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自2013年起，我国已成为全球糖尿病患者最多的国家，患病人数高达1.2亿，患病率也以远超欧美国家的速度逐年增长[1]。皮肤溃疡是糖尿病常见的并发症之一，也是导致糖尿病患者截肢的首要原因，糖尿病导致的皮肤溃疡住院患者的人数，在我国各种体表难愈性溃疡住院总人数中居首位[2] ，具有高致残率和死亡率的特征，给家庭和社会造成沉重负担。据统计，糖尿病溃疡患者在5年内的病死率是无溃疡糖尿病患者的2.5倍[3] 。因此，积极预防和管理体表慢性溃疡，是降低糖尿病患者致残率和死亡率的首要任务。
糖尿病溃疡形成原因复杂，确切机制仍不清楚，成为阻碍精准医疗和新药研发的重要原因[4] 。西医治疗目前缺乏特效药物，临床上普遍以局部使用生长因子制剂和抗生素为主[5-6] ，价格高昂，但疗效有限，且存在致癌风险和抗生素耐药等副作用。中医药是中华民族的瑰宝，中草药作为中医天然药物资源的重要组成部分，其疗效经长期实践，得到普遍认可，受到国内外研究者的广泛关注。与合成药物不同，中草药一般含有多种活性成分，可以同时作用于多个靶点，产生协同效应。多项研究表明[7-8]，中草药治疗难愈性皮肤溃疡疗效确切，可以显著降低因糖尿病溃疡而导致的截肢风险。因此，在中医愈创理论指导下，积极挖掘中草药中活性成分群，对于丰富现有治疗方案、延长患者寿命、提高患者生存质量具有重要意义。
近年来，多种中草药活性成分对糖尿病溃疡创面愈合的影响已被报道，但缺乏较为系统的评价。故本综述总结了番红花、肉桂、黄芪、地黄等15种中草药的提取物对糖尿病创面愈合作用模式的相关研究（图1），并基于传统中医药理论进行分类讨论，以期为糖尿病溃疡的中草药精准治疗及新药研发提供参考。
图 1 15种中草药促进糖尿病创面愈合的作用机制
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绞股蓝提取物[9]含有豆甾醇、山柰酚和槲皮素等化合物。局部应用在糖尿病小鼠伤口皮肤上可以加速伤口愈合促进血管生成并诱导血管生成素（ANG）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子-β（TGF-β）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达。体外实验证明，绞股蓝提取物可以促进体外伤口愈合并增强在糖尿病条件下培养的人内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和肥大细胞的迁移和/或增殖，分别增加了1倍、3倍、12倍和10倍。
洋甘菊提取物（CT）[10]具有良好的降血糖作用和较强的抗氧化能力。CT灌胃可以显著降低糖尿病小鼠空腹血糖值，改善糖耐量，升高血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）含量，降低丙二醛（MDA）含量。在体外实验发现，1.0 mg/ml的 CT对DPPH和超氧阴离子（O2−）自由基有一定的清除能力，但羟基自由基清除作用不明显，其抗氧化作用可能与其总黄酮成分有关。
岗梅提取物（LCE）[11]促进糖尿病溃疡的愈合，其机制与抗高糖诱导血管内皮细胞损伤、促进溃疡面的血管生成以及胶原合成有关。岗梅提取物药膏外用治疗组与空白对照组比较，可以使糖尿病大鼠胶原合成量增多，创面愈合速度增快，且10%剂量组较5%剂量组创面愈合效果更佳。免疫组化染色的结果显示，10% LCE软膏组血管的内皮细胞膜CD31的阳性表达量明显高于莫匹罗星治疗组。体外对人脐静脉血管内皮（HUVECs）细胞实验[12]显示，经50～100 mg/L LCE处理HUVECs的VEGF表达明显高于高糖对照组，25～100 mg/L处理的细胞VEGF R1及 VEGF R2基因表达显著高于高糖对照组。
苎麻叶提取物[13]主要存在酚类和黄酮类化合物。与对照组相比，提取物组第7d、第14d的炎症浸润评估，第7d的成纤维细胞定量，第14d、第21d的血管生成量显著增加，对糖尿病大鼠的组织修复和炎症细胞减少明显有效。
地黄提取物（RR）[14]治疗组与空白对照组相比，第4d起开始有显著的VEGF表达，第8d伤口面积出现了显著差异，有更完整的疤痕、更连续的表皮和更多的毛细血管形成。此外，RR提取物还显著缓解了角叉菜胶引起的炎症。
不同浓度蓬子菜溶液[15]在治疗糖尿病大鼠溃疡面过程中，在同一时间点的创面面积均明显小于贝复济治疗组，其中3mg/ml浓度蓬子菜治疗组的创面缩小最为明显，创面愈合修复最好。
