABCB1 C3435T	CC	CT	TT	C	T	1.249	0.264
rs1045642	54（37.5%）	63（43.8%）	27（18.7%）	59.4%	40.6%	1.249	0.264
PXR C5705T	CC	CT	TT	C	T	2.918	0.088
rs3814055	87（60.4%）	45（31.3%）	12（8.3%）	76.0%	24.0%	2.918	0.088
PXR C39823T	CC	CT	TT	C	T	2.250	0.134
rs2276707	40（27.8%）	80（55.6%）	24（16.6%）	55.6%	44.4%	2.250	0.134
NFKB1-94 ins /delATTG	II ^①	ID ^②	DD ^③	I	D	0.036	0.849
rs28362491	45（31.3%）	72（50.0%）	27（18.7%）	56.3%	43.7%	0.036	0.849
POR*28	CC	CT	TT	C	T	2.193	0.139
rs1057868	26（40.6%）	25（39.1%）	13（20.3%）	60.2%	39.8%	2.193	0.139
注：①. 指插入突变纯合子；②. 指插入突变杂合子；③. 指缺失突变纯合子。

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表 4 各位点不同基因型对环孢素C₀/D′的影响

位点（ID）	基因型	例数/占比[n,(%)]	C₀/D′[(ng/ml)/(mg/kg)]	P
CYP3A4*18B rs2242480	1/1	80（55.6）	1.52±0.42	0.044
	1/18B	54（37.5）	1.42±0.42
	18B/18B	10（6.9）	1.19±0.26^*
CYP3A5*3 rs776746	1/1	11（7.6）	1.36±0.46	0.647
	1/3	57（39.6）	1.45±0.37
	3/3	76（52.8）	1.48±0.45
ABCB1 C1236T rs1128503	CC	14（9.70）	1.43±0.48	0.486
	CT	70（48.6）	1.50±0.41
	TT	60（41.7）	1.41±0.42
ABCB1 G2677T/A rs2032582	GG	23（16.0）	1.40±0.41	0.674
	GA+GT	71（49.3）	1.49±0.40
	AA+AT+TT	50（34.7）	1.44±0.46
ABCB1 C3435T rs1045642	CC	54（37.5）	1.46±0.41	0.596
	CT	63（43.8）	1.43±0.43
	TT	27（18.7）	1.53±0.43
PXR C5705T rs3814055	CC	87（60.4）	1.43±0.41	0.442
	CT	45（31.3）	1.48±0.45
	TT	12（8.30）	1.58±0.36
PXR C39823T rs2276707	CC	40（27.8）	1.55±0.49	0.262
	CT	80（55.6）	1.43±0.40
	TT	24（16.6）	1.38±0.35
NFKB1（-94 ins/del ATTG） rs28362491	II	45（31.3）	1.49±0.46	0.300
	ID	72（50.0）	1.41±0.41
	DD	27（19.7）	1.54±0.39
POR*28 rs1057868	1/1	26（40.6）	1.63±0.45	0.491
	1/28	25（39.1）	1.48±0.43
	28/28	13（20.3）	1.54±0.38
注：^P<0.05，与1/*1型比较。

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表 5 各观察指标与环孢素注射液C₀/D′的相关性

指标	相关系数（r）	决定系数（R²）	P
年龄	0.114	0.013	0.175
性别	−0.071	0.005	0.400
体重	0.140	0.020	0.094
血红蛋白	0.463	0.214	0.000*
血细胞比容	0.454	0.206	0.000*
供体类型	0.112	0.013	0.180
CYP3A4*18B	−0.176	0.031	0.035
CYP3A5*3	0.043	0.002	0.610
ABCB1 C1236T	−0.056	0.003	0.504
ABCB1 G2677T/A	0.006	0.000	0.943
ABCB1 C3435T	0.022	0.000	0.798
PXR C5705T	0.100	0.010	0.235
PXR C39823T	−0.136	0.018	0.103
NFKB1（-94 ins/del ATTG）	0.003	0.000	0.971
POR*28	−0.130	0.017	0.305