毛冬青浸膏[16]外用对糖尿病小鼠溃疡具有较显著的修复作用，其作用可能与上调创面组织中增殖细胞核抗原第八因子相关抗原（FⅧ-RAg）的表达有关，从而促进表皮细胞增殖和新生血管的形成。
慢性难愈性溃疡常伴有多重耐药菌感染，而据报道中药具有逆转抗生素耐药的作用[17]。研究显示[18]番红花叶提取物可以增加耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对甲氧西林的敏感度，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染伤口有显著疗效。番红花叶提取物通过抑制菌落数量，增加多形核（PMN）和单核（MNC）细胞浸润，促进胶原蛋白沉积、成纤维细胞增殖和血管新生，避免急性出血、充血、水肿，减少肉芽组织的成熟时间，增强再上皮化，加速创面愈合，提高创面愈合质量。同时，提取物治疗组的SOD水平显著增高，MDA、羰基蛋白显著降低，提示番红花叶提取物还有抗氧化作用，可以保护组织免受氧化损伤，通过减轻组织应激，为组织愈合提供有利的环境。枸杞叶提取物[19]也显示出类似的功效，此外枸杞叶提取物还可以增加胶原蛋白的交联促进成熟，提高修复过程中细胞和结缔组织在超微结构水平上的适应性，缩短创面愈合时间。
清热解毒药药性多为苦寒。中医认为，苦寒之品，能直折火势，清泻血热。其中，枸杞叶、绞股蓝、岗梅、地黄兼具甘味，故亦有清热滋阴养血之效。现代药理学研究发现，清热解毒单味药物提取成分促愈的主要机制为保护组织避免氧化损伤，并促进表皮、成纤维、血管上皮细胞增殖迁移。
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肉桂提取物[20]中肉桂醛（11.26%）和2-羟基肉桂醛（6.7%）为主要成分。研究表明，肉桂提取物治疗组在伤口形成后第7 d和第14 d表现出较低的水肿评分和较少的炎症细胞浸润，在第7天有更好的血管形成和良好的肉芽组织，K-6染色显示角蛋白的合成显著增加，第14 d观察到完全的上皮再形成。10%浓度的肉桂提取物较5%浓度的治疗效果更显著。肉桂的抗氧化特性被认为是促进伤口愈合的关键因素，伤口产生后第3d和第7d，组织的总抗氧化能力（TAC）增加，MDA水平降低，防止细胞DNA、RNA和蛋白质损伤。此外，肉桂提取物增强了胰岛素样生长因子（IGF-1）、葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）和cyclinD1 mRNA的表达。IGF-1和GLUT-1表达上调，加速葡萄糖转入细胞，并随之加快肉芽形成、重新上皮化和角蛋白的生物合成。cyclinD1通过推进细胞增殖期间的G1期来加速成纤维细胞和上皮细胞增殖，促进细胞迁移和血管生成。
鸡血藤提取物[21]可以促进糖尿病足大鼠溃疡愈合，显著降低C反应蛋白（CRP）、白介素-6（IL-6）及α-肿瘤坏死因子（TNF-α）水平，其促愈机制可能与抗炎作用有关。鸡血藤提取物的促愈合作用还可能与激活基质细胞衍生因子（SDF-1）/趋化因子受体4（CXCR4）轴有关。实验发现鸡血藤提取物可以提升大鼠外周血白细胞数量和骨髓、外周血中骨髓间充质干细胞（BMSCs）数量、造血干细胞（HSCs）数量和创面HSCs数量，促进血清中SDF-1和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的分泌，通过激活SDF-1/CXCR4轴，促进骨髓干细胞增殖、趋化迁移至皮肤创面而实现促进创面修复。体外实验亦证明鸡血藤提取物能够激活SDF-1/CXCR4信号轴，保护氧化损伤BMSCs的增殖活性，提升氧化应激状态下BMSCs的迁移和趋化能力[22]。
温经通络活血药味多辛、苦，性多偏温。辛能散行，苦能通降，温能通畅血行，可使血脉温通，瘀滞消散。研究亦发现肉桂、鸡血藤可以有效减轻炎症反应，降低血糖，促进血管生成，激发干细胞迁移，进而促进糖尿病溃疡愈合。
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黄芪注射液可以通过缩短细胞倍增时间、降低G1期阻滞、上调增殖细胞核抗原（PCNA）及细胞周期检查点控制基因 P21WAF1 mRNA的表达，使变大的细胞体积逐渐缩小，扁平的细胞形态逐步恢复成梭形、放射状、旋涡状走形，帮助溃疡面成纤维细胞恢复至正常形态并促进细胞增殖[23]；上调成纤维细胞透明质酸合成酶的浓度，从而增加伤口透明质酸的浓度[24]；增加成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成和分泌量[25]，改善伤口愈合条件。研究还发现，黄芪注射液的促愈作用可能与活化Wnt/β-catenin信号通路有关，通过上调Wnt1、Wnt3a、β-catenin的表达，启动通路下游靶基因C-myc、CyclinD1的转录，提高C-myc、CyclinD1的表达，调节Wnt/β-catenin信号通路，而起到促进创面肉芽组织增生，促进表皮干细胞的增殖分化，加快创面上皮化的进程的作用[26]。另有临床血检发现，使用黄芪注射液的患者炎症细胞因子TNF-α、IL-6、白介素-8（IL-8）、超敏C反应蛋白（hs-CRP），氧化应激反应相关因子隐性氧化蛋白产物（AOPP）、MDA明显低于空白对照组，而GSH-PX水平明显高于空白对照组[27-28]，提示加速炎症因子吸收，抑制氧化应激反应也是APS重要的促愈机制。翁鹤[29]研究发现，黄芪的水提取液可以促进人角质细胞形成细胞（HaCaT）增殖，上调HaCaT细胞NRP-1 mRNA表达水平及NRP-1蛋白表达水平，浓度在5 mg/ml作用最佳。进一步探究黄芪作用成分发现，黄芪提取物中的主要作用成分多糖（APS）可以通过调控表皮干细胞的分化、角质形成细胞和成纤维细胞的增殖、胶原蛋白的合成分泌等方式，促进糖尿病溃疡的愈合。在体外实验中发现，10～160 μg/ml剂量的APS呈量效、时效依赖性地促进糖尿病溃疡成纤维细胞增殖、增加胶原合成，但过高浓度（> 640 μg/ml）会出现抑制作用[30-31]；降低白介素-1β（IL-1β）的浓度和具有水解细胞外基质和基底膜蛋白的基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性及蛋白表达，以减少对成纤维细胞的增殖抑制作用和破坏[32]；降低β-半乳糖苷酶，延缓并抑制成纤维细胞的衰老和凋亡[33] 。
白芷提取物[34]能在2型糖尿病小鼠创面愈合多个时期发挥积极作用，在早期可减轻创面炎症细胞数量，下调创面组织炎症因子 IL-1β，TNF-α 表达，其机制可能与调节细胞因子信号传导抑制分子1（SOCS1）/细胞因子信号传导抑制分子 3（SOCS3）表达，抑制糖尿病小鼠创面巨噬细胞向M1过度极化有关。在增殖阶段，白芷能提高2型糖尿病小鼠创面及体外高糖缺氧下内皮细胞对周细胞的趋化募集作用,促进内皮细胞-周细胞管状结构形成，促进创面血管新生及成熟，其相关机制可能与上调p-AKT促进叉头蛋白叉头转录因子1（FOXO1）磷酸化，抑制FOXO1激活，降低血管生成素-2（Ang-2）表达有关。
黄芪、白芷善消肿排脓，其中黄芪性甘温，温中补气，托毒排脓，消肿生肌，其提取物可帮助溃疡面细胞恢复正常形态、促进增殖、延缓衰老和凋亡，并加速炎症因子吸收，抑制氧化应激反应。白芷辛温解表，消肿排脓，其提取物可以抑制局部创面炎症，趋化募集周细胞至创面，促进创面愈合。
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白及提取物（BSP）[35]外用治疗的糖尿病小鼠溃疡创面愈合加速，巨噬细胞浸润减少，血管生成增加，溃疡区IL-1β和TNF-α含量减少，并能抑制局部NLRP3炎症小体过度活化，提高溃疡区胰岛素敏感性。离体细胞实验结果表明，BSP干预处理可缓解高糖刺激导致的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）内活性氧（ROS）水平上升、NLRP3炎症小体过度活化和IL-1β释放量增多以及心肌微血管内皮细胞（CMECs）活力下降及胞内胰岛素信号传导受损；BMDMs-CMECs共培养实验结果提示BSP干预对两种细胞的上述异常情况均有保护作用，而加入IL-1β可抑制BSP的上述作用。
没食子含有高含量的单宁（50%～70%）以及没食子酸、鞣花酸和丁香酸等化合物。没食子提取物中总酚类化合物含量较高（954.07 mgGAE/100g），接近标准没食子酸（960.85 mgGAE/100g）[36]。没食子提取物外用治疗可显著缩小糖尿病小鼠伤口面积，降低IL-1β、IL-6和TNF-α浓度，降低了MDA浓度并增加了总抗氧化能力[37]，对自由基DPPH和ABTS的抑制率分别为97.40%和98.70%[36]，这可能是通过抑制Set7/NF-κB信号通路[38]。没食子提取物治疗组的肉芽组织发育丰富，含有大量成纤维细胞、胶原蛋白、毛细血管[36]，每平方毫米伤口组织的成纤维细胞分布、胶原沉积、快速上皮再形成增加，且角质形成细胞分化更为规则，并上调VEGF、Bcl-2和p53等相关mRNA的表达[37]，这可能与激活粘着斑激酶（FAK）、c-Jun N 末端激酶（JNK） 和细胞外信号调节激酶 （Erk）在内的几条伤口愈合信号通路来加速细胞迁移有关[39]。临床观察51例糖尿病溃疡患者[40]发现，没食子提物处理的慢性创面愈合迅速，伤口尺寸减少率比对照组高15%，治疗第8周，完全愈合率高达65.38%，而对照组仅为8%，且观察组未发生感染、皮疹、发红、过敏等不良反应。