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期刊类型引用(1)
1. 江丽，龚春燕，李新宇. 环孢素A用于银屑病治疗的血药浓度监测追溯分析. 中国医院用药评价与分析. 2021(03): 366-369 . 百度学术
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1. 材料
1.1 试剂与设备
1.2 马尾松叶低极性部位的制备
1.3 色谱-质谱条件
2. 方法
2.1 抑菌实验方法
2.2 色谱-质谱分析方法
3. 结果与分析
4. 讨论

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环孢素（cyclosporine A, CsA）是肾移植术后三联免疫抑制方案中的基础用药之一。环孢素个体差异大、治疗窗窄，静脉给药虽能更快达到目标浓度，但也更容易使血药浓度偏离治疗窗。研究表明，环孢素血药浓度的个体间差异受患者生理、病理、遗传等因素的影响^[1]，尤其是与其体内过程相关的基因多态性，如CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1（C1236T、G2677T/A、C3435T）、POR*28、PXR（C5705T、C39823T）和NFKB1-94 ins/del ATTG等。然而，目前如何根据基因型调整用药尚不明确，且针对环孢素注射液基因多态性的研究尚未见报道。因此，探究基因多态性对环孢素注射液血药浓度的影响，尝试建立以基因多态性为基础的个体化给药方案对优化临床用药具有一定的意义。

2. 结果

2.1. 环孢素注射液的临床疗效分析

入组患者共144例，其中男性109例，女性35例，患者基本信息见表1。

表 1 研究对象的一般临床资料（n=144）

指标	统计描述	百分率（%）
年龄（岁）	37.5（15）
性别（男/女，例）	109/35	75.7/24.3
体重（kg）	59.46±10.47
体表面积（m²）	1.65（0.28）
BMI（kg/ m²）	21.21±3.14
血红蛋白（g/L）	101.56±24.05
血细胞比容（%）	30.84±7.16
供体类型（尸体/亲属，例）	122/22	84.7/15.3
环孢素使用天数（d）	11（7）
是否激素冲击（是/否，例）	80/64	55.6/44.4
血肌酐是否降低（是/否，例）	112/32	77.7/22.3
注：数据以（$\bar x \pm s$）或Me（IQR）表示

对患者环孢素注射液C₀及用药后的血肌酐降低幅度进行统计分析。结果显示，单独使用环孢素注射液（单独用药组）后肌酐降低的患者比例为68.8%；联合使用环孢素注射液和糖皮质激素冲击治疗（联合用药组）后肌酐降低的患者比例为85.0%。单独用药组比联合用药组具有更高的C₀〔（189.50±38.56）ng/ml vs（172.87±44.27）ng/ml〕，经独立样本T检验，两组患者C₀的差异具有统计学意义（P＜0.05）。然而，对两组患者的肌酐降低幅度进行Mann-Whitney U检验发现，单独用药组患者的肌酐降低幅度显著低于联合用药组〔19.27（22.84）% vs 45.25（50.38）%；P＜0.01〕（见表2）。

表 2 单独用药与联合用药方案的血肌酐降低幅度差异

用药方案	例数及比例(N/%)	肌酐降低例数及比例(N/%)	C₀（ng/ml）	肌酐降低幅度（%）
环孢素注射液	64（44.4）	44（68.8）	189.50±38.56	19.27（22.84）
环孢素注射液+糖皮质激素	80（55.6）	68（85.0）	172.87±44.27^*	45.25（50.38）^**
注：^P＜0.05，^*P＜0.01，与单用环孢素注射液比较

2.2. 哈迪-温伯格平衡检验和基因型分布情况

入组患者的CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 G2677T/A、ABCB1 C3435T、PXR C5705T、PXR C25385T、NFKB1 -94 ins /del ATTG及POR*28（仅64例患者）等9个SNPs的基因型频率分布及HWE遗传平衡吻合度计算见表3。9个SNPs均符合HWE（P>0.05），说明研究对象来自同一孟德尔群体，具有良好的群体代表性。

表 3 肾移植患者中9个SNPs基因分型以及等位基因频率(n=144)