止血敛疮药药性苦、涩，主燥湿收敛，善止血收湿敛疮。白及、没食子主要通过抑制创面炎症，改善创面愈合环境，进而促进并丰富肉芽组织发育，起到促进愈合的效果，见表1。
表 1 15种中草药提取物促进糖尿病创面愈合的作用机制
作用 中草药 靶点、作用机制 实验水平 给药途径、剂量 清热解毒 绞股蓝 ↑:ANG、EGF、FGF、TGF-β、VEGF 动物（小鼠）
细胞（HUVECs、HaCaT、HF21)0.5% 药膏外用
50、100 μg/ml[9]洋甘菊 ↑:SOD、GSH-PX；
↓:MDA、DPPH、O2-动物（小鼠） 971、485、243 mg/kg灌胃[10] 岗梅 无 动物（大鼠） 5%、10%软膏外用[11] ↑:VEGF、VEGF R1、VEGF R2 细胞（HUVECs） 12.5、25、50、100 mg/L培养[12] 苎麻叶 无 动物（大鼠） 2%粗提物外用[13] 地黄 ↑:VEGF 动物（大鼠） 1.85 g/kg管饲[14] 蓬子菜 无 动物（大鼠） 30、3、0.3 mg/ml制剂外用[15] 毛冬青 ↑:FⅧ-Rag 动物（小鼠） 0.25、0.5、1.0 ml药膏外用[16] 番红花叶 ↑:PMN、MNC、SOD；
↓:MDA动物（大鼠） 2 g/100g药膏外用[18] 枸杞叶 ↑:SOD；
↓:MDA动物（大鼠） 1、2、4 g/100g药膏外用[19] 温经通脉活血 肉桂 ↑:TAC、IGF-1、GLUT-1、cyclinD1 动物（小鼠） 5%、10%软膏外用[20] ↓:MDA 鸡血藤 ↓:CRP、IL-6、TNF-α 动物（大鼠） 2.0、1.0、0.5 g/ml药膏外用[21] ↑:SDF-1/CXCR4 动物（大鼠） 1 ml/100g灌服[22] 消肿排脓 黄芪 ↑:PCNA、P21WAF1 细胞(Fb) 20 g/L培养[23] 无 细胞(Fb) 20 g/L培养[24] ↑:COL-Ⅰ、COL-Ⅲ 细胞(Fb) 20 g/L培养[25] ↑:Wnt1、Wnt3a、β-catenin 动物（大鼠） 0.675 ml、1.39 ml、2.7 ml灌胃[26] ↓:TNF-α、IL-6、IL-8、hs-CRP、AOPP、MDA；
↑:GSH－PX糖尿病溃疡患者 30 ml配以250 ml生理盐水静脉滴注[27, 28] ↑:NRP-1 细胞（HaCaT） 0、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 mg/ml培养[29] 无 细胞(Fb) 10、40、160、640 μg/ml培养[30] 无 细胞(Fb) 10、40、160、640 μg/ml培养[31] ↓:IL-1β、MMP-2、MMP-9 细胞(Fb) 100 mg/L培养[32] ↓:SA-β-Gal 细胞(Fb) 10、40、160、640 μg/ml培养[33] 白芷 ↓:IL-1β，TNF-α、FOXO1、Ang-2、SOCS3
↑:p-AKT、p-FOXO1、SOCS1动物（小鼠） 1.8、3.6、7.2 g/kg·d灌胃[34] 止血敛疮 白及 ↓:IL-1β、TNF-α、NLRP3
↑:ROS动物（小鼠） 50 μL5%制剂外用[35] 没食子 ↓:DPPH、ABTS 动物（大鼠） 30%局部外用[36] ↓:IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA；
↑:VEGF、Bcl-2、p53动物（小鼠） 5%、10%软膏外用[37] ↓:Set7/NF-κB 动物（小鼠） 30%药物制剂局部外用[38] ↑:p-FAK、p-JNK、p-Erk 细胞(HaCaT、MEF、HF21) 10、20、50、100和200 μM培养[39] 无 糖尿病溃疡患者 30%药物制剂局部外用[40] 注：MEF.小鼠胚胎成纤维细胞；HF21.人成纤维细胞；Fb.成纤维细胞；COL-Ⅰ.Ⅰ型胶原蛋白；COL-Ⅲ.Ⅲ型胶原蛋白；“↑”表示增加，“↓”表示减少。 -