SNP（ID）	基因型频率（%）			等位基因频率（%）		χ²	P
SNP（ID）	野生/野生	野生/突变	突变/突变	野生	突变	χ²	P
CYP3A4*18B	GG（11）	GA（118B）	AA（18B18B）	G	A	0.046	0.830
rs2242480	80（55.6%）	54（37.5%）	10（6.9%）	74.3%	25.7%	0.046	0.830
CYP3A5*3	AA（11）	AG（13）	GG（33）	A	G	0.005	0.945
rs776746	11（7.6%）	57（39.6%）	76（52.8%）	27.4%	72.6%	0.005	0.945
ABCB1 C1236T	CC	CT	TT	C	T	0.985	0.321
rs1128503	14（9.7%）	70（48.6%）	60（41.7%）	34.0%	66.0%	0.985	0.321
ABCB1G 2677T/A	GG	GT+GA	TT+TA+AA	G	T+A	0.070	0.791
rs2032582	23（16.0%）	71（49.3%）	50（34.7%）	40.6%	59.4%	0.070	0.791
ABCB1 C3435T	CC	CT	TT	C	T	1.249	0.264
rs1045642	54（37.5%）	63（43.8%）	27（18.7%）	59.4%	40.6%	1.249	0.264
PXR C5705T	CC	CT	TT	C	T	2.918	0.088
rs3814055	87（60.4%）	45（31.3%）	12（8.3%）	76.0%	24.0%	2.918	0.088
PXR C39823T	CC	CT	TT	C	T	2.250	0.134
rs2276707	40（27.8%）	80（55.6%）	24（16.6%）	55.6%	44.4%	2.250	0.134
NFKB1-94 ins /delATTG	II ^①	ID ^②	DD ^③	I	D	0.036	0.849
rs28362491	45（31.3%）	72（50.0%）	27（18.7%）	56.3%	43.7%	0.036	0.849
POR*28	CC	CT	TT	C	T	2.193	0.139
rs1057868	26（40.6%）	25（39.1%）	13（20.3%）	60.2%	39.8%	2.193	0.139
注：①. 指插入突变纯合子；②. 指插入突变杂合子；③. 指缺失突变纯合子。

2.3. 基因多态性与环孢素注射液血药浓度的相关性

各位点不同基因型患者之间使用环孢素注射液的C₀/D′的差异见表4。在9个SNPs中，CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液的C₀/D′具有显著相关性，*1/*1基因型患者的C₀/D′显著高于*18B/*18B基因型患者（P＜0.05）；CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 G2677T/A、ABCB1 C3435T、PXR C5705T、PXR C39823T、NFKB1-94 ins/del ATTG及POR*28基因多态性均与肾移植患者环孢素注射液的C₀/D′无显著相关性（P＞0.05）。

表 4 各位点不同基因型对环孢素C₀/D′的影响

位点（ID）	基因型	例数/占比[n,(%)]	C₀/D′[(ng/ml)/(mg/kg)]	P
CYP3A4*18B rs2242480	1/1	80（55.6）	1.52±0.42	0.044
	1/18B	54（37.5）	1.42±0.42
	18B/18B	10（6.9）	1.19±0.26^*
CYP3A5*3 rs776746	1/1	11（7.6）	1.36±0.46	0.647
	1/3	57（39.6）	1.45±0.37
	3/3	76（52.8）	1.48±0.45
ABCB1 C1236T rs1128503	CC	14（9.70）	1.43±0.48	0.486
	CT	70（48.6）	1.50±0.41
	TT	60（41.7）	1.41±0.42
ABCB1 G2677T/A rs2032582	GG	23（16.0）	1.40±0.41	0.674
	GA+GT	71（49.3）	1.49±0.40
	AA+AT+TT	50（34.7）	1.44±0.46
ABCB1 C3435T rs1045642	CC	54（37.5）	1.46±0.41	0.596
	CT	63（43.8）	1.43±0.43
	TT	27（18.7）	1.53±0.43
PXR C5705T rs3814055	CC	87（60.4）	1.43±0.41	0.442
	CT	45（31.3）	1.48±0.45
	TT	12（8.30）	1.58±0.36
PXR C39823T rs2276707	CC	40（27.8）	1.55±0.49	0.262
	CT	80（55.6）	1.43±0.40
	TT	24（16.6）	1.38±0.35
NFKB1（-94 ins/del ATTG） rs28362491	II	45（31.3）	1.49±0.46	0.300
	ID	72（50.0）	1.41±0.41
	DD	27（19.7）	1.54±0.39
POR*28 rs1057868	1/1	26（40.6）	1.63±0.45	0.491
	1/28	25（39.1）	1.48±0.43
	28/28	13（20.3）	1.54±0.38
注：^P<0.05，与1/*1型比较。