糖尿病溃疡具有病机复杂、病程较长等特点，常迁延难愈，并伴随多重耐药菌感染，临床治疗颇为棘手。中医认为，糖尿病溃疡的主要病机为血脉瘀阻，一为肝肾亏虚，阴虚燥热，热盛伤阴致血脉涩滞；二为气血不足，血行无力致血脉瘀阻；三为脾肾阳虚，阳不通，血不行致血脉瘀阻。故而治疗原则应以清热解毒、滋阴养血、温经通络、活血化瘀为主。现代医学认为，伤口愈合主要涉及3个阶段：炎症反应、细胞增殖和组织重塑[41]。近年研究发现，不同的中草药提取物可以调节Set7/NF-κB、Wnt/β-catenin、SDF-1/CXCR4等信号通路，从而减少炎症浸润、逆转抗生素耐药性、促进表皮细胞增殖、恢复原有上皮结构、抑制瘢痕形成（表1）。其中，清热解毒药提取物的作用主要表现为保护组织避免氧化损伤，促进表皮、成纤维、血管上皮细胞增殖迁移；温经通络活血药提取物主要表现为减轻炎症反应、降低血糖、促进血管生成、激发干细胞迁移；消肿排脓药提取物主要表现为抑制局部创面炎症，趋化募集周细胞至创面，帮助溃疡面细胞恢复正常形态、促进增殖、延缓衰老和凋亡；止血敛疮药提取物主要表现为抑制创面炎症，改善创面愈合环境，进而促进并丰富肉芽组织发育。上述研究初步展现出中医药传统概念中清热解毒、温经通络活血、消肿排脓、止血敛疮药物对糖尿病溃疡愈合的不同阶段均有较好的疗效，显示出中草药多靶点的作用优势，富有临床应用前景，但其促进创面愈合的关键环节和作用机制仍有待进一步阐明。同时，中医治疗主张根据病因和症状的不同辨证论治，而现有的糖尿病溃疡模型较为单一，无法体现在不同证型条件下，不同特性中草药的差异、偏颇与优势，有待在将来的研究中进一步设立完善。未来，期待通过更多高质量的临床研究和真实世界数据来客观评价中草药治疗糖尿病溃疡的疗效和安全性。
Advances in the treatment of diabetic ulcers by Chinese herbal extracts
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摘要: 皮肤溃疡是糖尿病最常见的并发症，糖尿病溃疡患者死亡率远高于无溃疡糖尿病患者。近年来，中草药因具有多成分、多靶点、多通路协同的治疗效应而受到广泛关注。临床实践证明，中草药能有效促进糖尿病创面愈合，并展现出良好的安全性。为系统评价中草药对糖尿病溃疡的治疗效应，笔者通过检索文献，回顾和总结了15种中草药提取物促进糖尿病创面愈合的作用机制，并基于传统中医药理论进行分类讨论，以期为糖尿病溃疡的精准治疗及新药研发提供参考。Abstract: Skin ulcers are the most prevalent consequence of diabetes mellitus, and people with diabetic ulcers have a substantially greater death risk than those who do not have ulcers. Herbal medications have gained wide concern in recent years due to their multi-component, multi-target, and multi-pathway synergistic therapeutic effects. Clinical trials have demonstrated the safety and efficacy of herbal treatments in diabetic refractory ulcers. To systematically evaluate the healing effect of herbs on diabetic wounds, a literature search was conducted, the mechanism of action of 15 herbal extracts in promoting diabetic wound healing were reviewed, and the classification based on traditional Chinese medicine theory was discussed, which could provide a reference for the precise treatment and exploitation of herbal medicines for diabetic ulcers.