2.4. 环孢素注射液个体化给药模型的建立

参考单因素和多因素分析方法，将3个人口统计学指标（性别、年龄、体重）、3个临床指标（血红蛋白、血细胞比容、供体类型）和上述9个SNPs基因多态性定义为自变量，与环孢素注射液的C₀/D′进行单因素相关分析。结果显示，在以上指标中，血红蛋白、血细胞比容和CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液的C₀/D′呈正相关，CYP3A4*18B与环孢素注射液的C₀/D′呈负相关。其他12个指标与环孢素注射液C₀/D′均没有显著相关性，详见表5。

表 5 各观察指标与环孢素注射液C₀/D′的相关性

指标	相关系数（r）	决定系数（R²）	P
年龄	0.114	0.013	0.175
性别	−0.071	0.005	0.400
体重	0.140	0.020	0.094
血红蛋白	0.463	0.214	0.000*
血细胞比容	0.454	0.206	0.000*
供体类型	0.112	0.013	0.180
CYP3A4*18B	−0.176	0.031	0.035
CYP3A5*3	0.043	0.002	0.610
ABCB1 C1236T	−0.056	0.003	0.504
ABCB1 G2677T/A	0.006	0.000	0.943
ABCB1 C3435T	0.022	0.000	0.798
PXR C5705T	0.100	0.010	0.235
PXR C39823T	−0.136	0.018	0.103
NFKB1（-94 ins/del ATTG）	0.003	0.000	0.971
POR*28	−0.130	0.017	0.305

对上述3个相关因素与环孢素注射液C₀/D′进行的初步多重逐步回归分析，排除存在共线性问题的因素，得到最佳模型。在最佳回归模型中，血红蛋白和CYP3A4*18B基因多态性对环孢素注射液C₀/D′均有统计学意义（P值分别为0.000和0.024）。根据最佳回归模型得到的回归方程即环孢素注射液C₀/D′的预测算法，方程式如下：

Y=0.695+0.008X₁−0.112X₂,

式中因变量Y为环孢素注射液C₀/D′，因此，应用环孢素注射液的肾移植患者环孢素注射液维持剂量预测模型为：

D′（mg/m²）=C/（0.695+0.008X₁−0.112X₂）

公式中：X₁代表用药前患者的血红蛋白含量，X₂代表CYP3A4*18B基因多态性；CYP3A4 *1/*1型患者X₂=0，CYP3A4*1/*18B型患者X₂=1，CYP3A4*18B/*18B型患者X₂=2；C为临床TDM目标谷浓度值。

3. 讨论

糖皮质激素冲击治疗是肾移植术后发生急性排斥反应的一线治疗方案。然而，由于糖皮质激素冲击治疗不良反应多且发生率高，对于临床上仅发生或疑似发生亚临床或临界排斥反应的患者可能并不是最佳用药。蔡治涛等^[2]收录在《2012年中国器官移植大会论文汇编》中的研究指出以静脉环孢素为基础的免疫抑制治疗方案是一种安全、有效的治疗手段。为探究环孢素注射液在临床上的疗效，本研究对两种治疗方案（环孢素注射液单药vs环孢素注射液和糖皮质激素联合用药）对肾移植术后发生亚临床或临界排斥反应的临床疗效进行研究，结果发现，环孢素注射液单药组在降低患者肌酐水平方面的疗效不及环孢素注射液和糖皮质激素联合用药组〔肌酐降低比例：68.8% vs 85.0%；肌酐降低幅度：19.27（22.84）% vs 45.25（50.38）%；P＜0.01〕，但单药组具有更高的稳态谷浓度C₀〔（189.50±38.56）ng/ml vs （172.87±44.27）ng/ml〕。该研究结果表明对于肾移植术后发生亚临床或临界排斥反应的患者，单用环孢素注射液仍然具有较好的临床疗效，且血药浓度处于比较安全的剂量范围，可能是比较适合该类患者的治疗方案。