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Key words:
- Chinese herbal medicine /
- extracts /
- diabetic ulcers /
- mechanism of action
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临床药物研究需要严格、标准、规范的数据管理[1]，众多文献阐述了统计分析前临床试验数据核查的相关问题及改进措施[1-4]，然而，对于统计分析所得数据的核查却鲜有报道。本文以生物等效性（BE）研究为例，介绍统计分析数据核查的要点，包括：试验分组的随机数字表、药代动力学（PK）主要参数以及BE的分析计算数据和结果在相应的软件中是否能够重现、与原统计分析报告是否一致。同时，统计专业人员对核查提出的问题进行敏感性分析，并出具相关报告。
1. 资料与方法
1.1 资料来源
本文所使用的数据来自我部于2019－2021年间所接受的18项BE研究统计分析数据核查的结果，所测试的药物分别为抗病毒、抗菌药物以及治疗心脑血管疾病、糖尿病等疾病的药物。
1.2 统计学方法
1.2.1 采用SAS软件运行得出随机数字表
随机指利用SAS软件中的随机化功能，事先给出种子数，进行随机化分组。该方法简便易行、可重复、符合随机化要求[5]。通过SAS系统的“PROC PLAN SEED=种子数”过程实现两组等比例随机化。例如，将001~010这10个数随机分配为A、B两组，种子数设定为20200506，则生成的结果A组为002、003、006、008和009，B组为001、004、005、007和010。核查时，只要采用试验时设定的种子数，则通过SAS运行得到的A组和B组的数据不变。用同样的随机种子，通过SAS程序运行，能够得出相同的随机表。由此证明研究对象进入试验组和对照组机会均等。
1.2.2 采用WinNonlin软件计算主要PK参数、SAS软件进行BE评价
BE指药学等效制剂或可替换药物在相同的试验条件下，给予相同的剂量，其活性成分吸收速度和程度的差异无统计学意义[6]。BE研究给药后，通过测量不同时间点的生物样本（全血、血浆、血清等）药物浓度，得出药物浓度-时间曲线，经过计算得出血药浓度-时间曲线下面积（AUC）、药物达峰浓度（cmax）、达峰时间（tmax）（图1）等PK参数后，再通过统计学分析比较，判断两种制剂是否生物等效。
目前，BE评价方法是置信区间法。当主要PK参数AUC和cmax的几何均值比值的90%置信区间在80%~125%内时，受试制剂吸收的速度和程度与参比制剂相当，视为生物等效[7]。
核查时，首先需要核对申办方提供的统计分析前的原始数据。统计专业人员向核查人员展示数据传输协议（由申办方提供）；然后，根据原始样本浓度数据，现场使用WinNonlin 8.1软件处理各组血药浓度测定数据，采用非房室模型计算出主要PK参数，包括AUC0-t、AUC0-∞、cmax，其他数据则使用SAS 9.4软件分析。如果受试制剂与参比制剂的AUC0-t、AUC0-∞和cmax几何均数比值的90%置信区间均落在80%~125%范围内，则两种制剂生物等效；否则，两种制剂不存在生物等效。将核查所得结果和结论与原统计分析报告核对，检查一致性。
2. 结果
2.1 一般情况
18项BE研究的分组随机数字表均可重现；18项研究均符合生物等效的判定标准，且BE评价结果与原统计分析报告一致；其中有13项研究的PK参数与原统计分析报告相同，其余5项研究的PK参数则有差异，见“2.2”项。
2.2 问题及处理结果
有12项研究存在个别样本采样时间偏差，其中，2项研究被要求补充敏感性分析，3项研究的分析数据集被要求进行受试者数据的重新纳入或剔除后，也进行了敏感性分析。
上述5项研究敏感性分析的结果显示：PK参数AUC0-t、AUC0-∞和cmax的几何均值比值的90%置信区间虽在数值上有所变化，但仍然在80%~125%范围内，维持原统计分析报告的BE评价。
3. 讨论
3.1 BE研究中随机化和等效性评价的意义