大量研究表明，遗传因素如编码药物转运体、代谢酶、作用靶点和核受体的基因多态性^[3]是引起药物在人体内的处置和药物反应的个体性差异的主要原因，其中CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1（C1236T、G2677T/A、C3435T）、POR*28、PXR（C5705T、C39823T）以及NFKB1-94 ins/del ATTG对环孢素药动学的影响较为重要。

CYP3A4和CYP3A5是环孢素的主要代谢酶，其编码基因的多态性可能影响酶的表达，进而影响环孢素的药动学。研究表明，CYP3A4*18B（或称CYP3A4*1G，82266G>A；rs2242480），是与环孢素的体内代谢相关的SNPs之一，在中国人群中突变频率为29.5%^[4]，该位点的突变可能会提高CYP3A4的活性^[5]，增加环孢素的代谢从而降低其血药浓度。Li等^[6]研究发现，携带CYP3A4*18B/*18B基因型患者的环孢素血药浓度显著低于*1/*1及*1/*18B基因型患者，但*1/*1与*1/*18B基因型患者间差异无统计学意义。本研究结果显示，*1/*1基因型患者的环孢素注射液的C₀/D′显著高于*18B/* 18B基因型患者（P<0.05），但*1/*1与*1/*18B基因型患者间差异无统计学意义。该结果与文献报道一致。CYP3A5*3（6986A>G；rs776746）是另一个与环孢素的体内代谢相关的SNP，在中国人群中的突变频率高达75.4%^[7]。当*1突变为*3时可导致mRNA剪接发生改变和蛋白质截断，使CYP3A5酶活性降低或消失，减少环孢素经CYP3A5酶的代谢，从而使环孢素血药浓度升高。目前该位点基因多态性与环孢素血药浓度相关性的研究结论尚不统一^[8-11]。本研究结果显示，CYP3A5*3基因多态性均与环孢素注射液的C₀/D′无相关性。出现这一结果可能主要是环孢素由CYP3A酶系中的CYP3A4代谢，其对环孢素的清除率是CYP3A5的2.3倍^[12]所导致。

P糖蛋白（P-gp）在环孢素的转运中发挥着重要作用，静脉给药可被肝脏P-gp将药物转移至胆道使药物胆汁排泄增加，从而使血药浓度降低。P-gp是多重耐药基因ABCB1编码的产物，因此ABCB1基因多态性可影响P-gp的表达从而影响环孢素的血药浓度。本研究结果显示，ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和ABCB1 G2677T/A基因多态性与环孢素注射液的C₀/D′无相关性，分析原因可能是由于P-gp主要位于小肠黏膜成熟上皮细胞的刷状缘上，只有小部分分布于肝细胞，因此，由ABCB1基因多态性导致的P-gp表达和活性的改变对环孢素注射液血药浓度的影响较小。

孕烷X受体（PXR）编码基因多态性很可能会影响PXR表达或功能，进而影响CYP3A酶及P-gp的表达，从而影响环孢素的药动学。研究报道^[13-14]，C5705T（rs3814055）、C39823T（rs2276707）与CYP3A4表型、活性和含量有关，且二者在中国人群中的突变频率分别是38.06%和78.95%^[15]。但截至目前，PXR基因多态性是否与环孢素药动学具有相关性尚存在争议。本研究结果显示，PXR C5705T及C39823T基因多态性与环孢素注射液血药浓度无相关性。

NFKB1-94 ins/del ATTG中ATTG 4个碱基的缺失(deletion)引起启动子活性的降低，进而降低NF-κB的表达和功能，较少炎症反应的发生，从而减少对环孢素代谢的影响。Zhang等^[10]研究发现，NFKB1 -94ATTG插入突变的纯合子个体（-94ATTG ins/ins）环孢素的C₀/D'显著高于缺失突变（-94ATTG del/del）的个体〔（75.9±32.9）vs.（55.1±15.1）ng/ml per mg/kg，P=0.026〕。然而，本研究却发现缺失突变纯合子患者的C₀/D′高于插入突变纯合子患者，但差异无统计学意义（P>0.05）。出现此结果的原因可能是该基因对环孢素的血药浓度的影响主要是通过受NF-κB的炎症反应而实现的，属于间接作用，所以可能对环孢素注射液的C₀/D′影响较小，在其他主要影响因素的作用下导致缺失突变纯合子患者的C₀/D′高于插入突变纯合子患者。

POR*28在中国人群中突变率为29.6%^[16]。有研究报道，POR*28能够增加CYP3A的活性，从而增加环孢素经CYP3A的代谢使得其血药浓度降低。Elens等^[17]分析了174例肾移植患者的POR*28的基因型及环孢素的部分药动学参数，结果发现，POR*28/*28患者的C₀/D'较POR*1/*28和*1/*1患者低15.1%（CI 95%=224.8~24.2%；P=0.03），但POR*1/*28型和POR*1/*1型间无显著性差异。然而，本研究结果显示，POR*28/*28基因型患者环孢素的C₀/D′与POR*1/*28和*1/*1基因型患者间并无显著性差异。

本研究所建立的给药剂量模型，只纳入血红蛋白和CYP3A4*18B基因多态性两个因素，经检验模型是有意义的（F=23.85，P<0.001），但该模型只能解释25.3%（R²=0.253）的个体差异，可能存在其他的对环孢素注射液C₀/D′具有显著影响的因素，如药物相互作用（保肝药物、胃黏膜保护药物以及活血药物等）、患者术后内环境变化等，这些都可能影响环孢素注射液的体内药动学过程。这也是本研究存在的不足之处。

综上所述，本研究首次研究了基因多态性与环孢素注射液血药浓度的相关性并发现只有CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液C₀/D′呈显著相关，而其他8个SNPs基因多态性对环孢素注射液C₀/D′无影响。但由于目前国内外关于环孢素注射液的相关研究几乎空白，现有参考资料较少，本研究作为初探，其结果仍需进一步进行大样本量的临床验证，对模型进行优化。

参考文献 (17)

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环孢素注射液在肾移植患者中的血药浓度与基因多态性的相关性研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911107

作者简介: 张艳霞，硕士，药师，研究方向：药物基因组学，Email：2463084798@qq.com

通讯作者: 陈泉金，主管药师，研究方向：药物基因组学; 宋洪涛，主任药师，研究方向：药物基因组学，Email：sohoto@vip.163.com

Study on correlation between plasma concentration of cyclosporine injection and gene polymorphism in renal transplant patients

1. 材料

1.1 试剂与设备

1.2 马尾松叶低极性部位的制备

1.3 色谱-质谱条件

2. 方法

2.1 抑菌实验方法

2.2 色谱-质谱分析方法

3. 结果与分析

4. 讨论

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出版历程

环孢素注射液在肾移植患者中的血药浓度与基因多态性的相关性研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201911107

中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院药学科，福建 福州 350025

作者简介: 张艳霞，硕士，药师，研究方向：药物基因组学，Email：2463084798@qq.com

通讯作者: 陈泉金，主管药师，研究方向：药物基因组学; 宋洪涛，主任药师，研究方向：药物基因组学，Email：sohoto@vip.163.com

English Abstract

Study on correlation between plasma concentration of cyclosporine injection and gene polymorphism in renal transplant patients

Department of Pharmacy, No. 900 Hospital of Joint Logistic Support Force of the PLA, Fuzhou 350025, China

全文HTML

1.1. 研究对象

1.2. 全血谷浓度测定

1.3. 基因分型

1.4. 统计分析

2.1. 环孢素注射液的临床疗效分析

2.2. 哈迪-温伯格平衡检验和基因型分布情况

2.3. 基因多态性与环孢素注射液血药浓度的相关性

2.4. 环孢素注射液个体化给药模型的建立

目录

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1.1. 研究对象

1.2. 全血谷浓度测定

1.3. 基因分型

1.4. 统计分析

2.1. 环孢素注射液的临床疗效分析

2.2. 哈迪-温伯格平衡检验和基因型分布情况

2.3. 基因多态性与环孢素注射液血药浓度的相关性

2.4. 环孢素注射液个体化给药模型的建立

作者简介:
张艳霞，硕士，药师，研究方向：药物基因组学，Email：2463084798@qq.com

中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院药学科，福建福州 350025

作者简介:
张艳霞，硕士，药师，研究方向：药物基因组学，Email：2463084798@qq.com