BE试验通常采用随机交叉等试验设计，随机和盲法因其有效控制偏倚而成为BE试验注册和核查的关键内容[8]。由于随机化即随机分配的优点，随机对照试验被广泛认为是评价新的药物、新的医疗器械或新的治疗方法疗效的最佳设计[9]，是评价医学新疗法的金标准[10]。
在过去的二十年里，许多第一代专利药品的专利和上市许可的到期，导致了仿制药的兴起。进行BE研究被认为是确定仿制药与专利药具有相同的有效性和安全性的关键[7]。BE研究在化学药物仿制药的申请、新药评价以及已上市药物的变更申请中，具有不可替代的作用[6, 8, 11]。
3.2 核查发现的问题
3.2.1 采样时间偏差
在药物临床试验方案中，试验期间各个样本采集的时间点有严格规定。由于操作技术、环境及其它因素的影响，可能导致样本采集的时间与计划采样时间有所偏差、且超过了方案允许的偏差范围，这种情况视为超窗[12]。超窗会否影响统计分析的结果，需要通过敏感性分析予以证明。
敏感性分析指通过改变方法、模型、未测量的变量值等考查结果的改变程度，以确定评估方法的稳健性。敏感性分析结果与主要分析结果一致，表明主要分析的结果稳健，反之亦然[13]。对BE研究而言，考查的关键便是生物等效这一评估结果对PK参数的变化是否敏感。
核查发现，有2项BE研究分别存在个别受试者采血时间超窗问题。例如，在某研究中，某受试者计划采血时间为给药后5 min，方案规定的允许偏差范围为30s之内，但实际采血时间为5min32s，即超窗2s。在原统计分析报告中，PK参数按照计划采血时间加2s，即5min2s计算。核查人员要求按照实际采血时间重新计算主要PK参数，即按照5min32s计算，并做敏感性分析，与原统计分析结果进行比较，考查所得结论的一致性。
由此可见，对样本采集的环节进行严格、科学的管理非常重要。另外，无论采样时间是否存在偏差甚至超窗，应尽可能获取所有数据，真实记录采样时间，并做出敏感性分析报告。
3.2.2 受试者数据重新剔除或纳入
临床试验有效性分析应涵盖随机化分组后的所有受试者，而不仅限于实际完成的受试者数据。按照这种意向性治疗原则所做的分析是最好的分析。
BE研究的统计分析集除全分析集（FAS）和安全数据集（SS）外，最主要的数据集为PK参数集（PKPS）和BE集（BES）[14]，BES是推断受试制剂和参比制剂是否生物等效的数据集。
在撰写统计报告时，如果剔除了某受试者数据，或者有受试者出现种种事故但没有被剔除，核查时可能被要求重新纳入或剔除受试者的数据，并进行敏感性分析，以考查是否对最终结果造成影响。例如，某BE试验对照组某受试者第二周期无给药后3.50 h、3.75 h、4.00 h、4.25 h、4.50 h及以后共13个时间段的血药浓度数据，原报告将该受试者纳入PKPS与BES，在核查时，将该受试者第二周期剔除PKPS与BES；或者，原报告将类似受试者剔除PKPS与BES，核查时又将该受试者重新纳入PKPS与BES。
需要注意的是，BE研究通常样本量相对较小，受各种原因数据剔除造成数据缺失的影响相对较大，可能对BE统计分析结果的稳健性带来挑战。因此，BE研究须严格质量管理，事先没有规定的不做剔除处理[11]。
4. 结论
统计分析数据是临床研究结果的呈现，是撰写统计分析报告和临床研究报告的依据。为确保临床研究最终结果和结论没有争议，国家药品监督管理局核查中心对药物临床研究的统计分析数据进行核查非常必要。
本文从统计学角度介绍了BE研究统计分析数据现场核查的主要内容，并对相关统计方法、核查发现的问题、原因和对策进行逐一分析和讨论。考虑到BE研究通常样本量较小，采样时间出现偏差、剔除或纳入数据可能影响统计结果的稳健性，因此，敏感性分析在BE研究中尤为重要，用于评估主要分析结果和结论的稳健性。敏感性分析和主要分析结果一致，则补充、巩固和加强研究结论，进一步证实试验药物的有效性和安全性[15-17]。本文建议，BE研究在统计分析计划的制定与统计分析报告的撰写中，对核查的内容、可能涉及敏感性分析的相关问题，特别是敏感性数据集PKPS和BES的调整，应予以充分考虑，以便在数据分析阶段采用多种敏感性分析方法，综合考虑结果的稳健性，为评估不同制剂临床治疗的可替换性提供扎实的研究数据。
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表 1 15种中草药提取物促进糖尿病创面愈合的作用机制
作用 中草药 靶点、作用机制 实验水平 给药途径、剂量 清热解毒 绞股蓝 ↑:ANG、EGF、FGF、TGF-β、VEGF 动物（小鼠）
细胞（HUVECs、HaCaT、HF21)0.5% 药膏外用
50、100 μg/ml[9]洋甘菊 ↑:SOD、GSH-PX；
↓:MDA、DPPH、O2-动物（小鼠） 971、485、243 mg/kg灌胃[10] 岗梅 无 动物（大鼠） 5%、10%软膏外用[11] ↑:VEGF、VEGF R1、VEGF R2 细胞（HUVECs） 12.5、25、50、100 mg/L培养[12] 苎麻叶 无 动物（大鼠） 2%粗提物外用[13] 地黄 ↑:VEGF 动物（大鼠） 1.85 g/kg管饲[14] 蓬子菜 无 动物（大鼠） 30、3、0.3 mg/ml制剂外用[15] 毛冬青 ↑:FⅧ-Rag 动物（小鼠） 0.25、0.5、1.0 ml药膏外用[16] 番红花叶 ↑:PMN、MNC、SOD；
↓:MDA动物（大鼠） 2 g/100g药膏外用[18] 枸杞叶 ↑:SOD；
↓:MDA动物（大鼠） 1、2、4 g/100g药膏外用[19] 温经通脉活血 肉桂 ↑:TAC、IGF-1、GLUT-1、cyclinD1 动物（小鼠） 5%、10%软膏外用[20] ↓:MDA 鸡血藤 ↓:CRP、IL-6、TNF-α 动物（大鼠） 2.0、1.0、0.5 g/ml药膏外用[21] ↑:SDF-1/CXCR4 动物（大鼠） 1 ml/100g灌服[22] 消肿排脓 黄芪 ↑:PCNA、P21WAF1 细胞(Fb) 20 g/L培养[23] 无 细胞(Fb) 20 g/L培养[24] ↑:COL-Ⅰ、COL-Ⅲ 细胞(Fb) 20 g/L培养[25] ↑:Wnt1、Wnt3a、β-catenin 动物（大鼠） 0.675 ml、1.39 ml、2.7 ml灌胃[26] ↓:TNF-α、IL-6、IL-8、hs-CRP、AOPP、MDA；
↑:GSH－PX糖尿病溃疡患者 30 ml配以250 ml生理盐水静脉滴注[27, 28] ↑:NRP-1 细胞（HaCaT） 0、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 mg/ml培养[29] 无 细胞(Fb) 10、40、160、640 μg/ml培养[30] 无 细胞(Fb) 10、40、160、640 μg/ml培养[31] ↓:IL-1β、MMP-2、MMP-9 细胞(Fb) 100 mg/L培养[32] ↓:SA-β-Gal 细胞(Fb) 10、40、160、640 μg/ml培养[33] 白芷 ↓:IL-1β，TNF-α、FOXO1、Ang-2、SOCS3
↑:p-AKT、p-FOXO1、SOCS1动物（小鼠） 1.8、3.6、7.2 g/kg·d灌胃[34] 止血敛疮 白及 ↓:IL-1β、TNF-α、NLRP3
↑:ROS动物（小鼠） 50 μL5%制剂外用[35] 没食子 ↓:DPPH、ABTS 动物（大鼠） 30%局部外用[36] ↓:IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA；
↑:VEGF、Bcl-2、p53动物（小鼠） 5%、10%软膏外用[37] ↓:Set7/NF-κB 动物（小鼠） 30%药物制剂局部外用[38] ↑:p-FAK、p-JNK、p-Erk 细胞(HaCaT、MEF、HF21) 10、20、50、100和200 μM培养[39] 无 糖尿病溃疡患者 30%药物制剂局部外用[40] 注：MEF.小鼠胚胎成纤维细胞；HF21.人成纤维细胞；Fb.成纤维细胞；COL-Ⅰ.Ⅰ型胶原蛋白；COL-Ⅲ.Ⅲ型胶原蛋白；“↑”表示增加，“↓”表示减少。 
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